Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 3, стр. 253-259

МЕТОДИКА

Ферментные препараты. В работе были использованы ФП, которые представляли собой лиофильно высушенные культуральные жидкости, полученные на основе штаммов P. verruculosum В537 (продуцент целлюлаз) [18] и P. verruculosum F-10 (продуцент β-глюкозидазы) [19].

Реагенты. В работе использовали тростник обыкновенный из Астраханской области (Россия), грубо измельченный. В качестве субстратов для определения активностей использовали Na-соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), ксилан бука, п‑нитрофенил-β-глюкопиранозид (пНФГ) – производства “Sigma” (США) и микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ, ТУ 20.16.59-001-40693384-209) производства “Кристацелл” (Россия). Для приготовления буферных смесей и солевых растворов использовали реактивы фирм “Bio-Rad Laboratories” (США), “Panreac” (Германия), “Helicon” и “Реахим” (Россия). Для получения ГЭР использовали ХХл (“Molekula”, Англия), глицерин (“Panreac Quimica”, Испания), этиленгликоль (“Roth”, Германия), молочную кислоту (МК) (“Acros Organics”, Бельгия), щавелевую кислоту (ЩК) (“ХимМед”, Россия).

Получение ГЭР. Все ГЭР получали путем термического смешивания компонентов при постоянном перемешивании в течение 6 ч: ХХл/МК (молярные соотношения 1 : 2 и 1 : 5) – при 40°С; ХХл/ЩК (молярные соотношения 1 : 1 и 1 : 2) – при 60°С; ХХл/пропионовая кислота (молярное соотношение 1 : 2) – при 40°С; ХХл/глицерин (молярное соотношение 1 : 2) – при 50°С; ХХл/этиленгликоль (молярное соотношение 1 : 2) – при 40°С.

Предобработка тростника ГЭР. Для выбора оптимальных условий предобработки использовали ГЭР различного состава: нейтральные на основе ХХл и многоатомных спиртов: глицерин, этиленгликоль и кислые на основе ХХл и кислот: МК, ЩК, пропионовая. Также варьировали время и температуру предобработки. В типичном эксперименте к 500 мг тростника добавляли 9.5 г ГЭР (загрузка 5% по массе) и прогревали при различных температурах в течение 1, 2, 3, 6, 7, 9, 12 или 24 ч при перемешивании. Растворы охлаждали до комнатной температуры и добавляли по 10 мл 50% водно-этанольного раствора. Смесь перемешивали, затем центрифугировали при 7000 g. Надосадочную жидкость, содержащую лигнин и компоненты ГЭР, отделяли, осадок многократно промывали водно-этанольной смесью. Следует отметить, что используемый в работе ГЭР ХХл/ЩК (молярное соотношение 1 : 2) при комнатной температуре затвердевал, что затрудняло его отделение от продуктов делигнификации биомассы.

Выход субстрата после предобработки определяли как отношение массы предобработанного тростника после высушивания до постоянного веса к массе исходного тростника (500 мг).

Определение активности и концентрации ферментов. За 1 ед. активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль продукта за 1 мин.

Активность по отношению к МКЦ, КМЦ и ксилану определяли по скорости накопления ВС, анализируемых методом Шомоди-Нельсона; активность по отношению к пНФГл – по скорости накопления п-нитрофенола [20].

Содержание белка в ФП определяли методом Лоури, используя БСА в качестве стандарта.

Ферментативный гидролиз предобработанного тростника. Гидролиз субстрата (40 г/л по сухой массе в реакционной смеси) проводили под действием двух препаратов ФП В537 (10 мг белка/г субстрата или 0.4 мг/мл в реакционной смеси) и β-глюкозидазы ФП F10 (1 мг белка/г субстрата или 0.04 мг/мл реакционной смеси) в пробирках объемом 2 мл (объем реакционной смеси 1.5 мл) в термостатируемом шейкере. Процесс гидролиза вели в присутствии 0.1 г/л антибиотика ампициллина (“Белмедпрепараты”, Республика Беларусь) в 0.1 М Na-ацетатном буферном растворе рН 5.0 и 50°С.

Из реакционной смеси отбирали аликвоты, в которых определяли концентрацию ВС методом Шомоди-Нельсона и глюкозы с помощью набора “Глюкоза-АГАТ” (ООО “АГАТ”, Россия).

Глубину ферментативного гидролиза (ГФГ) рассчитывали, как отношение концентрации ВС после 48 ч ферментативного гидролиза к исходной концентрации субстрата (40 г/л).

Эксперимент проводился в трех повторах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Предобработка субстрата должна удовлетворять важному условию – эффективно удалять негидролизуемую ферментами часть (лигнин), сохраняя целлюлозу и, при необходимости, гемицеллюлозу. Высокие значения выхода предобработанного субстрата 90–93% при использовании пропионовой кислоты, глицерина или этиленгликоля в качестве донора водородной связи в ГЭР (табл. 1) свидетельствовали, по-видимому, о неполном удалении лигнина из тростника в ходе его предобработки. При использовании МК выход субстрата в ходе предобработки составил 57–61%, что указывало на эффективную делигнификацию и, вероятно, частичное удаление гемицеллюлозы. Использование ЩК также приводило к удалению лигнина и части гемицеллюлозы в ходе предобработки, выход субстрата составил 44–49%.

На следующем этапе был проведен ферментативный гидролиз полученного предобработанного субстрата. Целлюлазный комплекс ферментов, способный к глубокому гидролизу целлюлозосодержащего сырья до глюкозы, должен включать в себя три основные группы ферментов: целлобиогидролазы, эндоглюканазы и β-глюкозидазы [1]. Для осуществления биоконверсии предобработанного тростника были использованы ФП на основе штамма P. verruculosum B537 [18], содержащий $ \simeq {\kern 1pt} 60\% $ целлобиогидролаз и $ \simeq {\kern 1pt} 10\% $ эндоглюканаз. ФП В537 обладал высокими удельными активностями по отношению к МКЦ (860 ед./г белка) и КМЦ (1300 ед./г белка), обусловленными наличием целлобиогидролаз и эндоглюканаз соответственно. Однако ФП В537 обеднен β-глюкозидазой, о чем свидетельствуют низкое содержание этого фермента (2%) и невысокая активность по отношению к специфическому для β-глюкозидазы субстрату пНФГ (1800 ед./г белка). Для увеличения β-глюкозидазной активности в реакционную смесь добавляли ФП на основе штамма P. verruculosum F10 [19] – продуцента β-глюкозидазы, содержащий около 80% этого фермента и характеризующийся высокой активностью по отношению к пНФГ (6110 ед./г белка). Гидролиз целлюлозосодержащего сырья под действием двух ФП В537 (целлобиогидролазы и эндоглюканазы) и ФП F10 (β-глюкозидаза) приводил к высоким выходам глюкозы [21].

Кроме того, ФП В537 содержал ксиланазу (3%) и обладал высокой активностью к ксилану (1980 ед./г белка), что свидетельствует о способности данного препарата гидролизовать гемицеллюлозы.

Важно отметить, что исходный (без предобработки) тростник обладал очень низкой реакционной способностью: после 48 ч ферментативного гидролиза под действием двух ФП В537 и ФП F10 концентрация ВС составила около 2 г/л, что соответствовало ГФГ всего 6%.

При варьировании состава ГЭР предобработку тростника вели при 90°С в течение 7 ч (табл. 1). Наилучшие результаты были получены для смесей ХХл/МК (соотношение 1 : 5 было предпочтительней соотношения 1 : 2) и ХХл/ЩК (соотношение 1 : 1). После 48 ч ферментативного гидролиза концентрация ВС составила около 18 г/л (ГФГ 46%), концентрация глюкозы – 16–17 г/л. При использовании для предобработки смеси ХХл/ЩК с большей долей ЩК (молярное соотношение 1 : 2) полученный предобработанный субстрат имел крайне низкую реакционную способность и ГФГ составила всего 9%, что, возможно, связано со слишком жесткими условиями предобработки.

Среди использованных в работе ГЭР на основе ХХл с органическими кислотами ГЭР с пропионовой кислотой был наименее эффективным: концентрация ВС и глюкозы составили 8.2 и 7.2 г/л соответственно, ГФГ 21%.

Предобработка тростника смесями ХХл с глицерином или этиленгликолем приводила к увеличению доступности субстрата для ферментов и ГФГ после 48 ч гидролиза составляла 9 и 14% соответственно.

Таким образом, очевидно, что использование органических кислот в качестве донора водородной связи в ГЭР по сравнению с полиспиртами более эффективно. Оптимальными смесями для предобработки были выбраны ХХл/МК (молярное соотношение 1 : 5) и ХХл/ЩК (молярное соотношение 1 : 1).

На следующем этапе были подобраны оптимальные температура и время предобработки тростника для выбранных ГЭР. На рис. 1 показаны выходы продуктов ферментативного гидролиза (ВС и глюкозы) тростника, предобработанного смесями ХХл/МК при 60, 80 и 90°С или ХХл/ЩК при 70, 80 и 90°С за различные промежутки времени (1–24 ч).

Рис. 1.

Концентрация глюкозы (1) и ВС (2) после 48 ч ферментативного гидролиза тростника (40 г/л по сухой массе), предварительно обработанного ХХл/МК при 60 (а), 80 (б) и 90°С (в) или ХХл/ЩК при 70 (г), 80 (д) и 90°С (е), после действия ФП В537 (10 мг белка/г субстрата) и F10 (1 мг белка/г субстрата) при 50°С, рН 5.0. На оси абсцисс указано время предобработки.

При предобработке тростника смесью ХХл/МК его гидролизуемость увеличивалась с увеличением времени предобработки (до 24 ч). Наибольший выход продуктов ферментативного гидролиза был получен для субстрата, предобработанного при 80°С в течение 24 ч: концентрация ВС и глюкозы составили 32 и 27 г/л соответственно, ГФГ 80% (рис. 1б). После 24 ч предобработки тростника при 90°С последующий ферментативный гидролиз был менее эффективен, ГФГ 60% (рис. 1в). Однако при небольшом времени (3–6 ч) предобработка при температуре 90°С была эффективнее по сравнению с 80°С. Предобработка тростника смесью ХХл/МК при 60°С была малоэффективной: ГФГ субстрата, предобработанного в течение 24 ч, составила всего 21% (рис. 1а).

Зависимость степени гидролиза полисахаридов тростника от времени его предобработки смесью ХХл/ЩК при 80 и 90°С имела колоколообразную форму с максимумами при 6 ч при 80°С и 2–3 ч при 90°С (рис. 1д и 1е). При этом наибольший выход продуктов ферментативного гидролиза наблюдался для субстрата, предобработанного в течение 6 ч при 80°С: концентрация ВС составила 34 и глюкозы 33 г/л, ГФГ 86% (рис. 1д). При более высокой температуре предобработки (90°С) в течение 2–3 ч из полученного субстрата образовалось 25 г/л ВС и 24 г/л глюкозы, ГФГ составила 63% (рис. 1е). При снижении температуры предобработки тростника до 70°С для получения большего выхода сахаров необходимо было увеличить время обработки до 24 ч; в результате концентрация ВС и глюкозы после ферментативного гидролиза субстрата составила 29 и 28 г/л соответственно, ГФГ – 73%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследования в области синтеза, изучения свойств ГЭР и поиска возможностей их промышленного применения находятся на начальном этапе развития. Привлекательной стороной ГЭР является их принадлежность к “зеленым” растворителям, которые обладают такими преимуществами, как простота синтеза, низкая стоимость (относительно ионных жидкостей), они подвергаются биологическому разложению и нетоксичны [4, 5, 7]. ГЭР могут играть решающую роль в селективной солюбилизации и удалении лигнина из растительной биомассы, сохраняя при этом целлюлозу и гемицеллюлозу интактными и пригодными для их дальнейшей переработки [22].

Считается, что увеличение эффективности ферментативного гидролиза биомассы после ее предварительной обработки ГЭР, в первую очередь, обусловлено делигнификацией и разрушением кристаллической структуры целлюлозы [23]. В работе [24] сравнивались выходы сахаров после ферментативного гидролиза нескольких видов растительного сырья до и после предварительной обработки тремя смесями ХХл/борная кислота, ХХл/глицерин и бетаин/глицерин. Без предобработки эффективность гидролиза уменьшалась в ряду: эвкалиптовая целлюлоза (пульпа) (ГФГ 62%) – МКЦ (49%) – пшеничная солома (18%) – еловые опилки (8%). Предобработка в ГЭР привела к улучшению выходов ферментативного гидролиза для всех субстратов, при этом тенденция осталась прежней: максимальный выход продуктов гидролиза предобработанной эвкалиптовой целлюлозы (пульпы) составил 100%, 65% – МКЦ, 33% – пшеничной соломы, 20% – еловых опилок. Таким образом, мягкая предварительная обработка ГЭР была эффективна для целлюлозных субстратов (эвкалиптовой целлюлозы, МКЦ), но относительно малоэффективна для пшеничной соломы и еловых опилок.

В данной работе были подобраны условия предобработки тростника ГЭР, в которых ГФГ по выходу ВС увеличивалась от 6% для исходного тростника без предобработки до 80–86% для предобработанного в оптимальных условиях. При этом основным продуктом гидролиза была глюкоза – она составляла 84 и 97% от всех ВС для смесей ХХл/МК и ХХл/ЩК соответственно, которые использовали в качестве ГЭР.

Большая эффективность кислого ГЭР для предобработки растительной биомассы была отмечена во многих работах [16, 24]. Настоящая работа не является исключением: ГЭР с глицерином или этиленгликолем были менее эффективны, чем ГЭР с органическими кислотами. При этом считается, что чем сильнее кислота, тем больше эффективность ГЭР. Так, при предобработке древесины сосны наибольшие экстракция лигнина и выход продуктов ферментативного гидролиза наблюдались при использовании смеси ХХл с муравьиной кислотой (рК_а 3.75), чем с МК (рК_а 3.86) или с уксусной (рК_а 4.75) при прочих равных условиях [25]. При предобработке пшеничной соломы также предпочтительней была смесь ХХл с ЩК (рК_а 1.2), чем с МК [23]. Предобработка тростника, проведенная в настоящей работе, также подтвердила эту закономерность.

Молярное соотношение донора и акцептора водородной связи также играет важную роль в эффективности предварительной обработки биомассы. Например, при использовании в качестве субстрата смеси целлюлозы и лигнина растворимость последнего улучшалась с увеличением содержания кислоты в смеси ХХл/МК от 1 : 1 до 1 : 9 [26]. Аналогично наблюдалась более высокая солюбилизация лигнина из рисовой соломы (от 51 до 60%) при увеличении доли кислоты в соотношении от 1 : 2 до 1 : 5 в смесях ХХл/МК [22]. В другом исследовании увеличение молярного соотношения ХХл/МК с 1 : 2 до 1 : 15 привело к улучшению извлечения лигнина из кукурузных початков с 65 до 93%, но значительного увеличения выхода сахаров при ферментативном гидролизе не произошло (с 79 до 84%), из чего был сделан вывод, что удаление 70% лигнина было достаточным для достижения оптимального выхода продуктов гидролиза [16]. В настоящей работе было показано небольшое увеличение конверсии тростника при увеличении доли кислоты в смеси ХХл/МК (от 1 : 2 до 1 : 5), в то же время увеличение доли кислоты в смеси ХХл/ЩК (от 1 : 1 до 1 : 2), наоборот, приводило к очень существенному уменьшению реакционной способности тростника.

Одним из главных преимуществ использования ГЭР для предобработки растительной биомассы является умеренный нагрев реакционной смеси (до 80–150°С), что минимизировало образование из лигнина токсичных веществ (производных фурфурола, гидроксикислот, алифатических карбоновых кислот) [27]. В таком температурном диапазоне были изучены процессы делигнификации и их влияние на выход ферментативного гидролиза предобработанных в присутствии ГЭР кукурузных початков [28]. При использовании смеси ХХл/глицерин с повышением температуры предварительной обработки от 80 до 150°С наблюдалось увеличение ГФГ субстрата от 40 до 92%. При использовании ХХл/мочевина выход продуктов гидролиза также увеличивался, но значительно меньше от 51 до 59% при увеличении температуры предобработки от 80 до 115°С. Однако в диапазоне температур предобработки 80–150°С выход продуктов ферментативного гидролиза кукурузных початков, обработанных в смеси ХХл/имидазол, практически не изменялся и был одинаково высок 92–95%. В аналогичном исследовании [16] сообщалось, что увеличение делигнификации от 18 до 96% наблюдалось при повышении температуры предварительной обработки кукурузных початков смесью ХХл/МК от 70 до 110°С. Однако увеличение выхода продуктов гидролиза (от 45 до 79%) наблюдалось лишь в диапазоне от 70 до 90°С, а затем сохранялось на уровне 78–80%. В настоящей работе изменение температуры и времени предобработки показало, что оптимальной температурой для обработки тростника смесью ХХл/МК является 80°С, причем время предобработки должно быть не менее 24 ч, при этом ГФГ полученного субстрата в растворимые сахара составляло 80%. При использовании смеси ХХл с ЩК (более сильная кислота, чем МК) для получения наибольшего выхода продуктов ферментативного гидролиза надо было либо ограничивать время предварительной обработки при 80°С до 6 ч, либо уменьшать температуру до 70°С, сохраняя время предобработки не менее 24 ч. В первом случае ГФГ полученного субстрата составляла 86%, во втором – 73%.

Таким образом, показана возможность эффективной предобработки тростника с помощью ГЭР на основе ХХл в качестве акцептора водородной связи и МК и ЩК как доноров водородной связи. Оптимизированы условия предобработки тростника: соотношение компонентов ГЭР, температура и время процесса. Это позволило добиться ГФГ предобработанного тростника в результате действия ФП В537 (целлобиогидролаза и эндоглюканаза) и ФП F10 (β-глюкозидаза) 80 и 86% для ГЭР ХХл/МК и ХХл/ЩК соответственно.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ.