Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 3, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 3, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 3, стр. 244-252

Выявление “некультивируемых” клеток Mycobacterium tuberculosis культуральными методами

Г. Р. Демина 1, *, М. О. Шлеева 1, Д. И. Багаева 1, Г. Н. Вострокнутова 1, А. С. Капрельянц 1

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

* E-mail: Galyademina@yandex.ru

Поступила в редакцию 10.07.2022
После доработки 18.08.2022
Принята к публикации 10.09.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Выявлены особенности реактивации “некультивируемых” клеток (НК) Mycobacterium tuberculosis (МТБ) для последующего размножения в жидкой среде, а также предложен подход количественной детекции таких клеток культуральными методами. После инокулирования, полученных in vitro НК МТБ в стандартную жидкую среду Сотона, наблюдалась продолжительная (до 20 сут) лаг-фаза, при которой размножение клеток отсутствовало. В течение лаг-фазы клетки секретировали вещества неустановленной природы, тормозящие или полностью прекращающие реактивацию и рост культур при исходных концентрациях НК выше 107–108 кл./мл. Введение мясопептонного бульона (3.25 г/л) в стандартную среду Сотона со сниженной в 10 раз концентрацией глицерина существенно стимулировало реактивацию и размножение НК при их инокулировании в концентрациях выше порогового значения. Такая модификация состава среды позволяла выявлять до 103 раз больше клеток в популяции МТБ методом наиболее вероятного числа клеток (НВЧК). Увеличение числа детектируемых НК в популяции (в среднем 2.5 порядка) достигалось также добавлением в среду для реактивации рекомбинантного белка RpfB (5 нг/мл), одного из белков семейства Rpf – факторов реактивации покоящихся бактерий. Возможно, действие Rpf связано с продуктами его ферментативной активности, поскольку увеличение НВЧК в популяции НК наблюдалось также при добавлении продуктов гидролиза пептидогликана (ПГ) микобактерий, полученных совместным действием RpfB и эндопептидазы RipA. Подобный эффект оказывало также добавление озвученных фрагментов пептидогликана (ФПГ) в концентрации до 1 мкг/мл. Полученные результаты могут быть использованы в качестве подходов для оптимизации состава жидких сред и условий культивирования с целью выявления возбудителя туберкулеза в состоянии “некультивируемости” в клинических образцах.

Ключевые слова: M. tuberculosis, “некультивируемые” клетки, лаг-фаза, реактивация, белки Rpf, фрагменты пептидогликана

В настоящее время диагностика туберкулеза (ТБ) базируется, в том числе, на микробиологическом обнаружении возбудителя с помощью культуральных методов в жидкостях пациента (в основном в мокроте для легочных форм ТБ). Общепринятый “золотой стандарт”, используемый для подтверждения наличия инфекционного агента, предусматривает отбор биопробы, ее внесение в селективную питательную среду, подращивание клеток возбудителя до достаточно высоких концентраций и заключительную характеристику их видовой принадлежности посредством специфического окрашивания, микроскопии и др. В распространенной в клинике автоматической системе BACTEС наличие МТБ в образцах оценивают по дыхательной активности бактериальных клеток после их длительного (до 20 сут) культивирования в жидкой среде [1]. Однако на практике, в таких исследованиях проблемой является получение ложноотрицательных результатов, причины которых не совсем ясны. В ряде публикаций эту проблему связывали с так называемой “некультивируемостью” микобактерий, возникающей в результате стресса, в том числе при контакте с макроорганизмом или антибиотиками. В экспериментах in vitro было выявлено, что такие НК нуждаются в специальной процедуре реактивации перед их размножением [2], что, вполне вероятно, является необходимой процедурой для выявления бактерий в биопробах пациентов. Наличие таких форм может требовать более длительного времени культивирования для их обнаружения, чем в существующих протоколах. О наличии НК МТБ в биообразцах свидетельствуют данные Медлар с соавт. [3], которые сообщили, что поврежденные органы (легкие, селезенка) содержали микобактерии, которые могли быть выявлены микроскопически, но не образовывали колоний при высеве на плотные среды. Эти наблюдения подтверждены многими другими авторами [4, 5]. Бикетовым с соавт. было показано, что клетки МТБ, изолированные из культивируемых макрофагов, были неспособны к формированию колоний на агаризованной среде, но могли расти в жидкой среде после инкубации с белком Rpf [6]. Дилон с соавт. продемонстрировали, что в тканях животных с хронической формой туберкулеза лишь 1–5% изолированных микобактерий образовывали колонии на плотных средах, в то же время “оживление” этих клеток в жидкой среде приводило к увеличению численности культивируемых форм в 20–100 раз [7]. Было продемонстрировано наличие НК МТБ в мокроте пациентов [8], которые могли быть реактивированы в жидкой среде только в присутствии веществ неясной природы, содержащихся в фильтрате, полученном из культуры активных клеток МТБ [9].

Таким образом, проблема изначально “некультивируемых” или поврежденных клеток возбудителя туберкулеза, которые являются жизнеспособными и потенциально опасными, но не выявляются существующими культуральными методами, является актуальной для медицинской диагностики. В клинических образцах эти формы МТБ могут составлять значительную часть от всей популяции микобактерий [8].

Цель настоящей работы состоит в изучении особенностей реактивации клеток микобактерий и последующего их размножения на примере НК МТБ, полученных в экспериментальной модели in vitro, а также на поиск подходов для детекции таких клеток культуральными методами.

МЕТОДИКА

Культивирование Mycolicibacterium smegmatis mc2 155 и Mycobacterium tuberculosis H37Rv. M. smegmatis mc2 155 выращивали на стандартной среде Сотона pH 7.0 (г/л): KH2PO4 – 0.5, MgSO4 – 0.5, L-аспарагина – 4.0, глицерина – 60 мл, цитрата железа (III) аммония – 0.05, Na3C6H5O7 – 2.0, (г/л): 1% ZnSO4 – 0.1 мл) при 37°С, в колбах с 200 мл среды при перемешивании (200 об./мин). Для предотвращения агрегации клеток в среду вносили Твин-80 (“Sigma”, США) в концентрации 0.05%.

Mycobacterium tuberculosis H37Rv (получен из Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАН) выращивали аналогичным образом, однако, кроме Твин-80 (0.05%) среда Сотона включала ростовую добавку ADC (смесь бычьего сывороточного альбумина, глюкозы и каталазы, “Himedia”, Индия) в соотношении 1 : 10. В отдельных экспериментах в среду вносили определенное количество мясопептонного бульона (МПБ) (“Himedia”, Индия) и изменяли концентрацию глицерина.

Многокомпонентная среда МОД4 была приготовлена согласно авторской рецептуре [10].

Получение НК МТБ. Культуру МТБ выращивали 8–11 сут при 37°C с перемешиванием (200 об./мин) в колбах объемом 100 мл, содержащих 40 мл среды Сотона и 0.05%-ный Твин-80 с добавлением ростовой добавки ADC. Эту культуру использовали для пересева (конечная концентрация 105–106 кл./мл среды) в модифицированную среду Сотона, pH 6.0, с ADC и с тилоксаполом (0.025%) вместо Твин-80. Культуру МТБ инкубировали в течение 40–60 сут при 37°С с перемешиванием (200 об./мин). Периодически проводили измерение pH среды. При повторном достижении значения pH 6.0–6.2 в стационарной фазе, культуру переносили в закрытые пластиковые фальконы на 50 мл и добавляли 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (МЭС) до конечной концентрации 20 мМ. Культуру МТБ хранили в статических условиях при комнатной температуре в темноте от 4 мес до 1 г.

Оценка метаболической активности МТБ. Метаболическую активность МТБ оценивали по интенсивности включения в клетки [5.6–3H] урацила. К 1 мл культуры добавляли 1 мкл (0.02 мкмоль, 1 мкКи) меченого урацила. Инкубацию культуры с внесенной меткой проводили в течение 20 ч с перемешиванием при 37°С. Клетки отмывали 3 раза 7%-ной ТХУ и 96%-ным этанолом на стеклянных фильтрах GFC (“Whatman”, США), которые затем помещали в сцинтилляционную жидкость (Ultima GOLDTM, “PerkinElmer”, США). Уровень радиоактивности измеряли на счетчике LS6500 (“Beckman Coulter”, США).

Число колониеобразующих единиц (КОЕ). Число колониеобразующих единиц определяли по высевам на плотную питательную (1.5% агара) среду МПБ (для M. smegmatis) или Сотона с ADC (для МТБ) по 100 мкл суспензии из серии последовательных десятикратных разведений исходной культуры. КОЕ для МТБ подсчитывали через 3–4 нед. инкубации при 37°С после высева, определяя его как среднее из результатов подсчета, сделанного в 3 повторностях. КОЕ для M. smegmatis определяли через 5 сут инкубации при 37°С. Предел обнаружения КОЕ составлял 10 кл./мл.

Подсчет наиболее вероятного числа клеток (НВЧК). Подсчет наиболее вероятного числа клеток в культурах МТБ, содержащих НК, проводили в пластиковых 48-луночных планшетах (“Corning”, США), каждая лунка которого содержала 0.9 мл среды Сотона с добавлением ADC и по 0.1 мл культуры из соответствующего десятикратного серийного разведения. В некоторых экспериментах в среду добавляли МПБ или другие добавки в различных концентрациях. Каждое разведение было представлено в 3 повторностях. Планшеты инкубировали в течение 2 мес. при 37°С в статическом режиме. При подсчете наиболее вероятного числа реактивированных клеток учитывали лунки с видимым бактериальным ростом. Значение НВЧК в 1 мл и доверительные интервалы определяли по стандартным статистическим таблицам [10].

Реактивация НК МТБ. Процедуру реактивации НК МТБ проводили 2 способами: в жидкой среде в 48-луночных планшетах с одновременной оценкой НВЧК (как описано выше) или в колбах с 200 мл среды Сотона с добавкой ADC и другими добавками при 37°C с перемешиванием (100 об./мин). В последнем случае перед инокулированием клетки отмывали от среды культивирования 8–10 раз в фосфатном буфере pH 7.2. Периодически отбирали пробы для измерения оптической плотности при 600 нм (ОП600), включения радиоактивного урацила, определения КОЕ и НВЧК. В отдельных экспериментах к среде реактивации добавляли фильтраты, отобранные в разное время из реактивированной культуры МТБ.

Получение рекомбинантных белков RpfB и RipA. Литическая трансгликозилаза RpfB (Resuscitation Promoting Factor B) и эндопептидаза RipA (Resuscitation Promoting Factor Interacting Protein А) были получены из Institute of Biostructures and Bioimaging, C.N.R. (Неаполь, Италия) в виде конструкций RpfB268–362 и RipA332–472. Экспрессию белков в клетках E. coli, выделение и очистку белков проводили по методике, описанной в статье [11].

Получение пептидогликана микобактерий. Получение ПГ микобактерий проводили по методикам, описанным ранее [12, 13] в модификации [11] с использованием культуры Mycolicibacterium smegmatis mc2 155 и Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Получение меченого препарата ПГ. Меченый флуоресцентным красителем (флуоресцеин-5-изотиоцианат, ФИТЦ, “Sigma”, США) препарат ПГ получали в соответствии с опубликованной методикой [11].

Получение фрагментов пептидогликана (ФПГ) путем ферментативного гидролиза. ФПГ получали из меченого и немеченого ПГ путем его гидролиза белками RpfB и RipA (по 20 мкг/мл каждого белка) отдельно и в комбинации в течение 6 сут при 37°C при постоянном перемешивании. Через 6 сут ферментативную реакцию останавливали нагреванием при 80°С в течение 20–40 мин. Нерастворенные и не гидролизованные остатки ПГ удаляли центрифугированием при 10 000 g в течение 15 мин.

В случае с меченым ПГ интенсивность флуоресценции супернатанта после центрифугирования измеряли при длине волны возбуждения 492 нм и длине волны испускания 515 нм. Уровень гидролиза оценивали по интенсивности флуоресценции супернатанта. При гидролизе немеченого ПГ концентрацию полученных ФПГ определяли фенол-сернокислотным методом [14].

Получение ФПГ путем ультразвуковой дезинтеграции. Пептидогликан микобактерий в концентрации 2 мг/мл суспендировали в фосфатном буфере pH 6.0. ПГ озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе HD 2200 (“Sonopuls”, Германия) в течение 1 мин (режим пульсаций – 9 циклов в минуту). Озвученную смесь центрифугировали при 10 000 g 15 мин для удаления неразрушенного ПГ, а супернатант, содержащий ФПГ, собирали и лиофилизировали.

Определение суммарной концентрации ФПГ. Концентрацию ФПГ определяли фенол-сернокислотным методом Дюбуа [14]. К 500 мкл исследуемого образца добавляли 6 мкл фенола (80%-ный водный раствор) и 500 мкл концентрированной серной кислоты. ОП полученного раствора измеряли при 485 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эффект “самоингибирования” при реактивации покоящихся клеток M. tuberculosis. В лабораторной практике для выявления МТБ в клинических образцах используют культуральные методы, предполагающие размножение клеток возбудителя в специальных жидких средах. Однако, как ведут себя НК в таких условиях практически не было исследовано. С этой целью в настоящей работе были использованы покоящиеся формы МТБ, утратившие способность расти на стандартных плотных средах. Такие НК МТБ были получены in vitro в условиях длительной стационарной фазы при медленном самозакислении жидкой среды и последующего хранения клеток в этой среде [15]. В результате, после 4 мес. пребывания в состоянии покоя, культура в основном была представлена морфологически измененными клетками, обладающими выраженной “некультивируемостью”: КОЕ от 10 до 103 кл./мл при общей концентрации клеток 109–1010кл./мл [15]. Такие формы бактерий могли быть реактивированы в жидкой среде Сотона с ростовой добавкой ADC, а количество клеток в исходной культуре могло быть определено с помощью метода НВЧК в планшетном варианте с использованием серийных разведений с последующей инкубацией [2, 9]. Однако при воспроизведении подобных экспериментов при инокулировании НК микобактерий в колбы с той же средой было выяснено, что эффективность их реактивации сильно зависит от начальной концентрации клеток. Так, при использовании НК в исходной концентрации 105–106 кл./мл (суммарное количество) наблюдалось размножение бактерий в культуре (увеличение ОП) спустя 20–35 сут для разных экспериментов в зависимости от срока хранения НК (рис. 1). В тоже время при инокулировании тех же клеток до оптических плотностей 0.4 и выше (около 107–108 кл./мл) реактивация не происходила вовсе и со временем клетки погибали (рис. 1). Это позволило предположить, что в процессе реактивации НК МТБ секретируют в окружающую среду некие ингибирующие вещества. Для экспериментального подтверждения этого предположения из инкубированных культур НК МТБ (с исходной высокой концентрацией клеток) периодически отбирали пробы (рис. 1), которые затем пропускали через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Было изучено действие полученного фильтрата на рост вегетативных клеток МТБ, взятых в экспоненциальной фазе роста. Как оказалось, ингибирующее действие фильтрата, вызывающее торможение роста клеток, зависело от продолжительности инкубации НК в среде Сотона, и достигало максимума при инкубировании в течение 11 сут (рис. 2). Обнаружено также снижение ингибирующей активности фильтрата с увеличением времени инкубации более 11 сут, что могло свидетельствовать об относительной нестойкости секретируемого вещества (рис. 2). Таким образом, была установлена секреция неких антибактериальных веществ НК МТБ в процессе их реактивации. Такое “самоингибирование”, очевидно, удлиняет лаг-фазу и увеличивает время детекции возбудителя в образцах, особенно в условиях их значительной обсемененности. Ранее подобный эффект был отмечен для реактивированной культуры Micrococcus luteus [16]. Установление природы этих антибактериальных соединений, способов их инактивации, или ингибирование их синтеза может быть перспективным для ускорения культурального метода детекции МТБ.

Рис. 1.

Изменение ОП600 культур при реактивации НК МТБ в среде Сотона с ADC: 1 – исходная концентрация клеток 106 кл./мл, 2 – исходная концентрация клеток 5 × 107 кл./мл. Стрелками показаны точки отбора культуры.

Рис. 2.

Ингибирование роста активных клеток МТБ в присутствии фильтратов реактивированной культуры МТБ, содержащей НК. На оси абсцисс – время отбора фильтратов из реактивированной культуры. На оси ординат – отношение ОП600 активной культуры, выращенной в присутствии фильтратов к таковому без фильтрата (контроль) через 3 сут (1); 4 сут (2) и 7 сут (3) инкубации.

Особенности лаг-фазы при реактивации покоящихся клеток M. tuberculosis. При исследовании реактивации НК МТБ в жидкой среде при исходной концентрации клеток ниже порогового уровня (~107 кл./мл) была выявлена двухстадийность этого процесса: быстрое нарастание числа КОЕ на ранних стадиях реактивации (4 сут) и последующая длительная лаг-фаза, предшествующая началу деления клеток до 20 сут (рис. 3). Вероятно, быстрый подъем значения КОЕ не связан с размножением клеток, поскольку, во-первых, значение НВЧК культуры (концентрация клеток, способных к размножению) не изменялось за этот период (рис. 3). Во-вторых, несмотря на изменение в КОЕ, клетки в культуре проявляли фоновую дыхательную активность, которая увеличивалась лишь к началу активного деления клеток (30 сут), и незначительный уровень включения радиоактивного урацила (маркер синтеза РНК) до этого момента (рис. 3). Наконец, скорость изменения КОЕ в этот период соответствует кажущемуся времени генерации ~1.5 ч, что значительно ниже известного времени генерации для МТБ (около 20 ч). Очевидно, что резкий подъем КОЕ на начальной стадии реактивации отражает изменения каких-то свойств НК, в результате которых они приобретают способность к росту на плотных средах.

Рис. 3.

Изменение метаболической активности клеток (2, импульсов/мин мг влажного веса клеток) и КОЕ (1, кл./мл) при реактивации НК МТБ на среде Сотона с добавкой ADC. Крестиками отмечены значения НВЧК. (Исходная концентрация бактерий 2 × 105 кл./мл). Показаны стандартные отклонения для КОЕ и включения метки, а также доверительные интервалы на уровне 95% для НВЧК. Приведены результаты типичного из 4 проведенных экспериментов.

В случае реактивации НК с исходной концентрацией выше пороговой (~107 кл./мл) также наблюдалась быстрая стадия увеличения КОЕ, сменяющаяся длительной фазой медленного снижения КОЕ, которое в итоге достигало значений ниже детектируемого уровня (рис. 4).

Рис. 4.

Изменение количества КОЕ (кл./мл) при реактивации НК МТБ на средах: Сотона + АDС + МПБ (1, 3.25 г/л), Сотона + АDС (2). Исходная концентрация бактерий 2 × 107 кл./мл.

Таким образом, эти результаты свидетельствовали о наличии продолжительной истинной лаг-фазы при реактивации НК МТБ (при относительно небольших начальных концентрациях), в течение которой не происходит размножение, в отличие от кажущейся лаг-фазы, когда при неизменяющейся ОП происходит размножение культивируемых клеток при их малом начальном количестве. Ранее подобная двухстадийность была обнаружена при реактивации НК М. smegmatis. Было выяснено, что в течение истинной лаг-фазы, тем не менее, происходит “метаболическая реактивация”, при которой регистрируется увеличение мембранного потенциала, разрушение накопленной в покое трегалозы и изменения в морфологии клеток [17]. Обнаруженная длительная лаг-фаза, предположительно, связана с несбалансированным метаболизмом клетки в процессе реактивации, при котором возможно накопление промежуточных метаболитов с ингибирующими свойствами, например, таких активных карбонильных соединений, как метилглиоксаль [18]; либо с недостатком неких метаболитов, необходимых для запуска метаболических процессов в клетках (“фенотипическая ауксотрофия”); либо необходимостью присутствия факторов, способствующих делению клеток. В любом случае, обнаруженная истинная лаг-фаза, очевидно, определяет длительность культивирования образцов с НК для их детекции культуральными методами.

Модификация среды для стимуляции реактивации НК M. tuberculosis. Для поиска состава среды оптимальной для реактивации НК был проведен скрининг различных добавок, в том числе субстратов и антиоксидантов. В качестве объекта на начальном этапе использовали НК быстрорастущей микобактерии М. smegmatis, часто применяемой в качестве модельного микроорганизма для МТБ [19]. НК M. smegmatis получали аналогично НК МТБ при медленном закислении среды [20]. В итоге было проверено в качестве добавок 16 веществ в разных концентрациях, потенциально способных влиять на рост микобактерий. Наибольшая стимуляция реактивации, которую оценивали по увеличению КОЕ в течении реактивации, была отмечена при введении в среду Сотона мясопептонного бульона (МПБ) в оптимальной концентрации 3.25 г/л. Найденный эффект МПБ был использован в экспериментах по стимуляции реактивации НК МТБ. В качестве базовой среды использовали среду Сотона c добавкой ADC, в которую инокулировали НК в исходной концентрации выше порогового уровня (~107 кл./мл). Как видно из рис. 4, при добавлении в среду МПБ происходило сокращение лаг-фазы (до 2 сут) и быстрое последующее размножение клеток. Эти эксперименты указывают на наличие неких компонентов, содержащихся в МПБ, необходимых для реактивации НК и дальнейшего их размножения.

Оптимизация культурального метода НВЧК для количественного определения содержания “некультивируемых” форм М. tuberculosis. Выявление возбудителя в образцах путем культивирования в жидкой среде (см. выше), по-существу, является качественным методом, особенно если в популяции содержатся НК. Действительно, в этом случае трудно разделить процессы реактивации НК и размножения начально культивируемых клеток. В настоящее время метод НВЧК является единственным количественным методом, позволяющим определять в бактериальной популяции концентрацию НК, потенциально способных к размножению. Многочисленные физические методы (например, флуоресцентная микроскопия) или молекулярно-биологические методы (ПЦР или ПЦР в реальном времени) не могут определить способна ли данная бактериальная клетка к делению. В тоже время ясно, что именно способность к делению определяет инфекционный потенциал НК МТБ. В этой связи были предприняты попытки модификации жидкой среды при определении методом НВЧК для повышения его эффективности. Как видно из рис. 5, внесение МПБ (3.25 г/л) в базовую среду Сотона, используемую в методе НВЧК, увеличивало на 2.5 порядка количество детектируемых в исходной популяции клеток, способных к размножению, по сравнению с определением НВЧК без добавки. При этом также было обнаружено, что для максимальной эффективности метода, концентрация глицерина в среде должна быть снижена по сравнению с классической прописью среды Сотона до 0.5%.

Рис. 5.

Количество способных к размножению клеток (кл./мл) в культурах МТБ, содержащих НК, определенных методом НВЧК на средах: Сотона + АDС (1), Сотона + АDС + МПБ (2, 3.25 г/л) и МОД4 (3). Указаны доверительные интервалы на уровне 95% для значений НВЧК.

В отдельных экспериментах была протестирована полная многокомпонентная среда МОД4, описанная недавно в литературе в качестве эффективной среды для стимуляции роста активной культуры МТБ [10]. Однако реактивация НК и их размножение на данной среде не наблюдались (рис. 5). По-видимому, обогащение среды реактивации метаболизируемыми субстратами оказывает отрицательный эффект на реактивацию и выявление НК МТБ, о чем также свидетельствует необходимость снижения концентрации глицерина (основной субстрат, используемый МТБ) и использование оптимального количества МПБ. Отрицательный эффект повышенных концентраций субстратов в среде напоминает явление гибели голодающей культуры бактерий при добавлении питательного компонента, усиливающего её рост в нормальных условиях (substrate accelerated death) [21].

Другой подход к оптимизации метода НВЧК мог состоять в использовании веществ, способствующих делению клеток на заключительном этапе реактивации НК [11, 22–24]. Как было ранее выяснено, фильтраты активно растущих культур микобактерий способствуют обнаружению НК микобактерий как в образцах, полученных in vitro [2, 9], так и в образцах больных ТБ (мокрота) [25]. Однако природа, присутствующих веществ установлена не была. Более того, несмотря на эффективность применения фильтрата для стимуляции реактивации НК, на практике их применение затруднено из-за короткого срока сохранения их реактивирующей активности, даже в замороженном состоянии, и дополнительной трудности получения. В этой связи были предприняты попытки использования активных компонентов, которые могут находиться в фильтрате. Ранее было обнаружено, что секретируемые белки семейства Rpf микобактерий и продукты их энзиматического действия стимулируют реактивацию НК M. smegmatis на этапе деления клеток [11, 22]. В настоящем исследовании это явление было проверено на модели НК МТБ. Для этих экспериментов были получены рекомбинантные белки RpfВ и RipA [26–28]. Эти белки гидролизуют ПГ с образованием минимальной структуры, ответственной за реактивацию – дисахарид дипептида (N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина), вне зависимости от наличия аминокислоты во втором положении (D-глутамат или D-изоглутамин) [11].

С помощью полученных белков был проведен гидролиз выделенного препарата ПГ из двух источников – МТБ и M. smegmatis. Сравнение эффективности гидролиза ПГ из M. smegmatis и МТБ в течение 6 сут инкубации ПГ с белками не выявило существенных различий в количестве высвободившихся ФПГ (рис. 6а). Из рис. 6б видно, что при совместном действии двух белков по сравнению с действием отдельных белков, при гидролизе меченого ФИТЦ ПГ МТБ наблюдался синергетический эффект.

Рис. 6.

Гидролиз меченых ФИТЦ препаратов ПГ, выделенных из M. smegmatis и МТБ (а) белками RpfB (1, 2 соответственно), RipA (3, 4 соответственно) и RpfB + RipA (5, 6 соответственно), динамика гидролиза ФИТЦ-ПГ (б) при 37°С под действием RpfB + RipA (1), RpfB (2); RipA (3). На оси ординат – относительные единицы флуоресценции (ОЕФ) супернатантов, полученных после осаждения негидролизованных препаратов.

ФПГ, полученные после гидролиза ПГ, а также белок RpfB были испытаны в различных вариантах для стимуляции реактивации НК. В присутствии ФПГ и белка RpfB было обнаружено увеличение НК МТБ, способных к реактивации. Хотя уровень стимуляции варьировал в экспериментах, увеличение эффективности детекции было достоверным и составляло от 2 до 3 порядков (рис. 7).

Рис. 7.

Количество способных к размножению клеток в культурах МТБ, содержащих НК, определенных методом НВЧК на средах: Сотона + ADC (1); Сотона + + ADC + RpfB (2, 5 нг/мл); Сотона + ADC + + ФПГ после гидролиза белком RpfB (3, 200 нг/мл); Сотона + + ADC + препарат арабиногалактана (4, в качестве контроля, 200 нг/мл). Показано стандартное отклонение данных в сериях от 3 до 10 повторностей.

Поскольку результатом энзиматического действия белков Rpf является разрушение ПГ, действие ФПГ, полученных в результате энзиматического гидролиза сравнили с действием ФПГ, полученных в результате озвучивания. Как оказалось, “ультразвуковые” ФПГ также увеличивают количество детектируемых НК МТБ методом НВЧК (рис. 8).

Рис. 8.

Влияние ФПГ после ультразвуковой обработки ПГ в культурах МТБ, содержащих НК, на количество способных к размножению клеток, определенных методом НВЧК на средах: Сотона + ADC (1, контроль); Сотона + ADC + 0.05 мкг/мл ФПГ (2); Сотона + ADC + + 0.1 мкг/мл ФПГ (3); Сотона + ADC + 0.2 мкг/мл ФПГ (4) и Сотона + ADC + 1 мкг/мл ФПГ (5). Доверительные интервалы указаны на уровне 95% для значений НВЧК.

Таким образом, вполне вероятно, что используемые в вышеперечисленных работах фильтраты оказывали положительное действие за счет присутствия в них ФПГ. Исследования позволили установить, что стимуляция реактивации НК МТБ может быть достигнута заменой фильтрата на продукты гидролиза ПГ, полученные с помощью RpfB и RipA, и даже на ФПГ, полученные при его ультразвуковом разрушении. Обработка ультазвуком намного проще технически, а ФПГ намного стабильнее фильтрата при хранении.

В результате проведенного исследования были установлены особенности ранней стадии реактивации НК МТБ. Выявлены факторы, влияющие на скорость и уровень детекции таких клеток в культурах МТБ. Эти знания могут быть использованы в качестве подходов для усовершенствования микробиологической диагностики туберкулеза при исследовании биологических образцов больных ТБ.

Авторы выражают благодарность В.Д. Никитушкину за участие в работе по получению клеточных стенок микобактерий, а также выражают благодарность A. Ruggiero и R. Berisio (Institute of Biostructures and Bioimaging, C.N.R., Неаполь, Италия) за предоставленные конструкции белков RpfB и RipA.

При проведении исследований использовалось оборудование Центра коллективного пользования “Промышленные биотехнологии” Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук.

Список литературы

  1. Эргешов А.Э., Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н. // Вестник РАМН. 2019. Т. 74. № 6. С. 413–422.

  2. Shleeva M.O., Bagramyan K., Telkov M.V., Mukamolova G.V., Young M., Kell D.B., Kaprelyants A.S. // Microbiology. 2002. V. 148. № 5. P. 1581–1591.

  3. Medlar E.M., Bernstein S., Steward D.M. // Am. Rev. Tuberc. 1952. V. 66. № 1. P. 36–43.

  4. Beck F., Yegian D. // Am. Rev. Tuberc. 1952. V. 66. № 1. P. 44–51.

  5. Hobby G.L., Auerbach O., Lenert T.F., Small M.J., Comer J.V. // Am. Rev. Tuberc. 1954. V. 70. № 2. P. 191–218.

  6. Biketov S.F., Mukamolova G.V., Potapov V., Gilenkov E., Vostroknutova G.N., Kell D.B., Young M., Kaprelyants AS. // FEMS Immunol Med Microbiol. 2000. V. 29. № 4. P. 233–240.

  7. Dhillon J., Lowrie D.B., Mitchison D.A. // BMC Infect. Dis. 2004. V. 4. P. 4–7.

  8. Mukamolova G.V., Turapov O., Malkin J., Woltmann G., Barer M.R. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2010. V. 181. P. 174–180.

  9. Shleeva M.O., Kudykina Y.K., Vostroknutova G.N., Suzina N.E., Mulyukin A.L., Kaprelyants A.S. // Tuberculosis (Edinb). 2011. V. 91. № 2. P. 146–154.

  10. Ghodbane R., Raoult D., Drancourt M. // Sci Rep. 2014. V. 4. P. 4236.

  11. Nikitushkin V.D., Demina G.R., Shleeva M.O., Guryanova S.V., Ruggiero A., Berisio R., Kaprelyants A.S. // FEBS J. 2015. V. 282. № 13. P. 2500–2511.

  12. Parish T., Stoker N. // Methods in molecular Biology. In Mycobacteria protocols, Humana Press, Totowa, NJ. 1998. P. 91–107.

  13. Mahapatra S., Crick D.C., McNeil M.R., Brennan P.J. // J Bacteriol. 2008. V. 190. № 2. P. 655–661.

  14. Du Bois A.B., Botelho S.Y., Bedell G.N., Marshall R., Comroe J.H. Jr. // J Clin Invest. 1956. V. 35. P. 322–326.

  15. Shleeva M.O., Kudykina Y.K., Vostroknutova G.N., Suzina N.E., Mulyukin A.L., Kaprelyants A.S. // Tuberculosis (Edinb). 2011. V. 91. № 2. P. 146–154.

  16. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B. // Antonie Van Leeuwenhoek. 1995. V. 67. № 3. P. 289–295.

  17. Shleeva M.O., Trutneva K.A., Demina G.R., Zinin A.I., Sorokoumova G.M., Laptinskaya P.K., Shumkova E.S., Kaprelyants A.S. // Front Microbiol. 2017. V. 8. P. 524.

  18. Nikitushkin V.D., Trenkamp S., Demina G.R., Shleeva M.O., Kaprelyants A.S. // Metabolomics. 2020. V. 16. № 2. P. 24.

  19. He Z., De Buck J. // BMC Microbiol. 2010. V. 10. P. 121.

  20. Кудыкина Ю.К., Шлеева М.О., Арцатбанов В.Ю., Сузина Н.Е., Капрельянц А.С. // Микробиология. 2011. Т. 80. № 5. С. 625–636.

  21. Postgate J.R., Hunter J.R. // Nature. 1963. V. 198. P. 273.

  22. Nikitushkin V.D., Demina G.R., Shleeva M.O., Kaprelyants A.S. // Antonie Van Leeuwenhoek. 2013. V. 103. № 1. P. 37–46.

  23. Shleeva M.O., Goncharenko A.V., Kudykina Y.K., Young D., Young M, Kaprelyants A.S. // PLoS One. 2013. V. 8. № 12. e82914. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082914

  24. Назарова Е.В., Шлеева М.О., Морозова Н.С., Кудыкина Ю.К., Вострокнутова Г.Н., Ружицкий А.О., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М., Швец В.И., Капрельянц А.С. // Биохимия. 2011. Т. 76. № 6. С. 781–791.

  25. Zainabadi K., Walsh K.F., Vilbrun S.C., Mathurin L.D., Lee M.H., Saito K., Mishra S., Ocheretina O., Pape J.W., Nathan C., Fitzgerald D.W. // Antimicrob. Agents Chemother. 2021 V. 65. № 8. e0060821. https://doi.org/10.1128/aac.00608-21

  26. Hett E.C., Chao M.C., Steyn A.J., Fortune S.M., Deng L.L., Rubin E.J. // Mol. Microbiol. 2007. V.66. № 3. P. 658–668.

  27. Hett E.C., Chao M.C., Deng L.L., Rubin E.J. // Plos pathogens. 2008. V. 4. № 2. e1000001. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000001

  28. Ruggiero A., Marasco D., Squeglia F., Soldini S., Pedone C., Berisio R. // Structure 2010. V. 18. № 9. P. 1184–1190.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал