Онтогенез, 2022, T. 53, № 3, стр. 224-227

ВВЕДЕНИЕ

Ксенотрансплантация кожи человека делает возможным изучение процессов регенерации в норме, при моделировании заболеваний или тестировании лекарственных препаратов. В работе была использована ранее разработанная нашим коллективом модель ксенотрансплантации полнослойного кожного лоскута человека (Kalabusheva et al., 2020). Подобный ксенотрансплантат позволяет изучать не только регенерацию эпидермиса, которая подробно рассмотрена в ранее опубликованных работах (например, Kappes et al., 2004), но и исследовать динамику восстановления дермы и подкожной жировой клетчатки, а также морфологию волосяных фолликулов, которые ранее изучались преимущественно на клетках и тканях лабораторных животных (например, Chermnykh et al., 2018; Vsevolodov et al., 2021). Отдельной областью интереса в нашем исследовании было изучение активации сигналинга YAP1 в различных структурах кожи человека в ходе регенерации. Повышенный процент клеток с ядерной локализацией YAP1 коррелирует с гиперпролиферативным и воспалительным фенотипом (Jia et al., 2018), в то же время снижение его экспрессии связывают с хроническими незаживающими ранами (Yu et al., 2017). Применение модели ксенотрансплантации полнослойного лоскута кожи человека позволит исследовать экспрессию и активность YAP1 как в эпидермисе и ВФ, так и в различных слоях дермы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биоптаты кожи волосистой части головы были получены из МНИОИ им. П.А. Герцена с информированного согласия пациентов. Полнослойные кожные лоскуты трансплантировали мышам линии NOD/SCID (Charles River Laboratories); всего в работе использовали 15 животных, мышей содержали в SPF-условиях. Операции проводили по ранее разработанному и описанному в нашей лаборатории протоколу (Kalabusheva et al., 2020). Забор материала проводили на 40, 75 и 110 сут после трансплантации для получения криосрезов. Криосрезы использовали для окрашивания гематоксилин-эозином (BioVitrum), а также иммуногистохимического окрашивания (используемые антитела: cytokeratin 14, ab181595, Abcam, 1 : 1000; keratin 10, MA1-06319, Thermofisher, 1 : 200; YAP1, ab52771, Abcam, 1 : 300, Human Nuclei, MAB1281A4, Merck, 1 : 100). Фотографии получали на микроскопе Keyence BZ-9000 и Leica DMI 6000. Измерения проводили с использованием программного обеспечения ImageJ и Cell Profiler. Для проведения попарных сравнений в программе GraphPad Prism использовали непараметрический критерий Краскела–Уоллиса с поправкой Данна на множественные сравнения. Данные на графиках представлены в виде медианы с разбросом в виде 95% доверительного интервала.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Трансплантат успешно интегрируется в ткани мыши, сохраняются эпидермис, дерма и подкожная жировая клетчатка кожи человека (рис. 1а–1г).

Рис. 1.

Морфология кожи человека после ксенотрансплантации на 40 (а), 75 (б) и 110 (в) сут (скобками отмечены границы трансплантата), (г) – интактная кожа, стрелками отмечены ВФ, масштабный отрезок – 500 мкм. (д–з) – увеличенные фрагменты препаратов (а–г) соответственно, масштабный отрезок – 500 мкм. (и–м) – окрашивание на Кератин 10 (красный), Кератин 14 (синий), Human Nuclei (зеленый), масштабный отрезок – 100 мкм. (н–п) – измерение морфологических параметров трансплантированной кожи, ** – p < 0.01, **** – p < 0.0001 относительно интактной кожи. (р–с) – YAP1 в эпидермисе и ПД человека. Стрелками отмечены примеры YAP1-положительных ядер. Масштабный отрезок – 100 мкм.

Эпидермис в ксенотрансплантате утолщен (рис. 1д–1з), особенно в течение первого месяца после трансплантации. Хотя его толщина значительно уменьшается от 40 сут к 110-м, она не достигает толщины эпидермиса интактной кожи (рис. 1н). Такая тенденция наблюдается как при измерении его общей толщины, так и при анализе базального и шиповатого слоев на основе иммуногистохимического выявления кератина 10 и 14 (рис. 1и–1м). Низкая скорость регенерации эпидермиса может быть обусловлена нарушением микроокружения, в норме формируемого иммунными клетками.

ВФ на 40 сут находятся на стадии раннего анагена, на 110 сут они продуцируют стержни волоса и морфологически соответствуют стадии среднего анагена. Регенерация фолликулов несколько замедленна в сравнении с моделью трансплантации единичных ВФ (Oh et al., 2016), что объясняется большим размером трансплантата в нашей работе.

Дерма на 40 сут теряет морфологическое разделение на папиллярный и ретикулярный слои, содержит воспалительный инфильтрат (рис. 1а). Папиллярный слой выявляется на 75 сут, к 110 сут морфология дермы полностью соответствует интактной коже (рис. 1в, 1г, 1о). В исследованиях на мышах показали, что фибробласты ретикулярной дермы формируют пул миофибробластов на ранних этапах регенерации, далее фибробласты ПД мигрируют в область повреждения, взаимодействуют с эпидермальными кератиноцитами и контролируют ремоделиривание внеклеточного матрикса (Woodley, 2017), что соответствует динамике восстановления дермы человека, выявленной в нашей работе.

Исследования, проведенные на лабораторных животных, выявили вовлеченность клеток жировой ткани в миграцию фибробластов в область повреждения (Schmidt et al., 2013), а также в регуляцию цикла ВФ (Rivera-Gonzalez et al., 2014). В ксенотрансплантате размер адипоцитов подкожной жировой клетчатки меньше значений, полученных для интактной кожи. В области, прилежащей к ВФ, наблюдается выраженная тенденция к уменьшению размера адипоцитов от 40 суток к 110 (рис. 1п). Аналогичные изменения наблюдали на мышах при переходе от стадии цикла ВФ от раннего анагена к среднему (Rivera-Gonzalez et al., 2014), что воспроизводится в нашей модели. В интактной коже фолликулы находятся на стадии позднего анагена, поэтому адипоциты обладают большим размером.

Экспрессию YAP1 выявили на всех анализируемых сроках в эпидермисе, дерме и ВФ. В фолликулах он имел выраженную активную ядерную локализацию во внешнем корневом влагалище независимо от стадии цикла, что соответствует ранее опубликованным результатам (Elbediwy et al., 2016). В эпидермисе и ПД ядерная локализация YAP1 встречалась в единичных клетках на 40 и 75 сут после трансплантации (рис. 1р, 1с). В ходе регенерации при эпителизации раны YAP1 имеет преимущественно ядерную локализацию в эпидермисе. Поскольку наша модель не имеет оформленного раневого ложа, мы наблюдаем единичные клетки в эпидермисе, однако повышенную экспрессию YAP1 в ПД на 40 сут (рис. 1р). На 110 сут кератиноциты базального слоя эпидермиса имеют активную форму YAP1 с ядерной локализацией, в то время как папиллярные фибробласты обладают только неактивной формой с цитоплазматической локализацией. Интересно, что подобный паттерн распределения встречается именно на поздних сроках регенерации, и его появление вероятно коррелирует с завершением стадии ремоделинга ксенотрансплантата и активацией резидентных иммунных клеток человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы была описана динамика восстановления эпидермиса, дермы, подкожной жировой клетчатки человека в ксенотрансплантате в течение длительного срока – 110 сут. Выявлено, что динамика восстановления дермы и подкожной жировой клетчатки соответствует процессам, описанным ранее на лабораторных животных. Выявленный паттерн экспрессии и активности YAP1 указывает на значительные отличия ксенотрансплантированной кожи от интактной, что следует исследовать в дальнейшем в контексте иммунного статуса ксенотрансплантированной кожи.