Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 2, стр. 138-143

МЕТОДИКА

Создание гена GroEL Thermus thermophilus с заменой кодонов, кодирующих метионин, на кодоны, кодирующие лейцин. Получение экспрессирующей плазмиды. Аминокислотная последовательность GroEL из T. thermophilus содержит 6 остатков метионина, помимо инициаторного [6]. Кодирующие их триплеты были заменены на триплеты, кодирующие остатки лейцина, с помощью ПЦР с использованием следующих пар праймеров (праймеры синтезированы компанией “Евроген”, Россия):

TT-1 lo: 5'CCACCTTCTCCAGGGCGTCGGCAATCAGCTTG3',

TT-1 up: 5'GATTGCCGACGCCCTGGAGAAGGTGGGGAAGG3';

TT-2 lo: 5'AGGACCGCTTCCAGCGTCTCGGGGTTGGTGAC3',

TT-2 up: 5'CAACCCCGAGACGCTGGAAGCGGTCCTCGAGG3';

TT-3 lo: 5'TGTCCTTGAGCAGCTCCTTCCTGCGGTCACCGAAG3',

TT-3 up: 5'ACCGCAGGAAGGAGCTGCTCAAGGACATCGCGG3';

TT-4 lo: 5'CCGGCCCAGCAGGGAGAGGGTGGCGTTCTC3',

TT-4 up: 5'GCCACCCTCTCCCTGCTGGGCCGGGCCGAG3';

TT-5 lo: 5'CGCCTCCACCAGGTCCACGAACTCCCCGGTG3',

TT-5 up: 5'GGAGTTCGTGGACCTGGTGGAGGCGGGCATCG3'.

Далее, с помощью PCR со следующими праймерами (синтезированы в “Евроген”, Россия): прямой праймер TT-f-NdeI: 5'GGGAATTCCATATGGCGAAGATCCTGGTGTTTGACG3' и обратный праймер TT-r-BglII no Met 5'GGAAGATCTTTAGAAATCCAGGTCCCCGGCGC3' был получен ген безметионинового GroEL, заканчивающийся стоп-кодоном TAA (стоп-кодон выделен курсивом) и ограниченный рестрикционными сайтами для NdeI на 5'-конце и для BglII на 3'-конце (сайты выделены подчеркиванием). В качестве матрицы был использован геном T. thermophilus, полученный методом фенол-хлороформной депротеинизации из клеток микроорганизма. Полученный таким образом фрагмент был рестрицирован NdeI и BglII (“Fermentas”, Литва) согласно протоколу производителя и клонирован в экспрессионный вектор рЕТ11с (“Novagen”, Германия), в результате чего была получена экспрессионная плазмида pGroEL.

Клонирование GroES и создание бицистронной экспрессионной плазмиды. GroES из T. thermophilus был получен с помощью ПЦР с использованием прямого праймера (синтезированы в “Евроген”, Россия) f-NcoI 5'CATGCCATGGCCGCGGAGGTGAAGACG3' и обратного праймера (также “Евроген”, Россия) r-NotI 5'TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTACTGCAGGACCGCAAGCAGGTCG3', содержащих, соответственно, рестрикционные сайты NcoI и NotI (сайты выделены подчеркиванием). В качестве матрицы был использован геном T. thermophilus, полученный методом фенол-хлороформной депротеинизации из клеток микроорганизма. Аминокислотная последовательность GroES из T. thermophilus не содержала остатков метионина [6].

Фрагмент GroEL, не содержащий кодирующих метионин кодонов, полученный на предыдущем этапе, был рестрицирован NdeI и BglII (“Fermentas”, Литва) согласно протоколу производителя и клонирован во второй полилинкер бицистронного экспрессионного вектора pET Duet (“Novagen”, Германия). Фрагмент GroES был рестрицирован NcoI и NotI и клонирован в первый полилинкер бицистронного экспрессионного вектора pET Duet. В результате была получена бицистронная экспрессионная плазмида pGroEL/ES.

Экспрессия белков. Экспрессию модифицированного варианта GroEL проводили в экспрессионном штамме E.coli BL21(DE3). Ca²⁺-компетентные клетки были трансформированы плазмидой pGroEL либо pGroEL/ES согласно общепринятой методике [7]. Клетки выращивали в жидкой среде LB с добавлением ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл) при 37°С и интенсивной аэрации на качалке. По достижении клетками оптической плотности OD₆₀₀ 0.4 индукцию начинали добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида ( ИПТГ ) в конечной концентрации 0.4 мМ. Экспрессию проводили при 37°С в течение 3 ч при интенсивной аэрации, после чего клетки собирали с помощью центрифугирования при 4°С и 4000 g в течение 15 мин.

Выделение и очистка. Полученную биомассу лизировали под действием ультразвука в фосфатно-солевом буфере (10 мМ KH₂PO₄, рН 7.4, 140 мМ NaCl) в присутствии 1 мМ AEBSF (4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride). Растворимые белки отделяли от клеточного дебриса с помощью центрифугирования при 14 000 g в течение 15 мин при 4°С. Затем фракцию растворимых белков инкубировали при 62°С в течение 5 мин на водяной бане при постоянном перемешивании и снова центрифугировали в том же режиме, чтобы отделить агрегировавшие клеточные белки. Термостабильный комплекс GroEL/ES при этом оставался во фракции растворимых белков. Дальнейшую очистку проводили на колонке 10 × 300 мм (Tricorn, “GE Healthcare”, США) на носителе сефакрил S-400 в фосфатно-солевом буфере (10 мМ KH₂PO₄ рН 7.4, 140 мМ NaCl). Полученные фракции исследовали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие гомогенный комплекс GroEL/ES, объединяли и использовали для экспериментов по проверке функциональности.

Гель-фильтрация. Аналитическая гель-фильтрация для оценки олигомерного состояния полученного белка или комплекса проводилась на колонке 10 × 300 мм (Tricorn, “GE Healthcare”, США) на носителе сефакрил S-400, предварительно откалиброванной с помощью стандартного набора белков Gel Filtration Calibration Kit HMW (голубой декстран, ферритин, бычий сывороточный альбумин, лизоцим, “GE Healthcare”, США). Хроматографию проводили в фосфатно-солевом буфере (10 мМ KH₂PO₄ рН 7.4, 140 мМ NaCl). Полученные фракции исследовали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Проверка термостабильности. Для проверки термостабильности комплекса GroEL/ES фракцию растворимых клеточных белков инкубировали при 62°С в течение 5 мин в твердотельном термостате “Гном” (“ДНК-технология”, Россия), после чего охлаждали на льду. Агрегировавшие белки отделяли от растворимой фракции центрифугированием при 13000 g в течение 15 мин при 4°С (центрифуга Eppendorf 5415R “DJB Labcare Ltd”, Великобритания), после чего супернатант и осадок анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Проверка функциональности. Функциональность безметионинового GroEL, так же как и исходного варианта, проверяли по способности обратимо связывать денатурированный зеленый флюоресцирующий белок, GFP [8]. GFP денатурировали 10 мМ HCl. Спонтанную ренатурацию проводили в буфере, содержащим 50 мМ трис-HCl, 10 мМ КСl, 10 мМ MgСl₂, 1 мM ДТТ, рН 7.8, с конечной концентрацией GFP 0.1 мкМ. Для изучения действия GroEL на ренатурацию в буфер добавляли 0.4 мкм GroEL либо 0.4 мкм GroEL с 0.8 мкм GroES, а через 5 мин также добавляли 2 мМ АТФ. Наличие функционального GFP определяли по его флюоресценции на 498 нм при длине волны возбуждения флюоресценции 395 нм на спектрофотометре Shimadzu RF-5301 (“Shimadzu”, Япония) и рассчитывали как долю или процент флюоресценции от флюоресценции при спонтанном сворачивании GFP.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Безметиониновый вариант шаперона GroEL из термофильного организма был предназначен для последующего его использования в качестве белка-носителя при экспрессии целевых рекомбинантных полипептидов в системе слитых белков. Шаперон GroEL является наиболее полно исследованным шапероном с точки зрения его структурной организации и функционирования в ассистировании сворачивания белков в клетке [9–13]. Функции шаперонов, в том числе GroEL, по стабилизации различных белков в стрессовых для них условиях, могут быть также адаптированы для использования при экспрессии в бактериальной системе лабильных, гидрофобных, склонных к агрегации или токсичных пептидов [14, 15]. Шаперон GroEL применяется для повышения экспрессии, сворачивания и растворимости целевых рекомбинантных белков как при его ко-экспрессии, так и в качестве белка-носителя [5]. Для использования GroEL в качестве белка-носителя в подобной системе экспрессии необходимо предусмотреть возможность последующего отделения целевого полипептида, например, с помощью химического отщепления под действием бромциана по остаткам метионина. Если белок-носитель не содержит в своей аминокислотной последовательности остатков метионина, то очистка относительно небольшого полипептида от крупного белка может быть полноценно осуществлена в одну стадию, тогда как расщепление белка-носителя на несколько фрагментов существенно усложняет эту задачу. Природный GroEL содержит в своей аминокислотной последовательности шесть остатков метионина (рис. 1) [6].

Рис. 1.

Схема трехмерной структуры мономера GroEL из T. thermophilus [рисунок адаптирован из https://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/pdb/1WE3 с помощью программы Chimera visualization [19]]. Стрелки с номерами указывают остатки метионина в структуре белка. N- и C-концы выделены черным цветом.

Кодирующие их триплеты были заменены на триплеты, кодирующие остатки лейцина, с помощью ПЦР (рис. 2). В качестве матрицы использовали ген GroEL из термофильного организма T. thermophilus. Природный термофильный GroEL из T. thermophilus сохраняет свою структуру и функциональность до температуры 90°С [16]. Предполагалось, что если GroEL сохранит термофильные свойства после внесенных в аминокислотную последовательность изменений, это станет еще одним преимуществом при последующем его использовании в качестве белка-носителя для экспрессии в бактериальной системе, поскольку позволит отделять мезофильные белки клетки-хозяина с помощью нагревания. Полученный ген был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ11с и продемонстрировал высокий уровень экспрессии в бактериальной системе E. coli (данные не представлены). Однако проведенная с помощью гель-фильтрации оценка агрегатного состояния показала, что рекомбинантный термофильный GroEL существует в форме мономера, не образуя присущей исходной форме сложной четвертичной структуры (рис. 4а). Из литературных данных [17, 18] известно, что присутствие ко-фактора GroES стабилизирует такую структуру, поэтому безметиониновый термофильный GroEL был переклонирован в бицистронный экспрессионный вектор pET-Duet вместе с GroES из T. thermophilus для ко-экспрессии (см. раздел “Методика”). Полученный в данных условиях безметиониновый GroEL продемонстрировал высокий уровень экспрессии (рис. 3а) и практически полностью присутствовал во фракции растворимых клеточных белков (рис. 3б).

Рис. 2.

Схема ПЦР для конструирования последовательности GroEL T. thermophilus, не содержащей остатков метионина. Последовательности праймеров приведены в разделе “Методика”. Стрелками указано направление амплификации, под стрелками − названия соответствующих праймеров.

Рис. 3.

Электрофорез экспрессируемого белка GroEL T. thermophilus, не содержащего остатков метионина. а: 1 – до индукции, 2 – по окончании экспрессии; б: 1 – растворимые клеточные белки, 2 – нерастворимые белки. 3 – cтандарты молекулярной массы.

Рис. 4.

Гель-фильтрация на колонке с сефакрил S-400 GroEL из T. thermophilus, не содержащего остатков метионина, экспрессированного без GroES (а), ко-экспрессированного с GroES в составе бицистронной плазмиды (б). 14–21 – время выхода фракций, мин.; M – стандарты молекулярной массы; в – калибровочная кривая для колонки с сефакрил S-400 (кДа): голубой декстран – 1000, ферритин – 400, бычий сывороточный альбумин – 67, лизоцим – 14. Стрелками указано время выхода мономера GroEL и комплекса GroEL/ES.

Агрегатное состояние комплекса GroEL/ES было проверено с помощью гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-400 (рис. 4б, 4в). Как показывает электрофоретический анализ фракций, комплекс GroEL/ES выходит в исключенном объеме, пик достигает максимума на 16 мин (рис. 4б) между калибровочными белками голубой декстран (более 1000 кДа) и ферритин (400 кДа), что указывает на сохранение четвертичной структуры комплекса GroEL/ES. Термостабильность комплекса была проверена с помощью нагревания фракции растворимых клеточных белков до 62°С в течение 5 мин (рис. 5).

Рис. 5.

Проверка термостабильности GroEL, не содержащего остатков метионина. 1 – до нагревания; 2 – супернатант, 3 – осадок после нагревания. M – cтандарты молекулярной массы.

Комплекс GroEL/ES преимущественно оставался в растворе, тогда как большая часть белков мезофильной клетки-хозяина агрегировала. Сохранение термостабильности косвенно подтверждает сохранение четвертичной структуры комплексом GroEL/ES. Кроме того, термостабильность комплекса GroEL/ES предоставляет практическое преимущество, поскольку позволяет очистить его от белков клетки-хозяина с помощью нагревания, что и было использовано при последующей очистке белка на первой стадии. Дальнейшую очистку до гомогенного состояния проводили с помощью гель-проникающей хроматографии на колонке с сефакрилом S-400 (см. “Методика”), поскольку размеры комплекса GroEL/ES значительно превосходят размеры клеточных белков. Полученный гомогенный комплекс GroEL/ES использовали в экспериментах по проверке его функциональности. Одним из белков для изучения сворачивания с участием шаперона GroEL является зеленый флуоресцентный белок GFP, который в силу простоты и чувствительности теста является общепринятой моделью. Показано, что GroEL способен связывать и инкапсулировать GFP внутри частицы шаперона, а в присутствии также GroES и АТФ рефолдинг возобновляется с параметрами, неотличимыми от спонтанной ренатурации [8]. В проведенных экспериментах по ренатурации GFP было показано, что в присутствии как исходного GroEL, так и его безметионинового варианта, восстановления флюоресценции, т.е. ренатурации GFP, не происходило. Ренатурация возобновлялась в обоих случаях после добавления GroES и АТФ, и конечная достигнутая флюоресценция соответствовала флюоресценции GFP при спонтанной ренатурации в аналогичных условиях.

Замена сразу нескольких метионинов не сказывалась на основных параметрах шаперона GroEL – он оставался растворимым, сохранялся как термостабильная частица в комплексе GroEL/ES, а также сохранял функциональность. Это делает созданный вариант шаперона привлекательным для использования в качестве белка-носителя при получении целевых рекомбинантных пептидов в составе слитых белков.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, уникальный идентификатор работы (проекта) RFMEFI57517X0151.