Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 1, стр. 51-55

В настоящее время самым дешевым и перспективным источником сырья для синтеза фармацевтических стероидов являются фитостерины (ФС). В предыдущей работе [1] был разработан эффективный метод выделения и очистки ФС из побочного продукта производства соевого масла. Также предложены оригинальные способы расщепления боковой цепи стеринов до 17-кетоандростанов: андрост-4-ен-3,17-диона (АД), андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД) и 9α-гидрокси-АД (9α-ОН-АД), которые представляют собой ключевые интермедиаты для получения практически всех стероидных лекарственных препаратов [2–10]. Так, АДД считается идеальным промежуточным продуктом для синтеза эстрогенов, анаболиков и гестагенов 19-норстероидного ряда, АД – синтеза половых гормонов (андрогенов и прегнановых гестагенов) [11–14], а 9α-ОН-АД – наиболее удобным полупродуктом для промышленного получения фторированных кортикоидов нового поколения на основе модифицированной стероидной молекулы, содержащей атомы фтора при С9, С6 и в диоксиацетоновой цепи, таких как триамцинолон, дексаметазон, бетаметазон, флуоцинолон, мометазон и флутиказон с высокой противовоспалительной, антиаллергической, иммунодепрессивной и противошоковой активностью при минимальных побочных эффектах [15–18]. Использование в качестве ключевого полупродукта 9α-ОН-АД обеспечивает наиболее короткий и простой способ получения фторированных аналогов стероидов, так как позволяет за счет легко осуществимой дегидратации 9α-ОН-группы исключить из технологического процесса трудоемкую и неэкономичную стадию микробиологического 11-гидроксилирования.

В настоящее время 9α-ОН-АД получают из стеринов животного и растительного происхождения двумя способами. Первый способ включает двухстадийный процесс получения АД из стеринов методом микробиологической трансформации бактериями рода Mycobacterium [19–21], а затем образовавшийся AД 9α-гидроксилируют бактериальными культурами [4, 7, 8, 20, 22]. Второй – трансформацию стеринов до 9α-ОН-АД мутантными штаммами микроорганизмов с блокированным синтезом 1,2-дегидрогеназы [23–25]. Таким образом, для получения 9α-ОН-АД можно последовательно подвергать стероидную молекулу действию различных микроорганизмов и выделять промежуточные продукты, или изменять эту молекулу последовательной трансформацией микроорганизмами, минуя стадию выделения [26], или проводить процесс со смешанными культурами микроорганизмов. Для последних двух случаев необходимо, чтобы применяемые микроорганизмы-трансформаторы не были антагонистами [27, 28].

Впервые в стероидном синтезе смесь двух микроорганизмов была применена в 1939 г. [27]. При трансформации АД культурами Bacillus putrificus и Saccharomyces cerevisiae восстанавливались обе кетогруппы и двойная связь с образованием 5α-андростан-3β,17β-диола [27]. Действие на АД бактерии Corynebacterium equi и Trichomonas foetis позволяет в одну стадию ввести Δ¹-связь и восстановить 17-кетогруппу до 1,2-дегидротестостерона. Также 1,2-дегидротестостерон образовывался (c выходом 60%) при трансформации АД смешанными культурами Fusarium lateritium и Saccharomyces cerevisiae [27]. При трансформации 9α-фторгидрокортизона в Δ¹-дегидро-16α-гидрокси-фторгидрокортизон (триамцинолон) использовали метод трансформации со смешанными культурами Arthrobacter simplex и Streptomyces roseochromogenus. Бактериальная культура A. simplex осуществляла реакцию 1,2-дегидрирования, а грибная культура S. roseochromogenus – 16α-гидроксилирования [28].

Проведение микробиологических трансформаций стероидов с использованием смешанных культур позволяет упростить и снизить стоимость технологического процесса, поскольку при этом осутствуют дополнительные стадии выделения и очистки полупродуктов.

Цель работы – усовершенствование метода получения 9α-OH-АД из ФС для использования в промышленном производстве фторированных кортикостероидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В предыдущей работе [7] был описан разработанный и усовершенствованный метод получения 9α-ОН-АД из ФС при совместном культивировании актинобактерий М. neoaurum и R. erythropolis, при котором трансформация ФС до 9α-ОН-АД смешанными культурами проводилась в две последовательные стадии без выделения из культуральной жидкости образовавшегося на первой стадии АД.

Использование метода смешанных культур позволил упростить и удешевить технологию получения стероидных веществ. Однако, АД, накапливающийся на первом этапе после расщепления боковой цепи ФС с повышенной нагрузкой (30 г/л или выше) в виде крупных кристаллов (рис. 1), многократно превышающих размером бактериальные клетки, становился труднодоступным для дальнейшей трансформации до 9α‑ОН-АД.

Рис. 1.

Кристаллы АД в культуральной жидкости M. neoaurum.

Для решения этой проблемы в процессе трансформации ФС использовали метил-β-циклодекстрин (МЦД) в весовом соотношении 1 : 5, который образовывал водорастворимый комплекс включения с АД, образующимся при расщеплении стерина, и далее АД трансформировался в 9α-ОН-АД (рис. 2) [7].

Рис. 2.

Схема получения 9α-ОН-АД из ФС с использованием МЦД и без него.

Однако МЦД является дорогостоящим и трудно регинерируемым реагентом, поэтому в дальнейшем были предприняты попытки получить аналогичные по выходу результаты без использования МЦД при такой же нагрузке субстрата.

Для предотвращения процесса укрупнения образующихся кристаллов АД, в значительной степени зависящего от концентрации стероида, 9α‑гидроксилирующую культуру R. еrythropolis вносили на 70 ч трансформации, что соответствовало экспоненциальной фазе роста культуры М. neoaurum и процессу интенсивного накапливания АД (рис. 3а). При достижении его концентрации выше 10 г/л в культуральной жидкости образовывались кристаллические структуры (рис. 1), недоступные для дальнейшего введения гидроксильной группы в 9α-положение стероидной молекулы, катализируемого культурой R. еrythropolis.

Рис. 3.

Динамика накопления АД и потребления глюкозы при трансформации 30 г/л ФС культурой М. neoaurum.

Для интенсификации микробиологических трансформаций применяли дробное внесение инокулята и раствора глюкозы. Как видно на рис. 3б, после 48 и 96 ч проведения процесса биоконверсии запас глюкозы оказывался полностью исчерпанным, поэтому в стерильных условиях вносили растворы глюкозы в количестве 1.5 об.% и инокулята M. neoaurum – 10 об.%.

Таким образом, добавление на 70 ч трансформации бактерии R. erythropolis способствовало тому, что образующийся АД сразу гидроксилировался до 9α-ОН-АД. Время трансформации при нагрузке ФС 30 г/л в отсутствии солюбилизатора составило 168 ч, а выход 9α-ОН-АД – 64–65%.

Помимо снижения стоимости процесса за счeт проведения его без дорогостоящего МЦД, к преимуществу данного метода можно отнести его высокую селективность без образования побочных продуктов, а образующееся в качестве побочного продукта незначительное количество тестостерона гидроксилировалось культурой R. erythropolis с образованием также 9α-ОН-АД [8].

Таким образом, удалось разработать эффективный способ трансформации ФС до 9α-ОН-АД с использованием метода смешанных культур актинобактерий М. neoaurum и R. erythropolis при высоких нагрузках стероидного субстрата.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН “Разработка новых биотехнологических методов получения высокоактивных фторированных кортикостероидов противоспалительного и антиаллергического действия по совмещенной схеме из фитостеринов через 9α‑гидрокси-АД с использованием в процессе биотрансформации вновь созданных иммобилизованных биокатализаторов” (проект № 1201371077).