Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 4, стр. 358-365

МЕТОДИКА

Штаммы N. crassa, среды, культивирование. Штамм дикого типа wt 987(74-0R23-1A) и мутанты nit-2 (33 A) и nit-6 (3463 A) аскомицета N. crassa были получены из Центра по хранению генетического материала грибов (Fungal Genetic Stock Center – FGSC, США). Оба мутанта дефектны по НиР, а nit-2 штамм лишен также и НР.

Состав сред, получение инокулята и условия культивирования дикого типа и nit-мутантов были описаны ранее [20, 22]. Мицелий выращивали на агаризованной среде Фогеля с 2%-ной сахарозой в качестве источника углерода, но с другим источником азота [22]. В опытах по конидиогенезу вместо 25 мM NH₄NO₃ использовали 50 мM NH₄Cl или 50 мМ NH₄NO_3, или 50 мМ NaNO₃.

Регуляция светом каротиногенеза и конидиогенеза. Фотоиндукцию каротиногенеза и фотостимуляцию конидиогенеза проводили согласно предыдущим работам [19, 20].

Получение экстрактов мицелия. После 24 ч выращивания в темноте при 28°C мицелий собирали с поверхности целлофана при красном свете, промывали дистиллированной водой, фильтровали через 3 слоя марли, высушивали с помощью фильтровальной бумаги и растирали с жидким азотом в течение 15 мин. Экстракцию осуществляли при слабом перемешивании в течение 30 мин тремя объемами 50 мM Трис-HCl буфера, pH 8.0, содержащего 0.5 мM ЭДTA, 1 мM дитиотреитола, 5 мкг/мл леупептина, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл пепстатина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). После центрифугирования при 20 000 g в течение 30 мин при 4°С полученные супернатанты диализовали в течение ночи против того же буфера, содержащего в качестве ингибитора протеаз только 1 мМ PMSF. Аликвоты диализатов хранили при –70°C.

Определение активности NO-синтазы. Активность NO-синтазы оценивали по превращению ³H-L-аргинина в ³H-L-цитруллин. В серии предварительных экспериментов были определены оптимальные условия для ферментативной реакции. Реакционная смесь общим объемом 50 мкл содержала (мкМ): НАДФН – 1.0, ФАД – 5.0, ФМН – 5.0, тетрагидробиоптерин − 50, валин − 50 мМ, цитруллин – 1.0 мМ, аргинин − 10 мкМ и ³H-аргинин − 0.5 мкл (“Amersham Biosciences”, США) с активностью 1 мккюри/мл, растворенного в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 8.0. Ферментативную реакцию начинали добавлением 20 мкл диализата белков N. crassa и проводили в течение 20 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 300 мкл суспензии ионообменника Dowex 50 Wx8 (400 меш, Na⁺ форма; “Sigma-Aldrich”, США) в 50 мМ HEPES буфере, pH 7.5. Положительно заряженный L-аргинин связывался с колонкой Dowex, а незаряженный продукт, ³H-цитруллин, оставался в растворе. Радиоактивность полученных проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Wallac 1420 (“Perkin Elmer”, США). Для исключения неспецифичеcкого действия на ферментативную активность различных соединений, содержащихся в мицелиальном диализате, добавляли ингибитор индуцибельной NO-синтазы животных L-N6-(1-иминоэтил)-лизин (L-NIL). Для снижения влияния фоновой радиоактивности данные для реакционной смеси, содержащей воду, вычитали из данных для той же смеси с 0.1 мМ L-NIL вместо воды. Концентрацию белка измеряли по методу Бредфорд, используя БСА в качестве стандарта.

Удельную активность NO-синтазы выражали в пмоль цитруллина образовавшегося в мин на мг белка.

Вестерн-блоттинг. Диализаты N. crassa смешивали с равным объемом 125 мМ Трис-HCl буфера, pH 6.8, содержащего 4% ДДС, 10% глицерина, 0.006% бромфенолового синего, 1.8% ß-меркаптоэтанола, прогревали при 100°C в течение 10 мин, пробы центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин. После измерения концентрации белка в супернатанте его равные количества фракционировали методом электрофореза в 8%-ном ПААГ с Na-ДДС при 100 В в течение 90 мин. Затем белки переносили на мембрану из поливинилиденфторида с размером пор 0.2 мкМ (“Bio-Rad Laboratories”, США) при 150 мА в течение 180 мин. Предварительно окрашенные высокомолекулярные белковые стандарты (“Bio-Rad Laboratories”, США) использовали в качестве маркеров для контроля переноса белков. Блокировку сайтов неспецифического связывания 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 7.5, содержащим 150 мM NaCl, 0.1% Tвин-20 (TBST) и 5% сухое молоко проводили в течение ночи. Затем мембраны промывали в TBST и инкубировали в течение ночи при 4°C с первичными антителами к мышиной нейрональной NO-синтазе (разведение 1 : 2000, “Chemicon”, США) или мышиной эндотелиальной NO-синтазе (разведение 1 : 5000, “BD Biosciences”, США) или кроличьей индуцибельной NO-синтазе (разведение 1 : 5000, “Chemicon”, США). После трехкратной промывки мембраны инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, которые визуализировали используя хемилюминесцентный субстрат SuperSignal West Pico (“Thermo Scientific Pierce”, США).

Статистический анализ. Число биологических параллелей варьировало от 3 до 15, число биохимических параллелей было не ниже 3. Результаты представлены в виде средних значений ± ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение свойств NO-синтазы N. crassa с индуцибельным ферментом млекопитающих. Для определения активности фермента в диализатах мицелиальных клеток гриба был оптимизирован метод измерения скорости ферментативного окисления ³H-L-аргинина, использовавшийся ранее при исследовании клеток млекопитающих. Оказалось, что фермент N. crassa чувствителен к специфическим ингибиторам ферментов животного происхождения. Исследование проводили на диализатах супернатантов экстрактов мицелия и для исключения неспецифического действия различных примесей, а также эндогенного L-аргинина результаты измерения NO-синтазной активности представляли в виде разности активностей в пробах, содержащих и не содержащих ингибитор фермента. Ферментативная активность N. crassa была на порядок более чувствительна к L-NIL, чем к метиловому эфиру N-нитро-L-аргинина (NAME) (рис. 1а). Кроме того, аналогично ферменту из P. blakesleeanus [5], она не активировалась в присутствии ионов кальция (рис. 1б). Известно, что iNOS млекопитающих является Са-независимой, так как она тесно связывается с кальмодулином вне зависимости от концентрации внутриклеточного кальция [23]. На основании результатов по действию специфических ингибиторов и ионов кальция на активность фермента было сделано предположение о сходстве NO-синтазы N. crassa с индуцибельной формой фермента животных.

Рис. 1.

Действие различных ингибиторов (а) и ионов кальция (б) на активность (пмоль цитруллина/мин · мг белка) NO синтазы N. crassa). а − 1 – 0.01 мМ L-NAME; 2 – 0.1 мМ L-NAME; 3 – 1 мМ L-NAME; 4 – 0.01 мМ L-NIL; 5 – 0.1 мМ L-NIL; б − 1 – 200 мМ ЭДTA; 2 – 1 мМ ЭГТА; 3 – 0.01 мМ Са²⁺; 4 – 0.1 мМ Са²⁺. Способ подсчета удельной активности фермента описан в тексте статьи.

Действительно, с помощью Вестерн-блоттинга (рис. 2) выявлено наличие у всех изучаемых штаммов N. crassa белка, с которым специфически связываются поликлональные антитела против iNOS изоформы фермента млекопитающих, но не взаимодействуют антитела против eNOS и nNOS изоформ фермента. Для прореагировавших антител иммуногеном служил С-концевой пептид, содержащий 14 аминокислот iNOS, полученный из макрофагов мыши. При сравнении с положением белковых метчиков было выявлено, что молекулярная масса обнаруженной формы фермента N. crassa близка к таковой для iNOS животных [24] и равна 130 кДа.

Рис. 2.

Результаты Вестерн-блоттинга различных штаммов N. crassa с использованием антител к нейрональной (1), эндотелиальной (2) и индуцибельной (3) изоформам NO-синтазы млекопитающих; 1 – nit-1 мутант; 2 – nit-6 мутант и 3 – wt-987 штамм N. crassa. Цифры обозначают молекулярные массы белков-метчиков (кДа).

Данные о существовании различных форм NO-синтазы грибов, аналогичных формам, обнаруженным для фермента животных, немногочисленны. Канадиа с соавт. [25], используя моноклональные антитела против nNOS, выявили конститутивную форму NO-синтазы у дрожжей S. cerevisiae. В более поздней работе у этого же микроорганизма в экспоненциальной фазе роста выявлена экспрессия эндотелиальной, нейрональной и индуцибельной изоформ фермента [26]. Показано, что индукция различных изоформ NO-синтазы у этого гриба зависит от метаболического состояния клеток и ответа на стресс.

Таким образом, на основании комплекса полученных данных о чувствительности фермента к специфическому ингибитору iNOS и ионам кальция и его взаимодействии с поликлональными антителами против iNOS можно предположить существование в поверхностном мицелии N. crassa формы фермента, сходной с индуцибельной изоформой млекопитающих.

NO-синтаза в фотоморфогенезе N. crassa. На рис. 3 представлены результаты изменения удельной активности NO-синтазы в каротиногенезе у штамма дикого типа N. crassa в зависимости от времени освещения. Достоверных изменений этого параметра не наблюдалось как в освещенных культурах, так и в темновых контролях. Рост гриба осуществляли на стандартной среде Фогеля, содержащей 4 мМ хлорид аммония в качестве источника азота. Необходимо отметить, что, в противоположность дикому штамму, в этих условиях культивирования N. crassa NO-синтазная активность в диализатах nit-мутантов не обнаруживалась.

Рис. 3.

Активность NO-синтазы в каротиногенезе wt-987 штамма N. crassa (культивирование на среде с 4 мМ NH₄Cl в качестве источника азота). Темные столбики – темновые контроли, светлые – освещенные культуры. Способ подсчета удельной активности фермента описан в тексте статьи.

С результатами опыта, представленными на рис. 3 согласовывались результаты на рис. 4, согласно которым освещение мицелия гриба в присутствии ингибитора NO-синтазной реакции L-NIL при концентрации от 0.1 до 1.0 мМ, практически не сказывалось на фоторегуляции каротиногенеза в клетках трех штаммов N. crassa.

Рис. 4.

Синтез каротиноидов в присутствии и отсутствии L-NIL у мутантов nit-2 (1, 4), nit-6 (2, 5) и штамма wt-987 (3, 6) N. crassa. 1, 2, 3 – освещенный мицелий, 4, 5, 6 – темновые контроли.

В табл. 1 приведены результаты определения удельной активности NO-синтазы в фоторегулируемом конидиогенезе N. crassa, осуществляемом в сухой поверхностной культуре на средах с разными источниками азота. Ранее было показано [22], что в этих условиях совместное действие света и дегидратации в большинстве вариантов азотного статуса вызывало синергическое увеличение выхода конидий, поэтому для исследования были взяты варианты (штамм + источник азота в среде), в которых наблюдался эффект фотостимуляции конидиогенеза или же он отсутствовал. Было установлено, что при культивировании на среде с 50 мМ NH₄Сl активность фермента не была обнаружена как в вариантах, для которых отмечена фотостимуляция конидиогенеза, так и без нее. При выращивании дикого типа на среде с 50 мМ NaNO₃ фермент был активен, но величина удельной активности NO-синтазы оказалась одинаковой и в темновом контроле, и в мицелии, подвергнутом освещению. Сравнимая удельная активность фермента обнаружена у гриба-паразита C. minitans [8]. Примечательно, что она достигает максимального уровня 20 пмоль/мин · мг белка именно при конидиогенезе.

При увеличении концентрации хлорида аммония в среде культивирования дикого штамма N. crassa от 4 до 50 мМ активность NO-синтазы исчезала. Вместе с тем активность фермента выявлялась при выращивании гриба на среде с 50 мМ NaNO₃. Это позволило предположить наличие ингибирующего действия ионов ${\text{NH}}_{{\text{4}}}^{{\text{ + }}}$ и активирующего ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ на NO-синтазу N. crassa, подобного обнаруженному для НР [27].

Вестерн-блоттинг диализатов различных штаммов N. crassa, полученных для разных вариантов конидиогенеза аскомицета, с антителами к iNOS представлен на рис. 5а. Использовали разные варианты (штамм + источник азота в среде), в которых эффект фотостимуляции конидиогенеза или был, или отсутствовал. Несмотря на отсутствие активности фермента в ряде случаев (табл. 1) иммунологически NO-синтаза выявлялась во всех вариантах. Средние показатели денситометрии экспрессии фермента в различных вариантах конидиогенеза из 3 Вестерн-блот опытов суммированы на диаграмме рис. 5б. Они свидетельствовали скорее о зависимости экспрессии фермента от состава среды культивирования, чем от влияния освещения мицелия в разных вариантах конидиогенеза N. crassa.

Рис. 5.

Вестерн-блоттинг и денситометрический анализ диализатов различных штаммов N. crassa, полученных для разных вариантов конидиогенеза аскомицета, с поликлональными антителами к iNOS кролика (а) и денситометрия экспрессии NOS (б). a − 1, 2 – wt-987 + 50 мМ NH₄Сl; 3, 4 – nit-2 + 50 мМ NH₄Сl; 5, 6 – nit-6 +50 мМ NH₄Сl; 7, 8 – nit-6 + 50 мМ NH₄NO₃; 9, 10 – wt-987 + 50 мМ NaNO₃. 1, 3, 5, 7 – темновые контроли, 2, 4, 6, 8 – после 2-часовой стимуляции светом. Цифры обозначают молекулярные массы белков-метчиков(кДа).

Изменение удельной активности NO-синтазы под действием света ранее было выявлено у зигомицета P. blakesleeanus [5]. Предполагали, что данный фермент является частью световой сигнальной цепи, так как образование цитруллина из аргинина увеличивалось под действием света в наиболее важных фазах развития зигомицета – в логарифмической фазе роста мицелия и при созревании макроспорангиофоров. Увеличение активности NO-синтазы в 72 раза перед образованием плодовых тел происходило в освещенном мицелии базидиомицета F. velutipes [6], однако оценить вклад действия света в этот процесс сложно, так как темновые контроли не были поставлены. Основываясь на действии донора NO и ингибиторов NO-синтазы на фотоконидиогенез N. сrassa, Ниннеманн и Майер [16] предположили, что свет может быть отрицательным регулятором функционирования NO за счет ингибирующего действия на фермент. Однако, в настоящей работе выявить какие-либо светозависимые изменения удельной активности NO-синтазы в светорегулируемых процессах каротиногенеза и конидиогенеза N. сrassa не удалось. Вместе с тем, учитывая данные о динамике выхода нитрита из мицелия nit-6 и изменения внутриклеточного содержания ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ и ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ у разных штаммов при фотоиндукции каротиногенеза и фотоактивации конидиогенеза [19, 20], можно также предположить возможность L-аргинин-независимого синтеза NO у N. сrassa. Он может осуществляться белком (или комплексом белков), обычно выполняющим другие ферментативные функции.

У высших растений в определенных условиях продукцию оксида азота катализируют НР [28, 29]. Недавно на примере Aspergillus установлено, что грибы также способны синтезировать NO при помощи НР [30]. Возможность участия НР и НиР в регуляции фотоконидиогенеза N. сrassa (wt-987 штамм на среде с вторичным азотом) рассматривалась в предыдущей работе [22], однако наличие данных ферментов не являлось необходимым элементом процесса, так как и у nit-2, и nit-6 мутантов наблюдалась светозависимая стимуляция образования спор. С использованием мутантов, дефицитных по НР и НиР было показано, что эти ферменты также не участвуют в синтезе NO у Magnaporthe oryzae, аскомицета, вызывающего гниль риса [31]. Другими вероятными кандидатами, ответственными за образование оксида азота, могут быть ксантиноксидоредуктаза [29], p450:НАДФН-P450 редуктаза [31] или некоторые мембраносвязанные ферменты [29, 32]. Гипотеза, предложенная для высших растений, по которой NO-синтазоподобная активность, зависимая от L-Arg, может быть результатом кооперативного действия нескольких дискретных белков, собранных в сложный комплекс, в результате чего генерируется NO [12], может быть справедлива и для грибов.

Недавно Пенгкит с соавт. [33] выявили в геноме N. crassa ряд генов, имеющих высокую степень гомологии с генами NO-синтазы других грибов и человека. Анализируя их свойства, авторы предположили возможность существования различных путей синтеза NO (зависимого и независимого от NO-синтазы) у N. crassa.