Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 2, стр. 199-208

МЕТОДИКА

Реактивы и материалы. Для выращивания и выделения микроорганизмов активного ила использовали триптон (“Panreac”, Испания), дрожжевой экстракт (“Helicon”, Россия), хлорид натрия (“Диаэм”, Россия) и агар-агар (“Panreac”, Испания). Для создания рабочего угольно-пастового электрода применяли графитовую пудру (“Fluka”, Германия), парафиновое масло (“Fluka”, Германия) и диализную мембрану с пределом пропускания 14 кДа (“Roth”, Германия).

В качестве медиаторов электронного транспорта использовали ферроцен (“Aldrich”, Германия), 1,1'-диметилферроцен (“Aldrich”, Германия), ферроценкарбоксальдегид (“Aldrich”, Германия), ферроценацетонитрил (“Aldrich”, Германия), нейтральный красный (“Диаэм”, Россия), 2,6-дихлорфенолиндофенол (“Диаэм”, Россия), тионин (“Диаэм”, Россия), метиленовый синий (“Диаэм”, Россия) и гексацианоферрат(III) калия (“Диаэм”, Россия).

Выделение клеток микроорганизмов активного ила. Активный ил был предоставлен очистными сооружениями ТулаГорВодоканал (Россия). Микроорганизмы выращивали на среде Луриа–Бертани (LB), содержащей (%): триптон – 1.0, дрожжевой экстракт – 0.5, NaCl – 1.0 и агар-агар – 2. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием в течение 45 мин при давлении в 1 атм и 121°C, а затем разливали в чашки Петри. Дальнейшее выделение отдельных колоний проводили по методу Р. Коха.

Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки выращивали аэробно на среде LB в течение 18–20 ч в качалочных колбах на 750 мл при 29°С. Полученную биомассу отделяли центрифугированием 10 мин при 6000 g при комнатной температуре. Осадок промывали 20 мМ фосфатным буфером, рН 6.8. Осевшие клетки переносили в свежие порции буфера, разделяли на порции и осаждали на центрифуге “Eppendorf” в течение 5 мин при 6000 g. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при − 25°С.

Идентификация выделенных клеток микроорганизмов Выделение и очистку ДНК проводили по методу Уилсона [17] с модификациями. Осажденную биомассу ресуспендировали в 280 мкл 10 мМ трис-HCl буфера, рH 8.0, содержащего 1 мМ ЭДТА (ТЕ буфер), и обрабатывали при 37^○С последовательно в течение 1.5 ч 7 мкл 20%-ного раствора ДДС-Na, 1 ч – 1.5 мкл раствора РНКазы А (10 мг/мл), 1 ч – 6 мкл раствора протеиназы ПроК (“UniProt, США, 10 мг/мл), а затем в течение 15 мин при 55^○С – 22 мкл 20%-ного раствора ДДС-Na, и 30 мин при 65^○С 44 мкл 5 М хлорида натрия и 36 мкл гексадецилтриметиламмоний бромида. ДНК экстрагировали 400 мкл смеси фенол–хлороформ (1 : 1) и центрифугировали при 14 500 g в течение 10 мин. Водную фазу отбирали, экстрагировали равным объемом хлороформа и центрифугировали в тех же условиях. Водную фазу снова отбирали и добавляли 0.6 об. изопропилового спирта. Осадок промывали два раза 70%-ным этанолом в течение 1 ч, затем промывали один раз 96%-ным этанолом в течение 5–10 мин. Полученную ДНК высушивали на воздухе 20 мин. Затем ДНК перерастворяли в 20 мкл деионизированной воды и хранили при −20^○С.

Для амплификации фрагментов генов 16S рРНК использовали универсальные бактериальные праймеры 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1525r (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer (“Applied Biosystems”, США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Уровни сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК (в %) между изученными и типовыми штаммами близких видов определяли с помощью алгоритмов, представленных на сайте EzBioCloud [19]. Полученные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК депонированы в международные базы данных DDBJ/ENA/GenBank под номерами MG280783 (Paracoccus yeei SPB1), MG280784 (Pseudomonas veronii SPB2) и MG280785 (Bacillus proteolyticus SPB3).

Формирование рабочего электрода. Рабочий электрод формировали по методике, описанной в работе [8], наполняя приготовленной пастой (“графитовая пудра-минеральное масло”) пластиковую трубку площадью 6.3 мм². Электроды на основе малорастворимых медиаторов (ферроцена, 1,1'-диметилферроцена, ферроценкарбоксальдегида и ферроценацетонитрила) формировали следующим образом. Графитовую пудру (100 мг) смешивали с 1%-ным раствором медиатора в ацетоне в количестве, необходимым для получения требуемой концентрации медиатора в графитовой пасте. После испарения ацетона добавляли 40 мкл парафинового масла и замешивали пасту. Такой модифицированной пастой заполняли пластиковую трубку измерительного электрода. Для формирования электродов на основе растворимых медиаторов (тионин, нейтральный красный, метиленовый синий, 2,6-дихлорфенолиндофенол и гексацианоферрат(III) калия) готовили немодифицированную пасту (100 мг графитовой пудры смешивали с 40 мкл парафинового масла) и также заполняли пластиковую трубку измерительного электрода.

Клетки микроорганизмов, выделенных из активного ила, иммобилизовали на поверхности электрода следующим образом. На рабочую поверхность электрода наносили 3 мкл суспензии с содержанием клеток 200 мг сырой биомассы/мл и подсушивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Для удерживания клеток на поверхности электрода применяли закрепляющую диализную мембрану, которую фиксировали при помощи пластикового кольца.

Регистрация вольтамперных зависимостей. Циклические вольтамперограммы регистрировали при помощи вольтамперометрического анализатора “Экотест-ВА” (“Эконикс-Эксперт”, Россия) по трехэлектродной схеме. Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод с иммобилизованными клетками, вспомогательным – платиновый электрод. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный хлоридсеребряный электрод (Ag/AgCl), относительно которого были представлены все значения потенциалов. Циклические вольтамперограммы регистрировали при скорости развертки потенциала 10 мВ/с в 0.15 М калий-натрий-фосфатном буфере, рН 6.8, при 22°С. Объем ячейки составлял 15 мл.

Биосенсорные измерения. Измерения выполняли с помощью гальванопотенциостата “IPC-micro” (НПО “Вольта”, Россия). Для регистрации ответов биосенсора (зависимости тока от времени) применяли двухэлектродную схему. Угольно-пастовый электрод с иммобилизованными клетками служил рабочим, который либо модифицировали нерастворимым медиатором, либо использовали немодифицированным, как описано в разделе “Формирование рабочего электрода”. Насыщенный хлоридсеребряный электрод применяли в качестве электрода сравнения.

Растворимые медиаторы (2,6-дихлорфенолиндофенол, тионин, нейтральный красный, гексацианоферрат(III) калия и метиленовый синий) добавляли в состав калий-натрий-фосфатного буферного раствора, в котором проводили измерения. Для измерений использовали потенциал, найденный из вольтамперограммы и соответствующий максимуму потенциала окисления. Температура измерения составляла 20°C, объем ячейки был равен 5 см³. После установления стабильного уровня тока в ячейку микропипеткой вносили необходимое для получения заданной концентрации количество раствора анализируемого вещества. После каждого измерения ячейку промывали калий-натрий-фосфатным буферным раствором.

Определение БПК₅ стандартным методом разбавления. В качестве референтного метода для определения БПК₅ был использован метод разбавления в соответствии с методикой [1, 2]. С помощью БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (“Эконикс-эксперт”, Россия) определяли концентрацию растворенного кислорода в первоначальной или разбавленной пробе до и после ее инкубации в течение 5 сут при нормированных условиях [1, 2]. По полученным результатам рассчитывали массу кислорода (мг), поглощенного из одного дм³ воды, требуемого для окисления находящихся в пробе органических веществ в результате биохимических процессов. В качестве инокулята для инкубации использовали активный ил.

Определение линейного диапазона определяемых концентраций медиаторных биосенсоров. Каждый рабочий электрод был откалиброван с помощью стандартного раствора, содержащего 150 мг/дм³ глюкозы и 150 мг/дм³ глутаминовой кислоты, значение БПК₅ которого составляло 205 мгО₂/дм³ [1, 2]. Полученные зависимости ответа биосенсора от концентрации стандартного раствора были аппроксимированы по уравнению 1, так как электрохимический ответ обеспечивался ферментативными реакциями микроорганизмов в рамках кинетики Михаэлиса-Ментен.

где R – ответ сенсора, мкА; [S] – значение БПК₅ в измерительной кювете, мгО₂/дм³. Параметры R_max и K_M получали в результате обработки полученных зависимостей по уравнению гиперболы. В соответствии с кинетикой Михаэлиса–Ментен R_max – максимальная скорость ферментативной реакции, достигаемая при [S] → ∞, К_M – эффективная константа Михаэлиса, то есть концентрация субстрата, при которой R = R_max/2.

Из уравнения 1 следовало, что при низких концентрациях субстрата аналитический сигнал пропорционален БПК₅, что позволило выделить линейный участок градуировочной кривой, ограниченный сверху значением К_M. Нижнюю границу линейного участка рассчитывали статистическим методом, исходя из критерия относительного стандартного отклонения результатов измерения (Sr(C)) < 0.33.

Долговременная стабильность рабочих электродов. Долговременную стабильность рабочих электродов (сут) оценивали путем ежедневного изучения ответов сенсора на введение модельного раствора ГГС. Между измерениями электрод хранили в буферном растворе при 4°С. За время работы сенсора принимали количество суток, в течение которых ответ сенсора составлял не менее 50% от ответа, полученного после формирования рабочего электрода.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение клеток микроорганизмов из активного ила и выбор биоматериала для медиаторного биосенсора. Из активного ила, отобранного в аэротенке очистных сооружений, были выделены чистые культуры микроорганизмов. Для создания биорецепторного элемента БПК-биосенсора использовали четыре бактериальных штамма SPB1, SPB2, SPB3 и SPB4, которые содержались в активном иле в наибольшем количестве. В качестве модельного медиатора электронного транспорта был использован ферроцен, так как электрохимическая реакция с его участием не зависит от рН среды, а его малая растворимость в воде позволяет модифицировать графитовую пасту, иммобилизуя медиатор на поверхности рабочего электрода [8]. Для каждого выделенного штамма микроорганизмов при окислительно-восстановительном потенциале ферроцена снимали градуировочную зависимость ответа сенсора от БПК₅. В качестве этого потенциала был выбран равным 250 мВ, который наиболее часто использовался при работе с модифицированными угольнольно-пастовыми электродами [8, 20]. Три из четырех штаммов при использовании в качестве рецепторного элемента БПК-биосенсора давали ответы.

У штаммов, способных к осуществлению медиаторного переноса, были определены нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК. Длина фрагментов этого гена для штаммов SPB1, SPB2 и SPB3 составляла 1353, 1422 и 1442 пар нуклеотидов соответственно. Уровни сходства выделенных штаммов с типовыми штаммами известных видов оказались 99.79% (для SPB2 – P. veronii DSM 11331^T), 100% (для SPB3 – B. proteolyticus TD42^T) и 100% (для SPB1 – P. yeei BAA-599^T).

Для биосенсоров на основе каждого из трех штаммов были получены градуировочные зависимости ответа от уровня БПК в измерительной кювете. Они представлены на рис. 1. Основные характеристики сформированных биоэлектродов на основе штаммов, выделенных из активного ила, указаны в табл. 1.

Таким образом, наиболее перспективным микроорганизмом для определения БПК₅ оказался штамм P. yeei SPB1, который характеризовался максимальным временем стабильности и обладал наименьшей нижней границей определяемых концентраций. Данный штамм был использован в дальнейшей работе.

Выбор медиатора электронного транспорта. Для разработки БПК-биосенсора был проведен выбор медиаторов, способных к переносу заряда от клеток штамма P. yeei SPB1 на электрод. На рис. 2 представлены типичные вольтамперные зависимости для окислительно-восстановительного процесса на угольно-пастовом электроде в системе, содержащей медиатор гексацианоферрат(III) калия с иммобилизованными на поверхности электрода клетками штамма P. yeei SPB1.

На циклической вольтамперограмме угольно-пастового электрода в присутствии гексацианоферрата(III) калия (рис. 2) возникали два пика. Анодный отражал окисление восстановленной формы медиатора, а катодный – восстановление его окисленной формы. При введении субстрата происходило уменьшение максимума катодного пика и увеличение максимума анодного. Такой характер изменения пиков связан с протеканием в присутствии клеток и субстрата электрокаталитического процесса, в ходе которого окисленная форма медиатора взаимодействовала с восстановленными сайтами бактериальных клеток, переходя при этом в восстановленную форму. Увеличение концентрации восстановленной формы и уменьшение концентрации окисленной формы вызывало наблюдаемый рост анодного пика и уменьшение катодного.

На основе полученных вольтамперограмм выбирали рабочие окислительно-восстановительные потенциалы для систем клетки штамма P. yeei SPB1 – медиатор – угольно-пастовый электрод. Были получены следующие значения рабочих потенциалов анодного пика вольтамперограмм для систем бактерии P. yeei SPB1 – медиатор – электрод: ферроцен – 250 мВ, 1,1’-диметилферроцен – 409 мВ, ферроценкарбоксальдегид – 601 мВ, ферроценацетонитрил – 338 мВ, нейтральный красный – 335 мВ, 2,6-дихлорфенолиндофенол – 416 мВ, тионин – 829 мВ, метиленовый синий – 401 мВ, гексацианоферрат(III) калия – 288 мВ. Значения потенциалов согласовывались с полученными ранее потенциалами анодных пиков вольтамперограмм для систем дрожжи Debaryomyces hansenii – медиатор – угольно-пастовый электрод [8].

Сформированные для БПК-биосенсоров системы на основе клеток штамма P. yeei SPB1, а также растворимых и малорастворимых медиаторов тестировали на наличие аналитического сигнала при найденных редокс-потенциалах. Отклики биосенсоров при окислении субстрата были получены только при использовании таких водорастворимых медиаторов, как гексацианоферрат(III) калия, метиленовый синий, тионин, 2,6-дихлорфенолиндофенол и малорастворимый ферроцен. Эти медиаторы были использованы в дальнейшей работе для формирования БПК-биосенсора. Остальные медиаторы, вероятно, не способны осуществлять биоэлектрокатализ с данными клетками.

Выбор рабочих параметров функционирования БПК-биосенсоров. При формировании биосенсора выбирали рабочие параметры, при которых может быть достигнута максимальная чувствительность определения индекса БПК₅. Чем выше генерируемый аналитический сигнал, в данном случае амплитуда силы тока, тем выше чувствительность определения. На величину генерируемого тока могут влиять такие условия, как концентрация медиатора и количество биоматериала на электроде. Высокая концентрация медиатора может оказывать токсичное влияние на биоматериал, а значительная толщина слоя биоматериала на электроде – приводить к возникновению диффузионных ограничений как для используемого субстрата, так и для медиатора [20].

Для выбора рабочих параметров функционирования медиаторных биосенсоров на основе штамма P. yeei SPB1 определяли зависимость ответов биосенсоров от массы биоматериала на электроде и концентрации медиатора при введении раствора ГГС.

Значения ответов сенсора, как показано на рис. 3а, возрастали линейно при увеличении количества наносимого биоматериала вследствие того, что ток электрокаталитического окисления субстрата ферментными системами бактерий был пропорционален концентрации фермента на единицу площади поверхности электрода [21]. При увеличении количества биокатализатора на поверхности электрода (более 0.15 мг/мм²) ответы биосенсора снижались из-за того, что затруднялась диффузия субстрата к активным центрам ферментов бактерий, расположенных внутри биокаталитического слоя, что и приводило к снижению аналитического сигнала [22]. Таким образом, биосенсоры на основе всех исследованных медиаторов обладали максимальным аналитическим сигналом при массе биоматериала на электроде порядка ~0.15 мг/мм². Типичный вид пикообразной зависимости генерируемого биосенсором тока от концентрации медиатора представлен на рис. 3б. Аналогичный характер зависимости был получен и для других медиаторов (данные не приведены). Можно предположить, что при высоких концентрациях медиатора происходило ингибирование ферментных систем биокатализатора. Это предположение было проверено для нерастворимого медиатора ферроцена. Его замешивали в графитовую пасту и снимали аналогичные зависимости ответа сенсора от массовой доли медиатора в пасте. При концентрации ферроцена более 15% наблюдалось снижение ответов сенсора на величину более 60% от максимального аналитического сигнала, достигаемого при концентрации медиатора 10%. По максимальному ответу биосенсора были выбраны следующие рабочие концентрации медиаторов: гексацианоферрат(III) калия–33 ммоль/дм³; метиленовый синий, 1.1 ммоль/дм³; 2,5-дихлорфенолиндофенол, 0.4 ммоль/дм³; тионин, 1.1 ммоль/дм³; ферроцен, 10% (массовая доля от его содержания в графитовой пасте).

На основе полученных зависимостей были выбраны рабочие концентрации медиаторов, обеспечивающих максимальный сигнал, и биоматериала с удельной концентрации клеток на поверхности электрода, равной 0.15 мг/мм², и получены для удельной концентрации клеток на поверхности электрода, равной 0.15 мг/мм². Дальнейшие исследования проводили при указанных рабочих параметрах.

Аналитические и метрологические характеристики разработанных медиаторных БПК-сенсоров. Для биосенсоров на основе выбранного штамма и медиаторов были получены градуировочные зависимости аналитического сигнала от концентрации БПК₅ (рис. 4).

На основании анализа метрологических и аналитических характеристик, приведенных в табл. 2, можно сделать заключение о том, что разработанные медиаторные биосенсоры позволили получать стабильный аналитический сигнал, относительное стандартное отклонение которого не превышало 5.4%, исключение составил биосенсор на основе тионина. Биосенсор на его основе характеризовался самым малым временем стабильности (7 сут), что делало систему “штамм P. yeei SPB1–тионин” малопригодной для многократных анализов водных проб. По экспрессности наилучшие результаты были достигнуты в присутствии медиатора ферроцена, а биосенсоры на основе растворимых медиаторов значительно не различались по длительности единичного измерения.

Для анализа природных вод, значение БПК₅ которых может быть довольно низким и составлять ~2 мг/дм³ (чистые природные воды) [23], медиаторы тионин, гексацианоферрат(III) калия, а также 2,6-дихлорфенолиндофенол оказались мало пригодными, т.к. биосенсоры на их основе обладали высокой нижней границей определяемых концентраций, превышающей 2 мг/дм³. Для анализа таких проб целесообразно применять системы на основе медиаторов ферроцена и метиленового синего, поскольку нижняя граница этих биосенсоров позволяет производить оценку более низких значений БПК. Таким образом, на основании данных, приведенных в табл. 2, можно сделать заключение, что для определения БПК₅ наиболее перспективными являются медиаторы ферроцен и метиленовый синий.

Для обеспечения высокой корреляции результатов биосенсорного и стандартного методов анализа необходимо, чтобы разработанный биосенсор мог регистрировать окисление максимального количества органических субстратов. Исходя из этого, была оценена субстратная специфичность изученных штаммов в присутствии медиаторов ферроцена и метиленового синего. Результаты приведены на рис. 5.

Анализ субстратной специфичности, приведенной на рис. 5, позволил сделать вывод о том, что характер электрокаталитического окисления субстратов зависел от используемого медиатора. При применении медиатора, метиленового синего, исчезал отклик биосенсора на такие карбоновые кислоты, как пропандиовая, этандиовая и лимонная кислоты, что, вероятно, связано с влиянием протонов на свойства этого медиатора.

В целом, следует отметить, что наиболее широкий круг субстратов можно зарегистрировать в присутствии медиатора ферроцена. Это позволило предположить, что при этом может быть получена высокая степень корреляции между показаниями биосенсора и результатами стандартного метода анализа.

Биорецепторный элемент на основе медиатора ферроцена и клеток штамма P. yeei SPB1 по таким параметрам как чувствительность, долговременная стабильность, экспрессность и селективность, оказался наиболее пригодным для создания БПК-биосенсора (табл. 2 и рис. 5). Для сравнения в табл. 3 приведены некоторые данные, полученные для ранее известных медиаторных БПК-биосенсоров.

Из данных, представленных в табл. 3, видно, что разработанный в данной работе медиаторный БПК-биосенсор имеет высокую чувствительность и не только не уступает известным аналогам, но превосходит их по значению нижней границы определяемых концентраций. Таким образом, биосенсор на основе штамма P. yeei SPB1 и медиатора ферроцена был выбран для анализа образцов водных объектов.

Анализ образцов воды с использованием разработанного медиаторного биосенсора. Проведен анализ десяти образцов воды с использованием разработанного биосенсора и стандартным методом разбавления. Пробы представляли собой сточные воды городских очистных сооружений до и после очистки и пробы рек Тулицы, Холькельцы, Дубовки, Вашаны и Плавы (Тульская обл., Россия). Отбор проб и определение БПК₅ стандартным методом проводили согласно действующим нормативным документам [1, 2]. На рис. 6 показана корреляция между значениями БПК₅ образцов воды, определенными с помощью биосенсора, и стандартным методом разбавления.

Статистическая обработка полученных данных (модифицированный тест Стьюдента) показала, что результаты анализа стандартным методом разбавления и биосенсорным методом незначительно различались между собой. Таким образом, разработанный биосенсор можно эффективно использовать для анализа различных образцов воды.

В результате выполненных измерений изучена возможность применения в качестве биорецепторного элемента амперометрического БПК-биосенсора бактериальных штаммов P. yeei SPB1, P. veronii SPB2 и B. proteolyticus SPB3, выделенных из активного ила. Показано, что для этого могут быть использованы клетки штамма P. yeei SPB1 совместно с медиатором ферроценом. С целью повышения эффективности переноса электрона был осуществлен скрининг девяти соединений, потенциально способных к переносу электронов на основе штамма P. yeei SPB1. Продемонстрирована возможность использования тионина, метиленового синего, гексацианоферрата (III) калия и 2,6-дихлорфенолиндофенола в качестве эффективных акцепторов переноса электронов от клеток штамма P. yeei SPB1 на угольно-пастовый электрод.

В результате анализа аналитических и метрологических характеристик разработанных медиаторных БПК-биосенсоров определены наиболее чувствительные рецепторные элементы, значение нижних границ определяемых концентраций которых не превышает 2 мг/дм³. Эти рецепторные элементы были сформированы на основе комбинации штамма P. yeei SPB1 и медиаторов ферроцена или метиленового синего.

Установлено, что наиболее перспективным медиатором для формирования БПК-биосенсора на основе штамма P. yeei SPB1 является ферроцен как по значению нижней границы определяемых концентраций, так и по количеству субстратов, окисление которых можно зафиксировать в его присутствии. Анализ проб воды различного происхождения показал, что применение медиатора ферроцена и штамма P. yeei SPB1 позволяло получать результаты, высоко коррелирующие с результатами стандартного метода (R = 0.9934). Предлагаемая комбинация бактериальных клеток и медиатора может использоваться в дальнейшем для создания прототипа БПК-биосенсора, чувствительность которого не будет уступать известным аналогам.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 17-74-10078).