Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 3, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 3, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 3, стр. 235-243

Эффект инактивации глиоксилатного шунта на биосинтез адипиновой кислоты штаммами Escherichia coli по обращенному β-окислению жирных кислот

А. Ю. Гулевич 1, *, А. Ю. Скороходова 1, В. Г. Дебабов 1

1 Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
117312 Москва, Россия

* E-mail: andrey.gulevich@gmail.com

Поступила в редакцию 28.11.2022
После доработки 12.12.2022
Принята к публикации 30.12.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

С использованием в качестве базового штамма Escherichia coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, ∆fadE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA получены штаммы-производные, способные к биосинтезу адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному пути β-окисления жирных кислот. Биосинтез рекомбинантными штаммами целевого соединения обеспечен при первичной конденсации ацетил-КоА и сукцинил-КоА под действием 3-оксоацил-КоА-тиолазы PaaJ и катализе финальной реакции цикла ацил-КоА дегидрогеназами FadE и FabI. Делеция в штаммах генов sucCD, кодирующих компоненты сукцинил-КоА-синтазы, не повышала относительной внутриклеточной доступности сукцинил-КоА для целевых биосинтетических реакций и не приводила к росту накопления рекомбинантами адипиновой кислоты. Секреция янтарной и яблочной кислот штаммами с нарушенным циклом трикарбоновых кислот сохранялась практически неизменной, что указывало на активность в клетках реакций глиоксилатного шунта, конкурирующих с реакциями цикла за изоцитрат, необходимый для формирования сукцинил-КоА. При инактивации в штаммах изоцитратлиазы, малатсинтаз А и G, а также бифункциональной киназы/фосфатазы изоцитратдегидрогеназы, за счет делеции генов aceBAK оперона и glcB, синтез адипиновой кислоты рекомбинантами повышался в три раза и достигал 0.33 мМ.

Ключевые слова: адипиновая кислота, β-окисление жирных кислот, глиоксилатный шунт, метаболическая инженерия, сукцинил-КоА, Escherichia coli

Адипиновая кислота является важным промышленно значимым соединением, способным служить удобным предшественником в последующем синтезе широкого спектра веществ с высокой добавленной стоимостью, включая любриканты, пластификаторы и фармацевтические субстанции. При этом, большая часть адипиновой кислоты, ежегодно производящейся в объемах превышающих 3.5 млн тонн, используется для получения нейлона-6,6 [1]. В настоящее время производство адипиновой кислоты основывается на нефтехимическом синтезе с использованием бензола в качестве предшественника [2]. В качестве экологически оправданной альтернативы рассматривался способ, предполагающий первичное биотехнологическое получение из возобновляемых источников углерода cis,cis-муконовой кислоты с ее последующей каталитической конверсией в адипиновую [3]. Действительно, возможность микробиологической конверсии глюкозы и глицерина в cis,cis-муконовую кислоту была продемонстрирована с использованием направленно сконструированных штаммов таких традиционных для промышленной биотехнологии микроорганизмов, как Eschericha coli и Saccharomyces cerevisiae [4–7]. Кроме того, был предложен потенциальный путь прямой биокаталитической конверсии субстрата в адипиновую кислоту через промежуточное формирование 2-оксоадипата, предполагающий первичную конденсацию ацетил-КоА с 2-оксоглутаратом [8]. Однако экспериментальная реализация соответствующей концепции на сегодняшний день не была продемонстрирована. Многообещающей альтернативой α-восстановлению 2-оксоадипата является образование адипиновой кислоты из адипил-КоА, сформированного в результате обращения биохимических реакций β-окисления, включающих, в том числе, обращенные реакции деградации фенилацетата или деградации жирных кислот. Формирование соответствующего Ко-А-предшественника в последовательности таких реакций предполагает первичную конденсацию ацетил-КоА и сукцинил-КоА с последующим превращением 3-оксоадипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА, затем в 2,3-дидегидроадипил-КоА и, в итоге, в адипил-КоА. Гидролиз тиоэфирной связи, ведущий к получению целевого соединения, может катализироваться, в таком случае, тиоэстеразами, обладающими необходимой субстратной специфичностью. В последние годы в клетках E. coli был успешно продемонстрирован синтез адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному пути деградации фенилацетата при оверэкспресси в базовых штаммах как нативных генов paa-оперона, так и вспомогательных генов других организмов [8–11]. В качестве таких вспомогательных генов в первую очередь использовались гены тиоэстераз из Acinetobacter baylyi [8] и Mus musculus [10, 11], а также гены ацил-КоА дегидрогеназ/еноил-КоА редуктаз из Clostridium acetobutylicum [10] и Treponema denticola [9, 11]. Вместе с тем, не было показано биосинтеза адипиновой кислоты клетками E. coli при катализе реакций формирования адипил-КоА ферментами β-окисления жирных кислот (БОЖК).

Поскольку от эффективности первичной стадии формирования 3-оксоадипил-КоА напрямую зависит эффективность протекания последующих реакций обращенного β-окисления, были предприняты попытки повышения в клетках соответствующих адипат-секретирующих рекомбинантов внутриклеточной доступности сукцинил-КоА. Этот метаболит является интермедиатом цикла трикарбоновых кислот и, в данной связи, подходы к повышению его внутриклеточной доступности для реакций обращенного β-окисления основывались, в первую очередь, на предотвращении утилизации сформированного сукцинил-КоА в последующих реакциях цикла за счет инактивации сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.5.1) [9] или сукцинил-КоА синтетазы (КФ 6.2.1.5) [12]. При этом, известно, что активность 2-оксоглутарат дегидрогеназы (КФ 1.2.4.2), ответственной за формирование сукцинил-КоА, в клетках E. coli снижена при росте на средах содержащих глюкозу [13], и один из ключевых предшественников соответствующего тиоэфира, изоцитрат, может вовлекаться в реакции глиокилатного шунта, активирующиеся при интенсивном формировании в клетке ацетил-КоА [14].

Цель работы – конструирование штаммов E. coli способных к биосинтезу адипиновой кислоты из глюкозы с участием ферментов β-окисления жирных кислот и оценка влияния инактивации глиоксилатного шунта на биосинтез рекомбинантами целевого соединения.

МЕТОДИКА

Реактивы. В работе использовали рестриктазу BglII, ДНК-полимеразу Taq, Т4 ДНК-лигазу (“Thermo Scientific”, Литва), а также высокоточную ДНК-полимеразу Kapa HiFi (“Roche”, Швейцария). ПЦР-продукты очищали проведением электрофореза в агарозном геле и выделяли с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (“Qiagen”, США). Олигонуклеотиды (“Евроген”, Россия) представлены в табл. 1. Компоненты питательных сред, соли и другие реактивы были произведены фирмами “Panreac” (Испания) и “Sigma” (США).

Таблица 1.

Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе

№ Последовательность
P1 5'-tgcgacagatctctcacctaccaaacaatgccc-3'
P2 5'-atgtatatctccttcacggccaatgcttcgtttc-3'
P3 5'-gcgtacgaattccgtcacaaataaaggcttcacgcatatgtatatctccttcacggccaatg-3'
P4 5'- ctagtaagatcttgaagcctgcttttttatactaagttgg-3'
P5 5'-caccgcatcggcggcaccattacaggagaagcctgacgctcaagttagtataaaaaagctgaac-3'
P6 5'-gcatcggcggcaccattacag-3'
P7 5'-gtagcgaccaattggcgtacg-3'
P8 5'-atgaacttacatgaatatcaggcaaaacaacttttcgctcaagttagtataaaaaagctgaac-3'
P9 5'-ttatttcagaacagttttcagtgcttcaccgatatctgaagcctgcttttttatactaagttgg-3'
P10 5'-ctacgggaccaccaatgtagg-3'
P11 5'-catacgatggccaaccatgtc-3'

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды. Штамм E. coli K-12 MG1655 (ВКПМ B-6195) и ранее сконструированные штаммы E. coli BOX3.1 Δ4 Ptrc-id-4-fadE и BOX3.1 Δ4 Ptrc-id-4-fabI [15] с измененной регуляцией экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты аэробного β-окисления жирных кислот и тиоэстеразу II, а также лишенные путей смешанно-кислотного брожения и активности неспецифичной тиоэстеразы YciA, были использованы в качестве исходных для конструирования всех полученных в работе штаммов. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды представлены в табл. 2. Для культивирования бактерий применяли полноценные среды LB, SOB, SOC и минимальную среду М9 [16] c добавлением, при необходимости, ампициллина (100 мкг/мл) или хлорамфеникола (30 мкг/мл).

Таблица 2.

Штаммы и плазмиды, сконструированные и использованные в работе

Объект Генотип Ссылка
Штамм    
MG1655 Штамм E. coli дикого типа (ВКПМ B-6195) ВКПМ
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadE [15]
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, ∆fadE, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fabI [15]
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadE, PL-SDφ10-paaJ Данная работа
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, ∆fadE, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fabI, PL-SDφ10-paaJ Данная работа
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ ∆sucCD E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadE, PL-SDφ10-paaJ, ∆sucCD Данная работа
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ ∆sucCD E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, ∆fadE, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fabI, PL-SDφ10-paaJ, ∆sucCD Данная работа
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ ∆aceBAK ∆glcB E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadE, PL-SDφ10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB Данная работа
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ ∆aceBAK ∆glcB E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, ∆fadE, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fabI, PL-SDφ10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB Данная работа
Плазмида    
pMW118-(λattL-Cm-λattR) pSC101, bla, cat, λattL-cat-λattR [18]
pKD46 pINT-ts, bla, ParaB-λgam-bet-exo [17]
pMWts-Int/Xis pSC101-ts, bla, PR-λxis-int, cIts857 [19]

Конструирование штаммов. Введение целевых модификаций в хромосому E. coli осуществляли с использованием методики, описанной ранее [17].

Конструирование фрагмента ДНК для замены нативной регуляторной области гена paaJ искусственным генетическим элементом PL-SDφ10, содержащим промотор PL фага лямбда и эффективный сайт связывания рибосом гена φ10 из фага Т7, проводили в несколько стадий. На первой стадии, с помощью ПЦР был получен фрагмент ДНК, содержащий участок узнавания BglII, промотор PL, последовательность SD гена φ10 из фага Т7 и 36 нуклеотидов, комплементарных 5'-концу кодирующей области гена paaJ.

Фрагмент получали в два этапа. На первом этапе, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК фага лямбда и праймеров P1 и P2 был получен фрагмент ДНК, содержащий участок узнавания BglII, промотор PL и часть последовательности SD гена φ10 из фага Т7. Полученный ПЦР-продукт служил матрицей в следующем раунде ПЦР с использованием праймеров P1 и P3. Праймер P3 содержал область комплементарную 3'-концу промотора PL, последовательность SD гена φ10 из фага Т7 и 36 первых нуклеотидов из рамки считывания гена paaJ. Параллельно осуществляли вторую стадию конструирования фрагмента ДНК. Фрагмент ДНК, содержащий участок узнавания BglII, маркер устойчивости к хлорамфениколу (ген cat) и 36 нуклеотидов, гомологичных участку ДНК, непосредственно предшествующему кодирующей области гена paaJ, был получен ПЦР с использованием праймеров P4 и P5 и плазмиды pMW118-(λattL-Cm-λattR) [18] в качестве матрицы. Полученные фрагменты ДНК были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII и лигированы Т4 ДНК-лигазой. Продукт лигирования амплифицировали с использованием праймеров P3 и P5. Полученный ПЦР-продукт был интегрирован в хромосому штамма E. coli MG1655, несущего плазмиду-помощник pKD46 [17]. Соответствие запланированной и экспериментально полученной нуклеотидной последовательности нового регуляторного элемента, введенного перед кодирующей областью гена paaJ, было подтверждено секвенированием с помощью праймеров P6 и P7.

Линейный фрагмент ДНК для инактивации генов sucCD, содержащий маркер устойчивости к хлорамфениколу (ген cat), получали при помощи ПЦР с использованием праймеров P8 и P9 и плазмиды pMW118-(λattL-Cm-λattR) в качестве матрицы. Полученный фрагмент ДНК был интегрирован в хромосому штамма E. coli MG1655, несущего плазмиду-помощник pKD46. Факт инактивации генов sucCD в хромосомах отобранных интегрантов подтверждали ПЦР-анализом с помощью локус-специфичных праймеров P10 и P11.

Соответствующие индивидуальные генетические модификации были введены в состав хромосом целевых рекомбинантных штаммов с помощью P1-зависимых трансдукций [16]. В случае инактивации генов aceBAK и glcB использовали ранее полученные препараты P1-трансдуцирующих фагов, содержащих соответствующие целевые маркированные модификации [19]. Удаление маркера, фланкированного att-сайтами фага лямбда, из хромосом целевых штаммов, проводили с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis, как описано ранее [20]. Трансформацию штаммов плазмидами осуществляли по стандартной методике.

Культивирование штаммов. Рекомбинантные штаммы выращивали в течение ночи в среде М9, содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°C. Для микроаэробного культивирования по 5 мл полученных ночных культур разбавляли в 10 раз, добавляя 45 мл среды М9, содержащей 10 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта и 2.5 г/л NaHCO3. Полученные культуры инкубировали в колбах объемом 750 мл, закрытых ватными пробками на роторной качалке при 250 об./мин в течение 8 ч при 37°C. Насыщение среды кислородом оценивали в контрольных колбах с соответствующими культурами при инкубации в присутствии резазурина. Для индукции экспрессии генов, находящихся под контролем LacI-зависимого промотора Ptrc-ideal-4, спустя 3 ч от начала инкубации в среды культивирования добавляли изопропил-β-D-тиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1.0 мМ.

Клеточные суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин, в полученных супернатантах определяли концентрации секретированных метаболитов и остаточной глюкозы. Все эксперименты повторялись не менее трех раз.

Аналитические методы. Концентрации органических кислот в культуральных жидкостях, освобожденных от биомассы центрифугированием, определяли методом ВЭЖХ с использованием системы “Waters” HPLC system (США). Применяли ион-эксклюзионную колонку Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) (“Phenomenex”, США) с детекцией при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы использовали водный раствор серной кислоты (2.5 мМ) со скоростью потока 0.5 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы система была укомплектована рефрактивным детектором “Waters” 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (“Waters”, США). Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил-вода в соотношении 75/25 об./об. при скорости потока 1.0 мл/мин.

Идентификацию и количественный анализ масляной и адипиновой кислот в культуральных жидкостях осуществляли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Пробоподготовка включала экстракцию целевых аналитов из культуральной жидкости, упаривание экстракта и дериватизацию с получением триметилсилильных производных. Жидко-жидкостная микроэкстракция этилацетатом была использована для экстракции целевых соединений. Перед экстракцией аликвоту образца смешивали с водными растворами внутренних стандартов (валериановой и пимелиновой кислот), 2 М раствором хлорида натрия и доводили до рН 1–2 с помощью 2 М соляной кислоты. Этилацетатный экстракт смешивали с сухим сульфатом натрия, центрифугировали и полученный супернатант упаривали в вакуумном испарителе до минимального объема при 30°C. Силилирование проводили инкубируя остаток после стадии упаривания с N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамидом, содержащим 1% триметилхлорсилана при 60°С в течение 15 мин.

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на газовом хроматографе Agilent 6890N, укомплектованном автосамплером 7683B и масс-селективным детектором Agilent 5975 MSD (“Agilent”, США). Система была оснащена капиллярной колонкой Agilent DB-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки 0.25 мкм. В качестве газа носителя использовался гелий с постоянной скоростью потока 1.0 мл/мин. Проба объемом 1 мкл вводилась в испаритель в режиме деления потока 1 : 10. Температура испарителя составляла 230°C. Температурная программа термостата колонки: начальная изотерма 2 мин при 60°C с последующим линейным градиентом до 200°C со скоростью 5°C /мин, затем до 250°C со скоростью 15°C /мин, конечная изотерма 5 мин при 250°C. Для ионизации аналитов была использована ионизация электронами (70 eV). Температура ионного источника масс-спектрометра составляла 230°C. Температура интерфейса масс-спектрометра составляла 250°C. Масс-анализатор функционировал в режиме селективного детектирования (145 и 73 m/z для масляной кислоты, 275 и 172 m/z для адипиновой кислоты, 159 m/z для валериановой кислоты, 289 m/z для пимелиновой кислоты). Сбор и обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Agilent MSD ChemStation. Аналитическая система была откалибрована в диапазоне 0.01–0.10 мг/мл для обоих аналитов с пределом детектирования 0.002 мг/мл. Для аппроксимации калибровочных данных использовали взвешенную линейную регрессию, был получен квадрат коэффициента корреляции R2 = 0.993. Целевые аналиты идентифицировали, сравнивая полученные данные с характеристиками соответствующих стандартов (время удерживания и масс-спектр).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве базовых штаммов для конструирования производных, способных к биосинтезу адипиновой кислоты из глюкозы с участием ферментов БОЖК и последующей оценки влияния инактивации глиоксилатного шунта на биосинтез рекомбинантами целевого соединения, были использованы ранее сконструированные штаммы E. coli BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI (табл. 2) [15]. В данных штаммах пути смешанно-кислотного брожения, конкурирующие с реакциями обращенного БОЖК за ключевые метаболиты предшественники, пировиноградную кислоту и ацетил-КоА, были инактивированы за счет делеций генов ackA, pta, poxB, ldhA и adhE. Активность ферментов, способных катализировать реакции обращенного БОЖК была повышена в штаммах в результате замены нативных регуляторных областей соответствующих генов, atoB, fadB, fadE и fabI, эффективными искусственными регуляторными элементами Ptrc-ideal-4-SDφ10 и PL-SDφ10. Также, для обеспечения возможности конверсии терминальных КоА-продуктов обращенного БОЖК в соответствующие карбоновые кислоты, в штаммах была усилена экспрессия гена тиоэстеразы II, tesB, тогда как ген неспецифичной тиоэстеразы YciA был делетирован с целью предотвращения нежелательного гидролиза тиоэфирной связи интермедиатов обращенного цикла. В результате, при ферментации в пробирках штаммы были способны к синтезу из глюкозы до ~0.5 мМ масляной кислоты, в результате однократного функционального обращения БОЖК [15], и могли служить удобными предшественниками для конструирования на их основе модельных продуцентов адипиновой кислоты.

Стехиометрически сбалансированный биосинтез 2 молекул адипиновой кислоты из 3 молекул глюкозы по обращенному БОЖК предполагает расход 4 молекул НАДН. При этом, гликолитическая генерация необходимых предшественников обеспечивает формирование 6 соответствующих восстановленных эквивалентов, аэробная конверсия четырех молекул пировиноградной кислоты в ацетил-КоА – еще четырех, и последующее образование двух сукцинил-КоА в реакциях ЦТК также сопровождается формированием 4 дополнительных НАД(Р)Н. Однако при аэрации основная часть восстановленных эквивалентов, сформированных в ходе катаболизма субстрата, окисляется кислородом, выступающим в качестве финального акцептора электронов, в результате действия дыхательной цепи переноса электронов. С другой стороны, при анаэробиозе, несмотря на сниженное формирование восстановленных эквивалентов за счет конверсии пировиноградной кислоты в ацетил-КоА под действием пируват-формиат-лиазы (КФ 2.3.1.54), внутриклеточный окислительно-восстановительный статус будет препятствовать не только биосинтезу целевого соединения, но и эффективному потреблению субстрата, в силу ингибирования гликолиза избыточным внутриклеточным пулом НАДН [21]. Таким образом, ни полностью анаэробные, ни полностью аэробные условия не могли рассматриваться как оптимальные для биосинтеза адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному БОЖК ранее сконструированными штаммами BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI. В данной связи в настоящей работе биосинтетический потенциал штаммов оценивали при микроаэробном культивировании. С целью повышения интенсивности формирования в клетках щавелевоуксусной кислоты (ЩУК), необходимой для вовлечения ацетил-КоА в реакции ЦТК, ведущие к образованию сукцинил-КоА, в среды дополнительно вносили 2.5 г/л NaHCO3.

В соответствующих условиях культивирования базовые штаммы не секретировали заметных количеств адипиновой кислоты, несмотря на присутствие источника CO2 в среде (табл. 3). Это могло быть связано как с недостаточной активностью ЦТК, генерирующего сукцинил-КоА, так и с субстратной специфичностью 3-оксоацил-КоА-тиолазы AtoB (КФ 2.3.1.16), ответственной в штаммах за первичную конденсацию ацетил- и ацил-КоА. При этом, присутствие в средах культивирования штаммов значимых количеств янтарной кислоты (табл. 3) свидетельствовало, скорее, в пользу правомочности второго предположения. Действительно, в предшествующих работах [8–11] биосинтез адипиновой кислоты по обращенному β-окислению направленно сконструированными штаммами E. coli достигался при усилении в рекомбинантах экспресси гена другой нативной тиолазы – PaaJ (КФ 2.3.1.174), обладающей подтвержденной способностью к образованию 3-оксоадипил-КоА. В данной связи, экспрессия гена paaJ была усилена в базовых штаммах BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI в результате замены его природной регуляторной области искусственным генетическим элементом PL-SDφ10, содержащим сильный конститутивный промотор фага лямбда и эффективный сайт связывания рибосом гена 10 из фага Т7.

Таблица 3.

Концентрации метаболитов, секретированных сконструированными штаммами при микроаэробной утилизации глюкозы*

Штамм Глюкоза, мМ Пировиноградная кислота, мМ Уксусная кислота, мМ Яблочная кислота, мМ Янтарная кислота, мМ Масляная кислота, мкМ Адипиновая кислота, мкМ
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE 41.9 ± 2.4 20.5 ± 1.2 12.4 ± 0.8 0.9 ± 0.1 5.1 ± 0.3 512.1 ± 46.3 н.д.
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI 42.3 ± 2.1 20.8 ± 1.1 12.6 ± 0.9 1.1 ± 0.1 5.0 ± 0.2 476.6 ± 42.0 н.д.
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ 41.6 ± 2.0 20.9 ± 1.1 12.2 ± 0.7 0.9 ± 0.1 4.9 ± 0.2 394.3 ± 36.5 108.3 ± 10.5
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ 42.1 ± 2.3 21.1 ± 1.0 12.8 ± 0.8 1.0 ± 0.1 5.2 ± 0.3 362.7 ± 34.8 101.4 ± 10.2
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ ΔsucCD 41.3 ± 2.1 21.2 ± 1.0 12.6 ± 0.8 1.2 ± 0.1 4.0 ± 0.2 389.2 ± 35.6 112.1 ± 11.0
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ ΔsucCD 41.8 ± 2.2 21.4 ± 1.2 12.7 ± 0.9 1.1 ± 0.1 4.1 ± 0.2 366.1 ± 36.4 103.7 ± 9.9
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ ΔaceBAK ΔglcB 41.5 ± 2.1 21.7 ± 1.2 13.0 ± 1.1 н.д. 1.0 ± 0.1 175.0 ± 16.9 326.5 ± 30.6
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ ΔaceBAK ΔglcB 42.1 ± 2.3 22.2 ± 1.1 13.3 ± 1.0 н.д. 0.9 ± 0.1 136.4 ± 12.5 332.8 ± 31.3

* Приведены стандартные отклонения для трех независимых экспериментов; н.д. – не детектировано.

Соответствующие штаммы BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ в ходе микроаэробной утилизации глюкозы секретировали в среду около 100 мкМ адипиновой кислоты при пропорциональном снижении накопления масляной кислоты (табл. 3). При этом, как и в случае масляной кислоты, формирование 6-углеродной адипиновой кислоты штаммом BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI было несколько снижено по сравнению со штаммом BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE. Это наблюдение противоречило ранее полученным данным о предпочтительном формировании в результате функционального обращения БОЖК 6- и 8-углеродных карбоновых кислот штаммами экспрессирующими в качестве ацил-КоА-дегидрогеназы белок FabI [15]. Тем не менее, предшествующие результаты были получены в случае продукции рекомбинантами монокарбоновых кислот и могли не отражать специфичности конкретных ферментов к соответствующим КоА-производным, содержащим ω-карбоксильную группу.

В данной связи следует отметить, что формирование янтарной кислоты штаммами с усиленой экспрессией paaJ не снижалось, указывая либо на неспособность штаммов эффективно вовлекать в обращенные реакции БОЖК соответствующий ω-функионализированный тиоэфир, сукцинил-КоА, либо на его сниженную доступность в клетках рекомбинантов. Сукцинил-КоА формируется в ЦТК из 2-оксоглутарата в результате действия 2-оксоглутарат дегидрогеназы и, в дальнейшем, туннелируется в последующие реакции цикла сукцинил-КоА-синтетазой. Таким образом, инактивация последнего фермента потенциально могла повысить внутриклеточную доступность сукцинил-КоА для целевых реакций обращенного БОЖК.

При инактивации в клетках штаммов BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ генов sucCD, кодирующих компоненты сукцинил-КоА синтетазы, продукция целевого соединения рекомбинантами практически не изменилась, тогда как уровни накопления штаммами янтарной кислоты несколько снизились (табл. 3). Однако это снижение составляло лишь около 20%, указывая на незначительный вклад активности сукцинил-КоА синтетазы в формирование штаммами данного дикарбоксилата. Действительно, известно, что у клеток E. coli экспрессия генов sucABCD оперона, кодирующих компоненты 2-оксоглутарат дегидрогеназы и сукцинил-КоА синтетазы, резко снижена при росте в богатых и содержащих глюкозу средах [13]. Таким образом, за формирование штаммами BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ янтарной кислоты в первую очередь были ответственны, по-видимому, реакции глиоксилатного шунта. Секреция рекомбинантами заметных количеств яблочной кислоты подтверждала это предположение. Ключевые ферменты, катализирующие реакции глиоксилатного шунта, изоцитрат лиаза (КФ 4.1.3.1) и малат синтаза А (КФ 2.3.3.9), кодируются в клетках E. coli генами aceA и aceB, составляющими вместе с геном aceK, кодирующим бифункциональную киназу/фосфатазу изоцитрат дегидрогеназы, aceBAK оперон. Последний фермент регулирует активность изоцитрат дегидрогеназы, перераспределяя поток углерода между окислительным ЦТК и глиоксилатным шунтом [22]. Экспрессия генов aceBAK оперона подвержена комплексной транскрипционной регуляции, включающей действие таких белков как IclR, FadR, FruR, ArcAB и CRP-цАМФ [23, 24]. В условиях высокой доступности глюкозы, экспрессия генов aceBAK оперона репрессируется специфическим транскрипционным регулятором, белком IclR. При этом, в случае сниженной доступности глюкозы, экспрессия оперона активируется глобальным регулятором CRP-цАМФ [24]. Более того, повышенная интенсивность формирования в клетках ацетил-КоА также способствует активации транскрипции генов aceBAK оперона [23]. Следует отметить, что исследуемые штаммы синтезировали значительные количества уксусной кислоты (табл. 3), что предполагало высокий уровень накопления в клетках ацетил-КоА, который, в отсутствие у клеток фосфотрансацетилазы Pta, ацетат киназы AckA и неспецифичной тиоэстеразы YciA, конвертировался в соответствующее производное под действием других клеточных ферментов, способных проявлять тиоэстеразную активность, таких как белки YciA, YbgC и YdiI с широкой субстратной специфичностью в отношении ацил-производных кофермента А [25–27]. Таким образом, с учетом того, что реакции глиоксилатного шунта, ведущие к формированию янтарной и яблочной кислот, протекают без промежуточного формирования сукцинил-КоА, расходуя вместе с тем его предшественник, изоцитрат, гены aceBAK оперона были делетированны в штаммах BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ. Также в штаммах был делетирован ген glcB, кодирующий малат синтазу G.

В результате введения в штаммы соответствующих генетических модификаций, секреция яблочной кислоты полученными производными BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fadE PL-paaJ ΔaceBAK ΔglcB и BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ ΔaceBAK ΔglcB прекращалась, а накопление янтарной кислоты падало в четыре раза (табл. 3). При этом, штаммы синтезировали адипиновую кислоту в количествах, возросших в три раза (до ~0.3 мМ) на фоне резкого снижения формирования рекомбинантами масляной кислоты. Таким образом, инактивация глиоксилатного шунта способствовала биосинтезу рекомбинантами целевого соединения за счет обеспечения в клетках предпочтительной возможности формирования сукцинил-КоА в реакциях оксидативного ЦТК при исключении вовлечения предшественника в реакции, не связанные с образованием соответствующего тиоэфира. Действительно, сохраняющаяся секреция янтарной кислоты штаммами, лишенными активности глиоксилатного шунта указывала на формирование данного дикарбоксилата в ЦТК из сукцинил-КоА, образованного в результате действия 2-оксоглутарат дегидрогеназы. Вместе с тем, наблюдаемое остаточное формирование сконструированными штаммами масляной кислоты указывало на не полное вовлечение сукцинил-КоА в реакции обращенного БОЖК. Это могло объясняться как неоптимальной субстратной специфичностью ферментов, вовлеченных в формирование целевого соединения, так и недостаточными уровнями их активности в клетке. В рамках подходов рациональной метаболической инженерии соответствующие проблемы могут быть решены как тонкой оптимизацией экспрессии целевых генов, так и выбором альтернативных генов-мишеней для их экспрессии в перспективных рекомбинантах.

В результате проведенных исследований сконструированы штаммы E. coli способные к биосинтезу адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному пути БОЖК. Показано позитивное влияние инактивации глиоксилатного шунта на биосинтез целевого соединения полученными рекомбинантами. Выявлена значимость внутриклеточной доступности сукцинил-КоА, сформированного в реакциях ЦТК для эффективного биосинтеза конечного продукта по обращенному БОЖК. Достигнуты уровни синтеза адипиновой кислоты, превосходящие соответствующие уровни синтеза масляной кислоты, одновременно формируемой штаммами по обращенному β-окислению жирных кислот без участия сукцинил-КоА.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда (проект № 22-14-00040).

Список литературы

  1. Lang M., Li H. // ChemSusChem. 2022. V. 15. № 1. e202101531. https://doi.org/10.1002/cssc.202101531

  2. Skoog E., Shin J.H., Saez-Jimenez V., Mapelli V., Olsson L. // Biotechnol. Adv. 2018. V. 36. № 8. P. 2248–2263.

  3. Thomas J.M., Raja R., Johnson B.F., O’Connell T.J., Sankar G., Khimyak T. // Chem. Commun. 2003. V. 21 № 10. P. 1126–1127.

  4. Lin Y., Sun X., Yuan Q., Yan Y. // Metab. Eng. 2014. V. 23. P. 62–69.

  5. Zhang H., Li Z., Pereira B., Stephanopoulos G. // Microb. Cell. Factories. 2015. V. 14. № 1. https://doi.org/10.1186/s12934-015-0319-0

  6. Weber C., Brueckner C., Weinreb S., Lehr C., Essl C., Boles E. // Appl. Environ. Microbiol. 2012. V. 78. P. 8421–8430.

  7. Curran K.A., Leavitt J.M., Karim A.S., Alper H.S. // Metab. Eng. 2013. V. 15. P. 55–66.

  8. Kallscheuer T., Gätgens J., Lübcke M., Pietruszka J., Bott M., Polen T. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2017. V. 101. № 6. P. 2371–2382.

  9. Yu J.L., Xia X.X., Zhong J.J., Qian Z.G. // Biotechnol. Bioeng. 2014. V. 111. № 12. P. 2580–2586.

  10. Babu T., Yun E.J., Kim S., Kim D.H., Liu K.H., Kim S.R., Kim K.H. //Proc. Bioch. 2015. V. 50. № 12. P. 2066–2071.

  11. Cheong S., Clomburg J.M., Gonzalez R. // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 5. P. 556–561.

  12. Zhao M., Huang D., Zhang X., Koffas M.A.G., Zhou J., Deng Y. // Metab. Eng. 2018. V. 47. P. 254–262.

  13. Park S.J., Chao G., Gunsalus R.P. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 4138–4142.

  14. Skorokhodova A.Y., Gulevich A.Y., Morzhakova A.A., Shakulov R.S., Debabov V.G. // Biotechnol. Lett. 2013. V. 35. № 4. P. 577–583.

  15. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Дебабов В.Г. // Прикл. биохимия и микробиология. 2022. Т. 58. № 4. С. 330–337.

  16. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. 1659 p.

  17. Datsenko K.A., Wanner B.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 12. P. 6640–6645.

  18. Каташкина Ж.И., Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гулевич А.Ю., Минаева Н.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Машко С.В. // Молекулярная биология. 2005. Т. 39. № 5. С. 823–831.

  19. Скороходова А.Ю., Гулевич А.Ю., Дебабов В.Г. // Прикл. биохимия и микробиология. 2018. Т. 54. № 3. С. 244–252.

  20. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Ермишев В.Ю., Крылов А.А., Минаева Н.И., Полонская З.М., Зименков Д.В., Бирюкова И.В., Машко С.В. // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 547–557.

  21. Vemuri G.N., Altman E., Sangurdekar D.P., Khodursky A.B., Eiteman M.A. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 3653–3661.

  22. Laporte D.C., Stueland C.S., Ikeda T.P. // Biochimie. 1989. V. 71. № 9–10. P. 1051–1057.

  23. Cronan J.E., Laporte D. // Tricarboxylic Acid Cycle and Glyoxylate Bypass, in: Neidhardt F. (Ed.) Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, Washington: ASM Press, 1996. P. 206–216.

  24. Waegeman H., Beauprez J., Moens H., Maertens J., De Mey M., Foulquié-Moreno M.R., Heijnen J.J., Charlier D., Soetaert W. // BMC Microbiol. 2011. V. 11. № 70. https://doi.org/10.1186/1471-2180-11-70

  25. Clomburg J.M., Vick J.E., Blankschien M.D., Rodríguez-Moyá M., Gonzalez R. // ACS Synth. Biol. 2012. V. 1. P. 541–554.

  26. Zhuang Z., Song F., Zhao H., Li L., Cao J., Eisenstein E., Herzberg O., Dunaway-Mariano D. // Biochemistry. 2008. V. 47. № 9. P. 2789–2796.

  27. Chen M., Ma X., Chen X., Jiang M., Song H., Guo Z. // J. Bacteriol. 2013. V. 195. № 12. P. 2768–2775.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал