Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 2, стр. 133-137

Энантиоспецифичная сорбция L-лизина молекулярно импринтированными сорбентами на основе метакриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля

И. В. Полякова^1, *, О. А. Писарев^1, 2

¹ Институт высокомолекулярных соединений РАН
199004 Санкт-Петербург, Россия

² Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
195251 Санкт-Петербург, Россия

^* E-mail: pol_irina_val@list.ru

Поступила в редакцию 25.05.2018
После доработки 23.07.2018
Принята к публикации 25.09.2018

DOI: 10.1134/S0555109919010136

Полный текст (PDF)

Аннотация

На основе метакриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля синтезированы полимерные сорбенты, импринтированные молекулами L-лизина. Проведено сравнительное изучение равновесия и кинетики сорбции этой аминокислоты синтезированными и контрольным сорбентами (неимпринтированным аналогом). Показано, что энантиоспецифичное разделение рацемической смеси D,L-лизина наиболее эффективно реализовывалось на полимерном сорбенте, синтезированном в присутствии 6 моль, % L-лизина, который сорбировал аминокислоту в поверхностном сорбционном слое на энергетически равноценных специфичных центрах связывания.

Ключевые слова: L-лизин, молекулярно импринтированные сорбенты, равновесие, кинетика и динамика сорбции, энантиоспецифичное разделение

Одной из главных задач разработки препаративных сорбционных процессов выделения и очистки целевых биологически активных веществ (БАВ) из продуктов микробиологического синтеза относится поиск новых высокоселективных сорбентов, на которых их сорбция реализуется с высокими равновесными сорбционными емкостями, быстрой кинетикой гетерогенного массообмена при полной ее обратимости и сохранением нативной структуры [1, 2].

Молекулярный импринтинг является современной методикой создания высокоселективных сорбентов. При этомсополимеризацию функционального и сшивающего мономеров осуществляют в присутствии молекулы целевого БАВ, выполняющей роль шаблона или темплата. После удаления темплата из полимерной сетки в матрицах молекулярно импринтированных сорбентов (МИС) формируются импринт-сайты со специфичным сродством к целевому БАВ [3–5]. Таким образом, МИС представляют собой сорбенты, обладающие свойствами искусственных рецепторов к нему.

Энантиоспецифичное разделение рацемических смесей аминокислот, в частности D- и L-стереорегулярных форм лизинов, является актуальной задачей современной биотехнологии. К основному препятствию для широкого распространения прямого химического синтеза L-лизина относятся трудности, возникающие при разделении смеси аминокислот, состоящей из D- и L-изомеров. Широко известен способ получения L-лизина, основанный на использовании фермента лактомазы для ферментативной конверсии рацемата D,L–α-амино-ε-капролактама в L-лизин. После проведения ферментативной реакции в реакционной среде наряду с L-лизином находится и рацемическая смесь D- и L-стереоизомерных форм аминокислоты, которая должна быть подвергнута разделению [6].

Цель работы – разработка метода энантиоспецифичного разделения рацемической смеси D- и L-лизинов с использованием полимерных сорбентов на основе метакриловой кислоты (МАК) и диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ), молекулярно импринтированных L-лизином (лизМИС), и изучение влияния физико-химических свойств сорбционной среды на равновесие, кинетику и динамику сорбции ими аминокислоты.

МЕТОДИКА

В работе использованы МАК (“Вектон”, Россия), ДМЭГ (“Acros Organics”, Бельгия), изопропиловый спирт (ИПС) (“Вектон”, Россия), L-лизин (“Sigma”, США), аскорбиновая кислота (АсК) (“Вектон”, Россия) и персульфат аммония (ПСА) (“Вектон”, Россия).

Синтез полимерных сорбентов осуществляли методом радикальной сополимеризации МАК и ДМЭГ в среде 45%-ного ИПС при комнатной температуре. Концентрация сомономеров в реакционной смеси составляла 20% при соотношении МАК/ДМЭГ, равном 88 : 12 моль, %. Радикальную сополимеризацию инициировали окислительно-восстановительной системой ПСА-АсК в количестве 1 вес, % к массе сомономеров при соотношении ПСА/АсК, равном 1.5:1. Для синтеза лизМИСов в полимеризационную смесь вводили 3, 6, 9 и 12 моль, % L-лизина. Из синтезированных полимерных сеток темплаты аминокислоты вымывали 0.5 н. NaOH, водой, 0.5 н. HCl и далее снова водой до нейтрального рН.

Коэффициенты набухания (${{K}_{{\text{н }}}}$), насыпную плотность (d, г/см³), полную обменную емкость (ПОЕ, мг–экв/г) и кажущуюся константу диссоциации (pK_α) сорбентов определяли по методикам, которые описаны в [7–9].

Величины pK_α и параметр кооперативности ионизации (n) находили из линеаризованной формы модифицированного уравнения Гендерсона-Гассельбаха:

(1)

${\text{pH}} = p{{K}_{\alpha }} - n(\lg \frac{{1 - \alpha }}{\alpha }),$

где n − характеризует изменение кажущейся константы диссоциации ионогенных групп с ростом их степени ионизации. Чем больше величина n отклоняется от 1, тем больше влияние ионизации каждой предыдущей карбоксильной группы на ионизацию последующей (кооперативный характер ионизации).

Равновесие и кинетику сорбции L-лизина исследовали статическим методом. Равновесную емкость сорбции рассчитывали следующим образом:

(2)

${{q}_{р }} = \frac{{(C - {{C}_{р }})V}}{m},$

где q_р – равновесная емкость сорбции, мг/г; С и С_р – начальная и равновесная концентрация сорбтива (мг/мл), соответственно; V – объем раствора сорбтива (мл); m – масса сорбента (г).

Кинетику сорбции аминокислоты изучали путем анализа кинетических кривых зависимости степени насыщения сорбента сорбатом (F) от времени (t). F рассчитывали по формуле:

(3)

$F = \frac{{{{q}_{t}}}}{{{{q}_{p}}}},$

где q_t –сорбционная емкость в момент времени t.

Среднее время сорбции, $\bar {t}$(мин), рассчитывали как площадь над кинетическими кривыми зависимости степени насыщения от времени сорбции:

(4)

${{\bar {t}}_{1}} = \int\limits_0^1 {tdF} .$

При сорбции в полном объеме сферической частицы величина $\bar {D}$ рассчитывалась при помощи гомогенной модели Бойда [10]:

(5)

$\bar {D} = \frac{{{{r}^{2}}}}{{15\bar {t}}}.$

При сорбции в ограниченном сорбирующем слое кинетические характеристики сорбции могут быть рассчитаны при помощи модели “оболочка-ядро” [11]:

(6)

$\bar {D} = \frac{{(1 + 3\rho + 6{{\rho }^{2}} + 5{{\rho }^{3}})}}{{(1 + \rho + {{\rho }^{2}})}}\frac{{{{l}^{2}}}}{{15\bar {t}}},$

где l – толщина сорбционного слоя, см; ρ – б-езразмерный радиус несорбирующего “ядра”; $\rho = 1 - {l \mathord{\left/ {\vphantom {l r}} \right. \kern-0em} r}.$

Динамику сорбции изучали на колонках размером D × H = 10 × 50 мм. Динамические кривые сорбции анализировали в координатах С_i vs. (V_i – V₀), где С_i – концентрация аминокислоты на выходе из колонки (мг/мл), V_i и V₀ – объем элюента и свободный объем колонки (мл).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структура и физико-химические свойства синтезированных полимерных сорбентов на основе МАК и ДМЭГ зависели от количества введенных темплатов L-лизина (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние концентрации темплата на физико-химические свойства полимерных сорбентов на основе МАК и ДМЭГ

Сорбент	K_н		${{K_{{\text{н }}}^{{{\text{Na}}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{K_{{\text{н }}}^{{{\text{Na}}}}} {K_{{\text{н }}}^{{\text{H}}}}}} \right. \kern-0em} {K_{{\text{н }}}^{{\text{H}}}}}$	d, г/см³	Q, мг-экв/г	pK_α	n
Сорбент	Н-форма	Na-форма		d, г/см³	Q, мг-экв/г	pK_α	n
КС	4.0	10.0	2.5	0.71	8.6	6.3	1.7
лизМИС-3	5.0	11.7	2.3	0.71	9.0	6.4	1.5
лизМИС-6	5.4	14.4	2.7	0.70	8.8	6.3	1.4
лизМИС-9	4.9	19.8	4.0	0.69	9.1	6.3	1.2
лизМИС -12	4.4	24.5	5.6	0.69	9.2	6.2	1.2

Значения n в лизМИСах снижались по сравнению с неимпринтированным контрольным сорбентом (КС) и по мере роста концентрации темплатов в ряду лизМИСов. Следовательно, снижалось влияние ионизации карбоксильных групп на ионизацию последующих в матрицах сорбентов. В качестве характеристики структурной устойчивости КС и лизМИСов было выбрано отношение коэффициентов набухания сорбентов в натриевой форме к их коэффициентам набухания в водородной форме. Наименьшая структурная устойчивость наблюдалась для лизМИС-9 и лизМИС-12. Далее эти сорбенты не исследовались, так как большая разница в коэффициентах их набухания в натриевой и водородной формах исключала их применение в колоночных препаративных сорбционных процессах.

L-лизин является полиамфолитом и содержит в своей структуре две аминогруппы (pK_α1 = = 9.12; pK_α2 = 10.53) и одну карбоксильную группу (pK_α = 2.18). Изоэлектрическая точка лизина pI = 9.82 [12].

Сорбционные емкости КС по L-лизину значительно снижались с ростом ионной силы. Это, по-видимому, было обусловлено превалирующим вкладом ион-ионных взаимодействий в неспецифичную сорбцию аминокислоты (рис. 1а). Рост абсолютных величин сорбционных емкостей в области высоких значений рН был обусловлен сильными ион-ионными взаимодействия между полностью заряженными кислотными карбоксильными группами КС и сильноосновными ε-аминогруппами лизина.

Рис. 1.

Влияние pH и ионной силы на сорбционную емкость по L-лизину (0.2 мг/мл) КС (а), лизМИС-3 (б) и лизМИС-6 (в). 1 − 0.1, 2 − 0.2, 3 − 0.4 М ацетат натрия.

При сорбции на лизМИСах, особенно на лизМИС-6, величина сорбционной емкости практически не зависела от рН и ионной силы (рис. 1б, в). Это указывало на присутствие в молекулярно импринтированных матрицах совокупности сорбционных центров (импринт-сайтов), которые специфично связывали аминокислоту за счет неионных взаимодействий.

В ферментативном методе синтеза L-лизина продукты гидролиза D,L-α-амино-ε-капролактама в виде рацемической смеси D,L-аминокислот получают при рН 8.0–8.5 и ионной силе 0.2 М [6]. В связи с этим изотермы равновесной сорбции были изучены при рН 8.3 и I = 0.2 M.

Характер изотерм сорбции аминокислоты на КС и МИС различался. Неспецифичная сорбция L-лизина на КС осуществлялась на энергетически неоднородных сорбционных центрах (рис. 2, 1). Уже на лизМИС-3 наблюдалась тенденция к “гомогенизации” сорбционных центров, а на лизМИС-6 изотерма сорбции аминокислоты соответствовала выпуклой изотерме сорбции по независимым центрам (изотерме Ленгмюра, рис. 2, 2, 3). Это свидетельствовало о термодинамически выгодном распределении L-лизина на равноценных сорбционных центрах, которыми в матрице лизМИС-6 могут быть “полости”, комплементарные к аминокислоте.

Рис. 2.

Изотермы равновесной сорбции L-лизина на КС (1), лизМИС-3 (2) и лизМИС-6 (3).

Изучение кинетических характеристик сорбции также было проведено при рН 8.3 и 0.2 М ионной силе.

Радиус поверхностного сорбирующего слоя для расчета по модели “оболочка–ядро” был экспериментально установлен из зависимостей сорбционных емкостей от диаметра частиц и оказался равным 30 мкм (рис. 3).

Рис. 3.

Влияние диаметра частиц лизМИС-6 на сорбционную емкость по L-лизину при сорбции из 0.2 M ацетата натрия, pH 8.3.

По мере измельчения сорбентов их кинетические свойства улучшались (табл. 2). На фракции частиц с наиболее мелким размером (d_ч = 75 мкм) значения $\bar {D}$, рассчитанные по модели Бойда и “оболочка-ядро”, практически совпадали. Наиболее высокие значения $\bar {D}$ достигались на лизМИС-6. При этом они имели одинаковый порядок величин для всех размеров частиц сорбента. Это свидетельствовало о распределении аминокислоты преимущественно на легко “доступных” импринт-сайтах в поверхностно сорбирующем слое.

Таблица 2.

Кинетические характеристики сорбции L‑лизина КС и лизМИС (pH 8.3, I = 0.2 M)

Сорбент	d_ч, мкм	$\bar {t},$ мин	$\bar {D} \times {{10}^{8}}$, см²/сек
Сорбент	d_ч, мкм	$\bar {t},$ мин	модель Бойда	модель “оболочка-ядро”
КС	130	63.2	0.06	0.04
	90	6.9	0.32	0.28
	75	1.1	1.42	1.38
лизМИС-3	130	8.6	0.43	0.97
	90	4.3	0.52	0.45
	75	1.3	1.21	1.17
лизМИС -6	130	2.5	1.47	1.02
	90	1.2	1.88	1.65
	75	0.7	3.23	3.17

Данные по равновесию и кинетики сорбции были использованы для разработки динамического сорбционного метода разделения рацемической смеси D,L-лизина. На КС концентрационные профили были практически идентичны для L-лизина и D,L-лизина (рис. 4а). На лизМИС наблюдалось разделение концентрационного профиля при сорбции D,L-лизина (рис. 4б, в). При этом наиболее эффективное (практически до нулевой линии) разделение осуществлялось на лизМИС-6.

Рис. 4.

Специфичная сорбция L-лизина (1) и энантиоспецифичное разделение рацемической смеси D,L-лизина (2) (1 мг/мл в 0.2 M ацетате натрия, pH 8.3) на КС (а), лизМИС-3 (б) и лизМИС-6 (в) после десорбции 0.4 M ацетатом натрия, pH 11.7.

Таким образом, результаты исследования свидетельствовали о том, что импринтинг сополимеров МАК-ДМЭГ молекулами L-лизина приводил к получению полимерных сорбентов, которые обладали сорбционными центрами, способными осуществлять аффинноподобное связывание аминокислоты и еe энантиоселективное молекулярное узнавание.

Список литературы

Pisarev O.A., Polyakova I.V. Preparative Methods of Biologically Active Substances Fractionation. Saarbrucken: LAP Lambert Academic Publishing, 2013. 169 p.
Pisarev O.A., Polyakova I.V. // Trends in Chromatogr. 2013. V. 7. № 1. P. 85–106.
Spivak D.A., Shea K.I. // J. Mol. Recognit. 2012. V. 25. № 2. P. 320–382.
Cheong W.J., Yang S.H., Ali F. // J. Sep. Sci. 2013. V. 36. № 2. P. 609–628.
Chen L., Wang X., Lu W., Wu X., Li J. // Chem. Soc. Rev. 2016. V. 45. № 11. P. 2137–2211.
Mann J. Chemical Aspects of Biosynthesis. Oxford: University Press, 1998. 256 p.
Soldatov V.S., Sosinovich Z.I., Korshunova T.A., Mironova T.V. // React. Funct. Polym. 2004. V. 58. № 1. P. 3–12.
Полянский Н.Г., Горбунов Г.В., Полянская Н.Л. Методы исследования ионитов. М.: Химия, 1976. 206 с.
Ежова Н.М., Гаркушина И.С., Писарев О.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 6. С. 635–639.
Boyd G.E., Adamson A.W., Myers L.S. // J. Am. Chem. Soc. 1949. V. 67. № 9. P. 2836–2848.
Polyakova I.V., Pisarev O.A. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1092. № 1. P. 135–141.
Якубке Х.-Д., Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. 455 с.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал