Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 3, стр. 302-309

МЕТОДИКА

Работу проводили с использованием яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Саратовская 29. Для заражения использовали гриб Cochliobolus sativus (Ito et Kurib.) Drechs. Ex Dastur (конидиальная стадия Bipolaris sorokiniana Sacc. In Sorok., Shoem.), вызывающий одну из наиболее вредоносных болезней пшеницы – темно-бурую листовую пятнистость, из “Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей” Центра коллективного пользования научным оборудованием “Инновационные технологии защиты растений” ВИЗР.

В экспериментах использовали штаммы-антагонисты B. subtilis ВКМ В-2604D и B. subtilis ВКМ В-2605D и фитопатогенные микроорганизмы из Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР. Культивирование штаммов проводили в течение 72 ч на питательной среде следующего состава (г/л): кукурузный экстракт 30, меласса 15, pH – 7.2, в колбах объемом 750 мл с 100 мл среды на лабораторной качалке при 28°С и 220 об./мин.

Биопрепарат Витаплан СП (смачивающийся порошок), разработанный в ВИЗР, и включенный в “Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ”, предназначен для защиты основных сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных болезней. Витаплан СП выпускается ЗАО “Агробиотехнология” ООО УК “АБТ-групп”. В настоящей работе использовали Витаплан в виде культуральной жидкости (КЖ), полученной при глубинном культивировании штаммов-продуцентов препарата B. subtilis ВКМ В-2604D и B. subtilis ВКМ В-2605D, что позволило оптимизировать его состав путем включения индукторов болезнеустойчивости.

Схема опыта предусматривала следующие варианты: контроль (обработка водой); Витаплан КЖ штаммов B. subtilis ВКМ В-2604D и B. subtilis ВКМ В-2605D в соотношении 1 : 1 (титр жизнеспособных клеток 10¹⁰ КОЕ/мл); Витаплан + + 0.05% салицилата хитозана (СХ); Витаплан + + 0.1% СХ; Витаплан + 0.2% СХ; Витаплан + + 0.5% СХ; композиция Витаплан + + 0.1% СХ (КЖ препарата разводили дистиллированной водой в 10 раз (титр 10⁹ КОЕ/мл) и добавляли СХ до концентрации 0.1%; салицилат хитозана (СХ) – 0.1%.

Для получения 0.1%-ного СХ использовали хитозан с мМ 60 кДа, полученный методом окислительной деструкции [15] из хитозана с молекулярной массой 150 кДа и степенью деацетилирования 85% (“Биопрогресс”, Россия). На его основе получали салицилат хитозана, содержащий ионно-связанные фрагменты салициловой кислоты, составляющие 25%, путем добавления СК до достижения концентрации раствора 0.1% по хитозану. Ионную природу связи (образование соли) между хитозаном и СК в производных (Хитозан + СК) подтверждали ИК-спектрами, полученными на спектрометре Spectrum BX (“Perkin Elmer”, США) по наличию характеристических полос 1552.92 и 1386.12 см⁻¹ карбоксильной группы –СОО^–, а также широкой полосы в области 3100–2600 см⁻¹, отражающей валентные колебания функциональных групп $--{\text{NH}}_{3}^{ + }$ и OH [16].

Титр жизнеспособных клеток в препарате определяли стандартным методом десятикратных серийных разведений с высевом на сухой питательный агар (СПА) для культивирования бактерий (АО “НПО “Микроген”, Россия) и последующим подсчетом числа выросших колоний. Оценку антибактериальной активности образцов по отношению к возбудителю бактериального рака томатов Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. (штамм 101) и антигрибной активности по отношению к фитопатогенным микромицетам (Alternaria solani Sorauer, Fusarium solani (Mart.) Appel et al., F. culmorum Sacc., F. graminearum Schwabe, F. redolens W.L. Gordon, F. sporotrichoides Sherb., Sphaeropsis malorum Peck., Rhizactonia solani J.G. Kühn, Botrytis cinerea Pers., Cochliobolus sativus (Ito et Kurib.) Drechs. Ex Dastur, Colletotrichum lagenarium (Pass.) Ell. et Halst.) проводили методом бумажных дисков по диаметру зоны лизиса тест–культур фитопатогенов на агаризованной питательной среде. Для этого поверхность агара Чапека в чашках Петри сплошным газоном засевали суспензией фитопатогена с титром 10⁵ КОЕ/мл, а затем на поверхность агара помещали стерильные бумажные фильтры диаметром 8 мм, на которые пипеткой наносили суспензию лабораторного образца препарата определенной концентрации. Выращивание тест-культур проводили в термостате при 22–25°С. Зоны лизиса измеряли на 5 сут.

Изучение прямого фунгистатического действия исследуемых образцов проводили in vitro методом агаровых блоков. В стерильные чашки Петри разливали охлажденную до 40°С агаризованную среду Чапека. После застывания на поверхность среды равномерно наносили суспензии испытуемых образцов препаратов (0.2 мл), а затем помещали блоки 10-суточных культур возбудителя гельминтоспориозной корневой гнили зерновых культур C. sativus диаметром 6 мм, вырезанные стерильным сверлом из мицелиальных газонов грибов, выращенных на агаре Чапека в течение 8–10 сут. В качестве контроля служили чашки с агаризованной средой Чапека с блоками тест-культуры без испытуемых образцов препаратов. Чашки инкубировали в темноте при 25°С. Диаметры колоний гриба измеряли на 5 и 7 сут. культивирования, после чего оценивали фунгистатическое действие испытуемых образцов по формуле Эббота [17].

Опыты по оценке иммуномодулирующей активности образцов препаратов проводили методом отделенных листьев [18]. За 24 ч до инокуляции патогеном 7-дневные проростки пшеницы восприимчивого к болезням сорта Саратовская 29 опрыскивали суспензиями препаратов в разведении 1 : 10. Заражение листьев пшеницы проводили суспензией спор (4 × 10³; 2 × 10⁴ спор/мл) гемибиотрофа С. sativus. Степень пораженности листьев пшеницы оценивали на 4 сут, признаки пораженности листьев пшеницы в виде бурых пятен при заражении C. sativus в контроле принимали за 100%. Иммуномодулирующую активность исследуемых вариантов препаратов оценивали в процентах, как степень пораженности листьев растений патогеном по отношению к контролю.

Влияние различных препаратов Витаплана на прорастание конидий С. sativum проводили в капле (200 мкл). Раствор образца (0.1 мл) наносили на предметное стекло, добавляли 0.1 мл спор C. sativus и выдерживали в темноте при 22°С во влажной камере в течение 24 ч. Прорастание конидий оценивали микроскопированием, просматривая не менее 100–200 конидий в варианте и в контроле (в воде). Частоту прорастания выражали в процентах от общего числа спор, просмотренных в контроле и опыте.

Все опыты проводили в 3-кратной повторности, полученные данные обрабатывали с использованием методов описательной статистики на основе стандартных ошибок средних ±SEM, 95%-доверительных интервалов, наименьшей существенной разности НСР при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рассмотрены два пути использования салицилата хитозана для повышения биологической эффективности препарата Витаплан. Первый путь – это включение СХ в концентрации 0.05, 0.1, 0.2 и 0.5% в состав среды при глубинном культивировании штаммов B. subtilis (получении препарата Витаплан), другой – создание композиции путем включения СХ в концентрации 0.1% в состав конечной препаративной формы Витаплана.

На первом этапе исследований оценивали влияние различных концентраций СХ на жизнеспособность и антагонистическую активность штаммов, составляющих основу препарата Витаплан. На основании полученных данных выявили оптимальную концентрацию СХ в среде для глубинного культивирования, существенно повышающую антагонистическую активность штаммов B. subtilis (табл. 1).

Установлено, что включение СХ в среду для культивирования в концентрации 0.05 и 0.1% положительно повлияло на плотность бактериальных клеток и коррелировало с увеличением антагонистической активности штаммов Витаплана по отношению к тест-культурам (табл. 1).

Введение 0.2 и 0.5% СХ в питательную среду на порядок уменьшало титр жизнеспособных клеток штаммов, что закономерно приводило к снижению антагонистической активности КЖ по отношению к некоторым видам фитопатогенных микроорганизмов, таких, как C. sativus, F. solani, C. lagenarium и др.

Наибольшую антагонистическую активность по отношению к большинству тест-культур показали: Витаплан + 0.05% и Витаплан + 0.1% СХ.

На следующем этапе была проведена оценка способности препаратов Витаплан + СХ ингибировать рост гриба и прорастание конидий патогена, а также повышать устойчивость пшеницы к возбудителю темно-бурой пятнистости.

В соответствии с регламентами применения биопрепаратов в сельском хозяйстве, сравнительную оценку биологической эффективности Витаплана и его вариантов с СХ проводили, используя титр 10⁹ КОЕ/мл. Результаты оценки влияния различных препаратов Витаплана + СХ на линейный рост и на прорастание конидий С. sativus in vitro представлены в табл. 2.

Установлена высокая фунгистатическая активность Витаплана, которая составляла 73.3% на 7 сут опыта. При добавлении в среду для глубинного культивирования 0.05 и 0.1% СХ высокая антигрибная активность сохранялась (71.7 и 70.8%). Увеличение концентрации СХ до 0.2 и 0.5% снижало фунгистатическую активность Витаплана до 62.5 и 59.2% соответственно, что могло быть обусловлено уменьшением плотности суспензии клеток бактерий в биопрепарате (табл. 1).

Композиция Витаплан + 0.1% СХ, полученная путем включения салицилата хитозана в готовую форму биопрепарата Витаплан, ингибировала мицелиальный рост аскомицета до 57.5%. Снижение фунгистатической активности композиции по сравнению с исходным биопрепаратом Витаплан (73.3%) на 7 сут культивирования, во-видимому, связано с невысоким фунгистатическим эффектом самого СХ. Известно, что биоцидная активность хитозана обусловлена поликатионной природой полимера и способностью связываться с отрицательно заряженными поверхностными структурами клеток [19], что нарушает нормальное функционирование обменных процессов клетки с внешней средой и ингибирует рост мицелия гриба.

Согласно полученным данным, СХ как индуктор болезнеустойчивости обладал небольшой фунгистатической активностью, сдерживая рост мицелия С. sativus лишь на 40.9% на 5 сут совместного культивирования и на 38.6% – на 7 сут (табл. 2).

Известно, что споры грибов – главный источник инфицирования растений. Скорость прорастания спор имеет большое значение для возникновения заболевания, поэтому факторы, ускоряющие или замедляющие ее, оказывают существенное влияние на процесс заражения растений.

Данные, представленные в табл. 2, показывают, что Витаплан без СХ только вдвое ингибировал прорастание конидий С. sativus (47.6%) по сравнению с контролем (85.2%). Препарат Витаплан с СХ в концентрации 0.05 и 0.1% в стандартной среде для глубинного культивирования также ингибировали прорастание конидий аскомицета до 55.9 и 50.0% к контролю соответственно. Увеличение концентрации СХ до 0.2 и 0.5% снижало способность биопрепарата подавлять прорастание конидий С. sativus.

Установлен высокий ингибирующий эффект композиции Витаплан + 0.1% СХ на прорастание конидий С. sativus. Если в контроле через 24 ч прорастало 85.2%, то в опыте проросших конидий обнаружено только 9.0% (табл. 2). По-видимому, такая высокая ингибирующая активность композиции обусловлена включением в ее состав 0.1% СХ, который активно сдерживал прорастание конидий микромицета – количество проросших спор в данном варианте через сутки составило 3%.

Анализ результатов изучения индуцирующей активности Витаплана показал, что их эффективность зависит от интенсивности поражения растений пшеницы возбудителем темно-бурой пятнистости C. sativus (табл. 3).

В контрольных растениях, инфицированных C. sativus, интенсивность заражения составляла 30% и 60% от площади листа при разных инфекционных нагрузках. Предварительная обработка Витапланом КЖ с последующим заражением возбудителем темно-бурой пятнистости снижала площадь поражения листьев на 10–15% в зависимости от уровня развития болезни в контроле. Опрыскивание растений пшеницы препаратом Витаплан + 0.05% СХ сокращало пораженность листьев в 1.5–3 раза, а Витаплан + 0.1% СХ – в 2–6 раз.

Отсутствие индуцирующей активности у препаративных форм Витаплан + 0.2% СХ и Витаплан + 0.5% СХ, вероятно, связано с более низким ингибированием прорастания конидий C. sativus и слабым фунгистатическим эффектом (табл. 2) по сравнению с другими вариантами (табл. 3).

Обработка растений пшеницы композицией Витаплан + 0.1% СХ повышало устойчивость пшеницы к темно-бурой пятнистости, что выражалось в снижении площади поражения листьев возбудителем в 2–6 раз по отношению к контролю. Поскольку 0.1% СХ обладал высокой индуцирующей активностью, то при добавлении к Витаплану наблюдалось усиление иммуномодулирующей активности биопрепарата в 2–3 раза (табл. 3).

Индуцирующая активность препаратов Витаплан, содержащих в своем составе СХ, положительно коррелировала со степенью ингибирования прорастания конидий C. sativus. Чем сильнее подавлялось прорастание спор патогена, тем выше была индуцирующая активность образца (табл. 2, 3).

Биологическая эффективность биопрепарата Витаплана КЖ обусловлена двумя механизмами, лежащими в основе взаимоотношений в патосистеме пшеница – Cochliobolus sativus, это прямое биоцидное воздействие штаммов Bacillus на микромицеты, а также усиления системной устойчивости растений. Прямое биоцидное действие B. subtilis связывано, по-видимому, с синтезом ими различных метаболитов с антибиотической активностью – антибиотиков, биосурфактантов, сидерофоров и др. [20–22]. Помимо прямого антагонистического действия на клетки возбудителя, бациллы способны также повышать устойчивость растений синтезируя элиситоры, благодаря которым происходит активация системной индуцированной устойчивости и системной приобретенной устойчивости [23, 24]. Элиситорами, запускающими защитные реакции у растений, могут быть белки, липопептиды, полисахариды и др. соединения, ассоциированные с клеточной стенкой бактерии B. subtilis [4, 25, 26], а также антибиотики и биосурфактанты [6, 8, 23, 27–29].

Согласно исследованиям Шенина с соавт. [30] и Новиковой с соавт. [9] высокая биологическая эффективность биопрепарата Витаплан обусловлена синтезом штаммами B. subtilis метаболитных комплексов сложного состава, включающего пептидные и полиеновые антибиотики. Установленная в работе высокая фунгистатическая активность Витаплана по отношению к C. sativus (73.3%, табл. 2), по-видимому, определяется синтезом штаммами B. subtilis антибиотических веществ, подавляющих или замедляющих рост фитопатогена.

Индуцирующая активность исходного биопрепарата Витаплан проявилась в понижении пораженности листьев пшеницы C. sativus на 10–15% в зависимости от инфекционной нагрузки (табл. 3). Полученные результаты согласовывались с имеющимися в литературе данными. Так, показано, что снижение развития болезни в результате опрыскивания листьев ячменя фильтратом КЖ штамма Bacillus amyloliquefaciens перед инокуляцией C. sativus, обусловлено запуском индуцированной устойчивости [31].

Биопрепарат Витаплан представляет собой культуральную жидкость высокоактивных штаммов Bacillus subtilis (B. subtilis ВКМ В-2604D и B. subtilis ВКМ В-2605D), полученных методом глубинного культивирования. В состав культуральной жидкости входят споры штаммов, остатки питательной среды, а также метаболиты, выделенные в среду в процессе ферментации [9, 30]. Следует отметить, что при глубинной ферментации штаммов, входяших в препарат Витаплан, в среде с СХ происходило расщепление и утилизация его как субстрата, а также, вероятно, выход в среду салициловой кислоты, связанной лабильной ионной связью с хитозаном, вследствие диссоциации соли.

Таким образом, получены варианты жидкого препарата, содержащие комплекс различных метаболитов с антибиотической активностью, с гормональными и сигнальными функциями (такие, как ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовая, салициловая, жасмоновая кислоты), а также набор олигомеров хитозана, обладающих элиситорной активностью.

Более высокая способность препарата Витаплан + 0.1% СХ индуцировать устойчивость пшеницы к темно-бурой пятнистости по сравнению с исходной может быть обусловлена наличием олигомеров хитозана, образующихся при гидролизе СХ хитиназами бактерии [32], которые, как известно, являются эффективными элиситорами индуцированной устойчивости растений [33, 34].

Повышенная биологическая активность композиции препарата Витаплан + 0.1% СХ, по-видимому, определяется совмещением фунгицидной активности препарата и индукции защитных реакций растения СХ.

Согласно работе [35] и другим работам применение 0.1%-ного СХ может эффективно индуцировать реакции защиты от патогенов, формируя устойчивость к болезням [13]. Однако СХ может обладать и прямым действием на патоген, блокируя прорастание спор, поскольку хитозан является пленкообразующим полимером. Нанесенный на листья растений, он может задерживать также проникновение и развитие спор [36]. Это подтверждается результатами по ингибированию прорастания конидий C. sativus 0.1%-ным раствором СХ (табл. 2) и согласуется с проведенными ранее гистологическими исследованиями, которые показали, что на поверхности плодов цитрусовых, обработанных хитозаном, наблюдалось ограничение роста патогена и нарушение структуры его гиф [37].

На основании результатов, полученных в настоящей работе, можно утверждать, что после обработки растений пшеницы новыми препаратами Витаплан, содержащими СХ или его олигомеры, запускаются механизмы защитных реакций, которые выражаются в формировании химических и физических барьеров против атаки патогена. Кроме того, у обработанных растений пшеницы внедрение гриба в эпидермальный слой сдерживается в результате прямого ингибирования прорастания конидий фунгицидными компонентами метаболитных комплексов штаммов Bacillus. Композиция Витаплан + 0.1% СХ, которую получали смешиванием КЖ штаммов Bacillus subtilis после окончания ферментации с СХ (0.1%), обладала более высокой биологической активностью по сравнению с другими препаратами. Это связано с тем, что пленкообразующий полимер хитозан при нанесении на листья растений задерживал прорастание конидий C. sativus и проникновение патогена в ткани (табл. 2), что проявлялось в снижении степени пораженности растений. Таким образом, биологическая эффективность препарата Витаплана и препаратов с СХ обусловлена несколькими способами воздействия, каждый из которых потенциально может тормозить развитие болезней, что существенно повышает их защитный эффект.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности создания нового поколения экологически безопасных средств защиты растений на основе сочетания активных штаммов микроорганизмов–антагонистов и хитозанов для повышения биологической эффективности и расширения спектра действия препаративных форм, предназначенных для защиты растений от болезней.