Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2021, № 10, стр. 23-27

ВВЕДЕНИЕ

ДНК-связывающие гистоноподобные белки бактерий (HU-белки) относятся к семейству белков, ассоциированных с нуклеоидом (NAP – nucleoid-associated protein); они участвуют в поддержании суперскрученности и компактизации геномной ДНК прокариотической клетки, а также в регуляции основных ДНК-зависимых процессов [1] и поддержании транскриптомного и протеомного профиля бактериальной клетки [2]. Гены HU-белков найдены во всех известных на сегодня бактериальных геномах [3]. В подавляющем большинстве бактерий HU-белки представляют собой гомодимеры размером около 20 кДа, состоящие из относительно стабильного альфа-спирального домена и ДНК-связывающего домена, подвижного в отсутствие ДНК [4, 5]. HU-белки критически важны для жизнедеятельности микроорганизмов класса Mollicutes [6], а также ряда других болезнетворных бактерий [7] и, соответственно, являются перспективными мишенями для разработки антибактериальных препаратов [8–12].

На настоящий момент найдены низкомолекулярные ингибиторы HU-белков, действующие как на ДНК-связывающий домен [8, 9], так и на альфа-спиральный домен [10–12]. Их мишенью является граница между мономерами в димере, нарушение которого, предположительно, влияет на ДНК-связывающие свойства HU-белка и его способность выполнять свою биологическую функцию.

Целью работы было изучение влияния аминокислотных замен, нарушающих контакты между мономерами в димере HU-белка из микоплазмов Spiroplasma melliferum (HUSpm), на конформационную динамику молекулы. Было исследовано поведение одиночных и множественных мутантов HUSpm в процессе полноатомной молекулярно-динамической симуляции продолжительностью 50 нс. Полученные данные показали, что нарушения границы между мономерами в димере приводит к увеличению подвижности молекулы в области ДНК-связывающего домена. Аналогичное изменение конформационной динамики наблюдалось при моделировании связывания бисфенольных производных флуорена с альфа-спиральным доменом HUSpm [10].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выбор аминокислотных остатков для мутагенеза

В подавляющем большинстве бактерий HU-белки функционируют в виде гомодимеров, которые состоят из стабильного α-спирального (димеризационного) домена и более подвижного β-ленточного ДНК-связывающего домена (рис. 1а, 1б). В ДНК-связывающем домене можно выделить седлообразную ДНК-связывающую платформу (β-слои 2, 3 и 6, и α-спираль 3) и подвижные в отсутствие ДНК “руки”, состоящие из β-слоев 4 и 5 и примыкающих к ним петель. Все α-спирали и петля между β-слоями 2 и 3 участвуют в формировании межмолекулярных контактов [4, 5]. Анализ границы между мономерами в димере HUSpm, проведенный в [13, 14], выявил в нем два центра межмолекулярных стэкинг-взаимодействий между боковыми радикалами остатков фенилаланина. Один центр формируется между петлей, соединяющей β-слои 2 и 3, и α-спиралями 2 и 3, второй – между С-концевой частью α-спирали 1 и N-концевой частью α-спирали 2 [13] (рис. 1в). Эти центры вносят основной вклад в стабилизацию димеров HU-белков: один известен как сигнал димеризации [15], аминокислотные остатки другого являются структурными детерминантами термостабильности HUSpm [4]. Поэтому для изучения влияния нарушения границы между мономерами в димере на конформационную динамику ДНК-связывающего домена были проведены единичные и множественные замены аминокислотных остатков (в первую очередь остатков фенилаланина), формирующих центры стэкинг-взаимодействий HUSpm: F49A, F52A + F81A и F29A, F29A + F14A + V17T, а также замена K35T, нарушающая межмолекулярную водородную связь K35-G48 и усиливающая чувствительность HUSpm к бисфенольным производным флуорена [10].

Рис. 1.

Пространственная структура мономера и димера HUSpm: а – элементы вторичной структуры (показаны на мономере HUSpm); б – доменная организация белка (показана на димере HUSpm); в – два ароматических центра стэкинг-взаимодействий, расположенные на границе между мономерами в димере HU-белка. Аминокислотные остатки, выбранные для мутагенеза, подписаны на одном мономере.

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАНТНЫХ БЕЛКОВ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ

Модели мутантных белков были получены на основе кристаллической структуры HUSpm (PDB ID 5L8Z [16]) c помощью интерактивной графической программы COOT [17]. Для проведения молекулярно-динамических расчетов использовали программный пакет GROMACS [18]. В качестве силового поля было выбрано поле OPLS. Комплексы были помещены в кубическую ячейку, заполненную водой с добавлением ионов в количестве, необходимом для того, чтобы суммарный заряд систем оставался нулевым. В качестве модели молекулы воды была выбрана TIP3P. На первом этапе молекулярно-динамического эксперимента была проведена минимизация энергии комплекса для релаксации любых возможных искажений. Затем на подвижность атомов системы были наложены ограничения, и при помощи моделирования системы в баростате и термостате были установлены температура 300 К и давление 1 атм. После снятия всех ограничений был проведен молекулярно-динамический эксперимент, параметры которого представлены в табл. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Был проведен сравнительный анализ флуктуаций Сα-атомов основной цепи, наблюдаемых при молекулярно-динамических симуляциях в течение 50 нс HUSpm дикого типа, и мутантных вариантов белка, в которых аминокислотные замены приводили к нарушениям межмолекулярных взаимодействий в области границы между мономерами в димере (рис. 2). Мутациям подвергались аминокислотные остатки, играющие ключевую роль в стабилизации димера HUSpm [4, 13] (рис. 1в). Одна из исследуемых мутаций также усиливала ингибирующий эффект бисфенольных производных флуорена на ДНК-связывающую способность HUSpm [10].

Рис. 2.

Среднеквадратичная флуктуация (СКФ) Сα-атомов в течение 50 нс симуляции методом молекулярной динамики, вычисленная для свободного HUSpm дикого типа (серые столбики), и HUSpm с заменами аминокислотных остатков, формирующих два центра стекинг-взаимодействий на границе между мономерами в димере HUSpm (рис. 1в): а – мутация F29A (сплошная линия), F29A + F14A + V17T (пунктир); б – мутации F49A (штриховая линия), F52A + F81A (сплошная линия), K35T (пунктир). Вторичная структура HUSpm [13] показана сверху.

Рис. 2 иллюстрирует конформационную динамику HUSpm дикого типа, характерной особенностью которой является значительная подвижность β-ленточных рук ДНК-связывающего домена в отсутствие ДНК. Именно такое поведение HU-белков в растворе наблюдается при их исследованиях с помощью ЯМР-спектроскопии [5, 13]. Аланиновые замены остатков фенилаланина, образующих ароматические кластеры стэкинг-взаимодействий в α-спиральном домене и в области перехода α-спиралей в β-складчатую укладку, приводили к дополнительному усилению подвижности ДНК-связывающего домена, включая не только β-ленточные руки (β-слои 4 и 5 и петля между), но и относительно стабильную седловидную основу (β-слои 3 и 6), которая обеспечивают адаптацию ДНК-связывающего домена при переходе белка из свободного состояния в конформацию захвата ДНК, что, как полагают, обеспечивает высокую прочность ДНК-белковых комплексов, имеющих константы диссоциации в наномолярных областях [10]. Такой же эффект наблюдался при замене K35T, приводящей к нарушению межмолекулярного полярного контакта между сигналом димеризации (петля между β-слоями 2 и 3) одного мономера и С-концевой областью α-спирали 2 второго мономера. Данные результаты коррелируют с результатами молекулярно-динамических исследований комплексов HUSpm c ингибиторами, мишенями которых является граница между мономерами в димере: в [10, 12] показано, что нарушение межмолекулярных контактов, вызванное связыванием ингибитора, приводит к увеличению подвижности ДНК-связывающего домена. Таким образом, полученные результаты подтверждают постулат о том, что, воздействуя на границу между мономерами в димере, можно контролировать ДНК-связывающие свойства HU-белков и, как следствие, подавлять их биологические функции.