Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 4, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 4, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 4, стр. 410-417

Получение фаговых антител на белки теплового шока, динамика накопления у мышей с ксенотрансплантированными опухолями

Л. А. Дыкман 1, С. А. Староверов 1, 2, Р. Д. Вырщиков 1, К. К. Фурсова 3, Ф. А. Бровко 3, Д. А. Солдатов 2, О. И. Гулий 1, *

1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки ФИЦ “Саратовский научный центр РАН”
410049 Саратов, Россия

2 Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова
410012 Саратов, Россия

3 Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
142290 Пущино, Московская область, Россия

* E-mail: guliy_olga@mail.ru

Поступила в редакцию 07.02.2023
После доработки 28.02.2023
Принята к публикации 01.03.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

С использованием “наивной” фаговой библиотеки scFv человека проведена аффинная селекция миниантител, специфичных к белкам теплового шока, выделенным из клеток гепатомы линии МН22а и плазмоцитомы линии Sp2/0-Ag14 мыши. С помощью полученных фаговых антител методами дот-иммуноанализа и твердофазного иммуноферментного анализа изучена динамика концентрации белков теплового шока в сыворотке крови мышей с имплантированными опухолевыми клетками линии МН22а. Начиная с 14 сут после ксенотрасплантации, наблюдался постепенный рост уровня белков теплового шока в сыворотке крови. Установлено, что после имплантирования опухолевых клеток рост опухоли сопровождался достоверным повышением накопления белков теплового шока в сыворотке крови. Показано, что миниантитела, специфичные к белкам теплового шока, являются эффективным инструментом для определения и мониторинга накопления белков теплового шока в сыворотке крови животных.

Ключевые слова: белки теплового шока, фаговая библиотека антител, культуры опухолевых клеток, ксенотрансплантированные опухоли, иммуноанализ

Белки теплового шока (БТШ) известны, прежде всего, как высококонсервативные шаперонные белки, участвующие в сворачивании, сборке и разборке белковых комплексов [1]. Эти белки являются внутриклеточными и органеллоспецифичными молекулами, но также встречаются в цитозоле, плазматической мембране, внеклеточных везикулах, биологических жидкостях и кровотоке. Изначально они характеризовались как белки, индуцирующиеся в клетках при стрессовом воздействии, особенно при тепловом шоке [2]. БТШ играют важную роль в опухолевых процессах, поскольку участвуют в различных связанных с раком действиях, таких как пролиферация клеток, метастазирование и устойчивость к противоопухолевым препаратам [3]. Внутриклеточные БТШ, особенно Hsp27, Hsp72 и Hsp90, накапливаются до высоких концентраций при многих типах рака. Предполагается, что БТШ пролиферируют в раковых клетках в ответ на фолдинговые стрессы, возникающие при злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии [4, 5]. Функции БТШ связаны с возникновением, прогрессированием и метастазированием рака, а также с резистентностью к терапии рака. Кроме того, изучается потенциальное использование БТШ для усиления эффектов химио-, радио- и иммунотерапии [6, 7]. БТШ имеют множество клинических применений в качестве биомаркеров для диагностики и прогнозирования рака, а также в качестве потенциальных терапевтических мишеней для противоракового лечения [8].

Шаперонная активность БТШ, по сути, опосредует эффективный захват, процессинг и кросс-презентацию опухолевых пептидных антигенов (Аг) дендритными клетками [9, 10]. Поэтому БТШ играют важную роль в формировании противоопухолевого адаптивного иммунного ответа [11]. Установлено, что белок Hsp70, попадая в межклеточное пространство, вызывает иммунный ответ, снижающий скорость роста опухолей [12]. БТШ стимулируют продукцию хемокинов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [13]. Термостабильные белки из семейства БТШ активно используют в качестве адъювантов при разработке противоопухолевых вакцин для целого ряда онкологических заболеваний [14–17]. Некоторые из этих разработок дошли до третьей фазы клинических исследований [18–21]. Показана принципиальная возможность использования БТШ, конъюгированных с наночастицами золота (НЧЗ), для противоопухолевой вакцинации [22].

В литературных источниках появляется все больше доказательств того, что БТШ сверхэкспрессированы во многих типах злокачественных опухолей, что само по себе способствует инвазии и метастазированию [12, 23, 24]. Например, показано, что уровни БТШ повышены при ряде видов рака, а их сверхэкспрессия связана с плохим прогнозом и ответом на терапию [5, 25, 26]. Таким образом, БТШ являются своеобразными маркерами для ранней диагностики опухолей и прогноза при мониторинге лечения у пациентов с распространенными видами рака – онкомаркерами [27–29]. БТШ также могут служить вспомогательными маркерами при необходимости дополнительного подтверждения диагноза на фоне других симптомов и при оценке эффективности противоопухолевой терапии. Оценка уровня БТШ в сыворотке крови онкологических больных становится значимой областью исследований, направленных на разработку средств для практического применения в клинической онкологии. Для диагностики онкомаркеров в биологических жидкостях используют, в частности, различного рода иммунохимические методики, в том числе биосенсоры [30–32].

Одно из существенных направлений при диагностике рака связано с неинвазивными исследованиями на основе онкомаркеров. Важнейшей составляющей при разработке диагностических систем для индикации онкомаркеров является подбор соответствующего биорецептора. В качестве биоселективного агента (элемента распознавания) преимущественно используют антитела (Ат), специфичные к определяемому Аг. Существует несколько технологий получения Ат, в основном, связанных с иммунизацией животных. В последнее время в молекулярной биологии стали использовать генно-инженерные технологии клонирования узнающих фрагментов – гипервариабельных участков иммуноглобулинов G (IgG), которые являются относительно дешевыми и могут конкурировать по селективности с гибридомными технологиям. К такому методу относится технология фагового дисплея, в основе которой лежит экспонирование чужеродных пептидов или белков на поверхности фаговых частиц в составе одного из химерных белков оболочки.

Технология фагового дисплея была разработана в середине 80 гг. Она основана на экспрессии чужеродного белка на поверхности нитчатого бактериофага М13 путем вставки гена, кодирующего фрагмент эндонуклеазы рестрикции EcoRI, в единую рамку трансляции с белком минорной оболочки pIII нитчатого бактериофага [33]. В 1990 гг. метод фагового дисплея был использован для экспонирования антигенсвязывающих фрагментов IgG на поверхности бактериофага fd [34]. Метод не требует использования животных, длительных процедур иммунизации, дорогих сред и культур животных клеток. Рекомбинантные фаговые Ат (миниантитела) успешно зарекомендовали себя в качестве биорецепторов в различных биосенсорных системах [35–37], в том числе для детекции БТШ микобактерий, вызывающих туберкулез [38], и клеток карциномы легкого человека A549 in vitro [39]. Хотя в настоящее время полная замена моноклональных и поликлональных IgG фрагментами Ат неживотного происхождения маловероятна, фаговые Ат следует рассматривать как ценный дополнительный или даже альтернативный вариант, особенно в тех случаях, когда их адаптируемость является истинным преимуществом. Преимущество фаговых антител заключается в отсутствии необходимости иммунизации животных, что значительно сокращает время получения стабильных клонов, продуцирующих антитела, с нескольких месяцев до нескольких недель. Кроме того, стратегия селекции фаговых антител может быть адаптирована к индивидуальным потребностям исследования не только при онкодиагностике, но и оценке эффективности противораковой терапии [35–39].

Цель исследования − получение фаговых Ат к БТШ, выделенным из клеток опухолевых линий гепатомы и плазмоцитомы, и их использование для иммунодиагностики и анализа динамики накопления БТШ в плазме крови мышей при трансплантации опухоли и в сыворотке крови спонтанно заболевших животных.

МЕТОДИКА

Культивирование клеток. В экспериментах использовали клетки гепатомы линии МН22а и плазмоцитомы линии Sp2/0-Ag14 мыши. Клеточные линии были получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Россия). Наращивание клеток проводили на среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM; БиолоТ, РФ) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (“БиоЛот”, РФ), 100 ед./мл пенициллина (“Gibco”, Ирландия), 100 мкг/мл стрептомицина (“Gibco”, Ирландия) и 292 мкг/мл L-глутамина (“Gibco”, Ирландия). Культуры клеток росли в стерильных флаконах для адгезионных клеточных культур до достижения монослоя.

Получение тотальной фракции термостабильных антигенов из клеток линии МН22а. После достижения монослоя проводили выделение клеточных БТШ по методу, описанному в работах [40, 41]. Культуральный флакон с клеточным монослоем прогревали при 42°С в течение 1 ч и затем инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Далее проводили лизирование клеток. Флакон аккуратно промывали 4 раза 10 мл подогретого раствора Хэнкса (“ПанЭко”, РФ). Затем добавляли 15 мл культуральной среды DMEM с 4 мМ L-глютамина и 2 мМ фенилметилсульфонил фторида (“Sigma-Aldrich”, США). Флакон инкубировали 1 ч при 37°C при покачивании на шейкере. После отмывки во флакон с клеточным монослоем добавляли 10 мл буфера Cytomix (“Bio-Rad”, США) и замораживали флакон при –20°С, затем оттаивали при 37°С. Эту процедуру повторяли 3 раза. Суспензию переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 10 000 g 15 мин. Как вариант данного способа использовали снятие клеток с монослоя трипсинизацией, а затем проводили лизис 7 × 106 опухолевых клеток по описанной процедуре. Полученные препараты осветляли центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин, определяли концентрацию белка в лизате по методу Брэдфорд и замораживали при –70°С. Как показано ранее [22] лизат нагретых клеток содержал все основные семейства БТШ.

Далее лизат клеток осаждали сульфатом аммония при 40% насыщения c последующим центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин и 4°С. Полученный супернатант осаждали сульфатом аммония при конечном насыщении 80%, затем также центрифугировали при 20 000 g в течение 20 мин и 4°C. Осадок, полученный после второго центрифугирования, растворяли в 4 мл дистиллированной воды и диализовали против 0.2 М фосфатно-солевой буфера (ФСБ), рН 7.2, при 4°С в течение 48 ч с частой сменой буфера. Полученные после этого экстракты использовали для дальнейшей хроматографической очистки.

Хроматографическая очистка антигенов. Очистку Аг проводили методом ионообменной хроматографии на колонке Toyopearl DEAE-650 (“Sigma-Aldrich”, США), образцы анализировали на хроматографе NGC Quest 10 (“Bio-Rad”, США). Носитель уравновешивали 0.05 М Трис-HCl, pH 7.5. Диализованный образец (100 мкл), содержащий 240 мкг белка, наносили на колонку. Элюцию белков проводили, используя ступенчатый градиент от 0 до 0.5 М NaCl и собирали фракции содержащие БТШ. Значения оптической плотности элюатов контролировали при 280 нм с помощью спектрофотометрического детектора Spectronic-21 (“Thermo Fisher Scientific”, США).

Аффинная селекция Ат из фаговой библиотеки. Ат, специфичные к БТШ, получали с использованием неиммунной фаговой библиотеки одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) человека (разнообразие 109 независимых клонов) [42]. В работе использовали процедуру селекции Ат, адаптированную под данную комбинаторную фаговую библиотеку и описанную в статье [43]. БТШ, выделенные из опухолевых клеток, иммобилизовали на мембране из поливинилиденфторида (PVDF), обработанной метанолом, в течение ночи при 4°С. Затем мембрану блокировали 2%-ным сухим молоком в ФСБ в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре, трижды промывали в ФСБ и использовали для селекции Ат. Мембрану с иммобилизованным Аг инкубировали с 1011 фаговых частиц в объеме 200 мкл библиотеки на шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч. Неспецифически сорбировавшиеся фаговые частицы отмывали 15 раз в ФСБ. Оставшиеся фаги элюировали 0.1 М глицин-HCl буфером рН 2.5 (500 мкл) на шейкере при комнатной температуре. Элюат фагов собирали и нейтрализовали 500 мкл 1 М Трис-HCl, pH 9.5.

Компетентную культуру Escherichia coli TG1 получали, выращивая клетки до логарифмической фазы роста при 37°С без встряхивания для образования F-пилей. Нейтрализованный элюат (1 мл) использовали для заражения E. coli TG1. После 30 мин инкубации культуры при 37°С без встряхивания инфицированные клетки осаждали центрифугированием при 2000 g 10 мин и пересевали на среду 2хYT (“BD Difco”, США) со 100 мкг/мл ампициллина (“Gibco”, Ирландия) и 1% глюкозы. Посев инкубировали на шейкере при 37°С в течение ночи. 1 мл культуры пересевали на 10 мл свежей 2хYT со 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы и инкубировали на шейкере при 37°С до достижении оптической плотности 0.4–0.6 при 600 нм (~3 ч). Затем клетки инкубировали 30 мин при 37°С без встряхивания и добавляли 1011 частиц хелперного фага M13KO7. После 30 мин инкубации при 37°С без встряхивания инфицированные клетки осаждали центрифугированием при 2000 g 10 мин и пересевали на среду 2хYT со 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина (“Gibco”, Ирландия) и 100 мкг/мл изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (“Thermo Fisher Scientific”, США). Посев инкубировали на шейкере при 30°С в течение ночи. После чего клетки осаждали центрифугированием при 2000 g 20 мин, супернатант дополнительно осветляли от дебриса центрифугированием при 10 000 g 20 мин. К супернатанту добавляли 1/5 объема раствора ПЭГ/NaCl, инкубировали при 0°С до образования видимого преципитата, который затем осаждали центрифугированием при 4000 g 1 ч. Осадок ресуспендировали в 1 мл ФСБ, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч до полного растворения и осветляли центрифугированием при 12 000 g в течение 10 мин. Супернатант, содержащий фаговые частицы, диализовали против ФСБ через диализную мембрану с пределом исключения 14–16 кДа при 4°С в течение суток 4-кратно меняя буфер. К диализату добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили при температуре –20°C до использования в следующем раунде селекции. По описанной выше схеме было проведено три последовательных раунда селекции.

Синтез наночастиц золота и получение конъюгатов с биоспецифическими зондами. Золотые наносферы диаметром 15 нм получали по методу Френса [44], используя реакцию восстановления HAuCl4 цитратом натрия. Восстановление проводили при нагревании 242.5 мл 0.01%-ного водного раствора HAuCl4 (“Sigma-Aldrich”, США) в колбе Эрленмейера на магнитной мешалке с обратным водяным холодильником. После закипания добавляли 7.5 мл 1%-ного водного раствора цитрата натрия (“Fluka”, Швейцария). Диаметр синтезированных НЧЗ был определен методами спектрофотометрии, трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и динамического рассеяния света (ДРС).

Перед конъюгацией 15-нм НЧЗ со стафилококковым белком А (“Sigma-Aldrich”, США) или с козьими Ат к IgG кролика (“Sigma-Aldrich”, США) определяли “золотое число” – минимальное количество белка, защищающее определенный объем золя от солевой агрегации [45]. Для этого в 96-луночном микротитровальном планшете двукратно по 20 мкл титровали водный раствор белка с начальной концентрацией 1 мг/мл. В каждую лунку добавляли по 200 мкл 15-нм НЧЗ (А520 = 1.0) и по 20 мкл 1.7 М NaCl и определяли минимальную стабилизирующую концентрацию. При получении конъюгата НЧЗ со стафилококковым белком А “золотое число” составило 6 мг/мл, с козьими Ат к IgG кролика – 12 мг/мл. Конъюгацию проводили простым смешением реагентов без использования сшивающих агентов, используя концентрацию белка на 20% превышающую “золотое число”.

Дот-блот иммуноанализ. Дот-иммуноанализ проводили по следующей методике [45]: в качестве образцов на PVDF мембрану, обработанную метанолом, или нитроцеллюлозную мембрану в виде серии точек наносили по 1 мкл двойных разведений хроматографически очищенного Аг либо полученной от животных сыворотки и инкубировали в течение ночи при 4°С для фиксации Аг. Затем проводили блокирование мембраны с нанесенным на нее Аг в течение 1 ч 2%-ным сухим молоком, разведенным в 10 мМ ФСБ, pH 7.2. Затем мембрану инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч в растворе фаговых Ат с концентрацией 1012 фагов/мл. После трехкратной промывки в ФСБ мембрану инкубировали на шейкере в 2 мл ФСБ с 50 мкл раствора кроличьих антифаговых Ат. При наличии биоспецифического взаимодействия Ат связывались с Аг, адсорбированным на мембране. Далее мембрану трижды отмывали в ФСБ от неспецифически связавшихся Ат и погружали в раствор конъюгата НЧЗ (А520 = 1) со стафилококковым белком А в случае БТШ, либо с козьими Ат к IgG кролика в случае сывороток. Связывание конъюгата с комплексом Аг-Ат можно было визуально наблюдать в виде серии красных пятен. Аналогично проводили дот-иммуноанализ с использованием в качестве маркера моноклональных Ат к IgG кролика, меченных пероксидазой хрена (“Jackson ImmunoResearch”, Великобритания).

После электрофореза хроматографически очищенного Аг в ПААГ с ДДС по Лэммли образцы переносили полусухим способом на PVDF мембрану и инкубировали в течение 1 ч в блокирующем ФСБ, содержащем 0.1%-ный Твин 20 и 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану инкубировали в течение 1 ч в полученных фаговых Ат с концентрацией 1012 фагов/мл. После трехкратной отмывки мембрану погружали в раствор кроличьих антифаговых Ат. Затем мембрану трижды отмывали в ФСБ от неспецифически связавшихся Ат и погружали в раствор конъюгата НЧЗ (А520 = 1) со стафилококковым белком А.

Иммуноферментный анализ. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) проводили по общепринятой схеме [46]. В лунку планшета адсорбировали полученную от животных сыворотку (в качестве отрицательного контроля использовали сыворотку от здорового животного), разведенную 1 : 20 0.05 М карбонат-бикарбонатным буфером, рН 9.6, в серии двойных разведений и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки промывали трехкратно ФСБ и блокировали свободные сайты связывания 200 мкл 2% сухого молока в 0.05 М карбонат-бикарбонатным буфере 1 ч на шейкере при 37°С. После чего в каждую лунку вносили разведенные в 100 раз миниантитела к БТШ и инкубировали в течение 1 ч на шейкере при 37°С. Затем после трехкратной отмывки добавляли в лунки по 100 мкл кроличьих антифаговых Ат, разведенных 1 : 500 в 10 мМ ФСБ (рН 7.4) и инкубировали в течение 1 ч на термошейкере при 37°С. После этого проводили трехкратную отмывку и добавляли в лунки по 100 мкл козьих Ат к IgG кролика, меченных пероксидазой хрена (“Sigma-Aldrich”, США), разведенных 1 : 500 в 10 мМ ФСБ (рН 7.4) и инкубировали в течение 1 ч на термошейкере при 37°С. Затем трижды отмывали карбонат-бикарбонатным буфером. В качестве субстрата пероксидазы использовали 100 мкл 0.006%-ного ортофенилендиамина (“Fluсka”, Швейцария) в 0.1 М цитратном буфере, рН 6.0, содержащем 0.01% пероксида водорода. Инкубацию с субстратом проводили в темноте. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0.1 М серной кислоты. Результаты реакции регистрировали на микропланшетном спектрофотометре Multiskan Accent+ (“Thermo Fisher Scientific”, США) при длине волны 490 нм.

Имплантация животным опухолевых клеток. В исследовании были использованы белые мыши линии BALB/c (18–20 г). Мыши были приобретены в Отделе экспериментальных животных с виварием Российского научно-исследовательского противочумного института “Микроб” (Россия). Животным подкожно трансплантировали опухолевые клетки MH22a. Их вводили в холку в дозе 1 × 109 кл./мышь (n = 4). Первые признаки опухолей появились через 14 дней после заражения; на 37 сут опухоли были наиболее отчетливо выражены. В процессе наблюдения проводили забор крови на наличие БТШ в сыворотке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика синтезированных НЧЗ. Диаметр синтезированных НЧЗ был определен методами спектрофотометрии, ТЭМ и ДРС. Максимум спектра поглощения полученного золя составил λmax = = 518.7 нм, при этом оптическая плотность была A520 = 1.15. По данным TЭM и ДРС, средний диаметр полученных наночастиц составил 15.4 нм. Число частиц в 1 мл при А520 = 1 составляло 1.6 × 1012.

Проверка активности миниантител к БТШ. Для получения фаговых Ат к БТШ, выделенным из клеток опухолевых линий гепатомы и плазмоцитомы, проводили три раунда селекции. Активность полученных после трех раундов селекции миниантител проверяли методом дот-иммуноанализа, с использованием в качестве аналита хроматографически очищенного термостабильного Аг (начальная концентрация 1 мг/мл), а в качестве маркера – конъюгата НЧЗ со стафилококковым белком А (рис. 1). Минимальное количество Аг, обнаруживаемое предложенным способом анализа, составило ~15 пг (седьмое разведение). Оценку специфичности полученных фаговых Ат осуществляли с использованием Вестерн-блота. Фаговые Ат специфически распознавали пептиды в области 45–66 кДА.

Рис. 1.

Дот-иммуноанализ Аг, выделенных из клеток линии МН22а (а) и линии Sp2/0-Ag14 (б) с использованием миниантител, полученных из неиммунной фаговой библиотеки scFv человека после третьего раунда селекции. Вторичные Ат – кроличьи антифаговые IgG. Мечение – конъюгат НЧЗ со стафилококковым белком А. (Двойные разведения, начальная концентрация 1 мг/мл).

Анализ накопления БТШ в сыворотке крови мышей с ксенотрансплантированными опухолями. С использованием полученных фаговых Ат методом дот-иммуноанализа была качественно изучена динамика концентрации БТШ в сыворотке крови мышей с имплантированными опухолевыми клетками линии МН22а (рис. 2). С 14 дня после трансплантации визуально наблюдалось усиление окрашивания комплексов Аг-Ат, выявляемое с применением конъюгата НЧЗ с козьими Ат к IgG кролика, что свидетельствовало о нарастании концентрации БТШ в сыворотке крови.

Рис. 2.

Динамика накопления БТШ в сыворотки крови мышей после имплантации опухоли (с 3 по 37 сут), определенная методом дот-иммуноанализа с использованием миниантител, полученных из неиммунной фаговой библиотеки scFv человека после третьего раунда селекции. Вторичные Ат – кроличьи антифаговые IgG. Мечение – конъюгат НЧЗ с козьими Ат к IgG кролика.

С помощью полученных фаговых Ат методом твердофазного ИФА была количественно изучена динамика концентрации БТШ в сыворотке крови мышей с имплантированными опухолевыми клетками линии МН22а. После имплантирования опухолевых клеток мышам наблюдали рост опухоли, начиная с 14 дня после трансплантации. В этот период отмечалось повышение уровня БТШ в сыворотки крови мышей, их концентрация составила 0.15 ± 0.05 мкг/мл. В дальнейшем наблюдался постепенный рост концентрации БТШ в сыворотке крови и на 37 сут (когда опухоль была наиболее выражена) уровень БТШ в сыворотке составил 0.35 ± 0.1 мкг/мл (рис. 3). Приведенные в работе результаты, полученные с помощью фаговых Ат, соответствуют показателям уровня БТШ (в норме и при опухолевом процессе), определенного методом твердофазного ИФА с использованием моноклональных Ат [47].

Рис. 3.

Динамика изменения концентрации БТШ в сыворотке крови мышей после имплантации опухоли, определенная методом твердофазного ИФА с использованием миниантител, полученных из неиммунной фаговой библиотеки scFv человека после третьего раунда селекции. Вторичные Ат – кроличьи антифаговые IgG. Выявление – козьи Ат к IgG кролика, меченные пероксидазой хрена.

Поскольку изменение уровня БТШ в сыворотке животных является маркером не только для диагностики, но и для прогноза лечения опухоли, был проведен анализ изменения уровня БТШ в сыворотке крови спонтанно заболевших животных. Известно, что иммунохимическая детекция БТШ с использованием антител зависит не от видов лабораторных животных, а от наличия БТШ в опухолях и сыворотках крови [48, 49]. В экспериментах использовали трех стерилизованных кошек возрастом 9 (К1; фибросаркома), 12 (К2; аденома молочной железы) и 13 (К3; аденокарцинома молочной железы) лет с подтвержденными онкологическими диагнозами. Кроме клинических признаков диагнозы были подтверждены цитологическими и гистопатологическими исследованиями. С использованием дот-иммуноанализа установлено, что полученные фаговые Ат способны выявлять как выделенный и очищенный Аг (начальная концентрация 1 мг/мл), так и Аг, присутствующий в сыворотке крови спонтанно заболевших животных (рис. 4). Полученные миниантитела выявляли как выделенный из опухолевых клеток Аг (минимально выявляемое количество ~15 нг), так и детектировали Аг в сыворотках крови спонтанно заболевших животных.

Рис. 4.

Дот-иммуноанализ БТШ, выделенного из клеток линии МН22а (а; двойные разведения, начальная концентрация 1 мг/мл), и в сыворотке крови спонтанно заболевших животных (б) с использованием миниантител, полученных из неиммунной фаговой библиотеки scFv человека после третьего раунда селекции. Вторичные Ат – кроличьи антифаговые IgG. Выявление – моноклональные Ат к IgG кролика, меченные пероксидазой хрена. Пояснения к обозначениям приведены в тексте.

Таким образом, показано, что фаговые Ат имеют большой потенциал для эффективного мониторинга накопления БТШ в сыворотке крови животных с имплантированными опухолями как качественно – с использованием дот-иммуноанализа, так и количественно – с применением твердофазного ИФА.

Следует отметить, что фаговые Ат имели ряд преимуществ перед другими типами Ат, в том числе:

− отсутствие необходимости использования лабораторных животных и длительного поддержания культур клеток эукариот;

− время получения индивидуальных клонов-продуцентов миниантител составляло 10–14 дней, по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии или процедуры иммунизации животных;

− относительная простота получения Ат и их низкая себестоимость.

В дальнейшем фаговые Ат к опухолевым Аг могут быть использованы для мониторинга иммунного ответа как у животных с ксенотрансплантированными опухолями, так и у спонтанно заболевших животных. Полученные результаты могут послужить основой для создания диагностических тест-систем, в том числе, биосенсорных, для мониторинга роста опухолей ненаружной локализации, когда болезнь поначалу протекает без внешних проявлений, а также для прогнозирования эффективности процессов лечения и вакцинации. Полученные в работе фаговые Ат, специфичные к БТШ, являются перспективными для применения в качестве распознающего элемента биосенсоров при диагностике опухолей. Большинство сенсорных систем для индикации онкологических заболеваний ориентированы на применение в качестве сенсорного элемента Ат [31] и фаговых Ат [50], аптамеров [51], амплификации микроРНК на основе дуплекс-специфической нуклеазы [52], а также мониторинга активных форм кислорода [53, 54]. Представленное исследование отличается от уже описанных методов тем, что ориентировано на использование фаговых Ат в качестве эффективного инструмента для мониторинга накопления БТШ. В дальнейшем полученные фаговые Ат могут быть использованы в качестве распознающего элемента сенсорных систем при определении БТШ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного Фонда проект № 19-14-00077.

Список литературы

  1. Schlesinger M.J. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 21. P. 12111–12114.

  2. Richter K., Haslbeck M., Buchner J. // Mol. Cell. 2010. V. 40. P. 253–266.

  3. Albakova Z., Siam M.K.S., Sacitharan P.K., Ziganshin R.H., Ryazantsev D.Y., Sapozhnikov A.M. // Transl. Oncol. 2021. V. 14. № 2. 100995. https://doi.org/10.1016/j.tranon.2020.100995

  4. Arrigo A.P., Gibert B. // Cancers. 2014. V. 6. P. 333–365.

  5. Calderwood S.K., Gong J. // Trends Biochem. Sci. 2016. V. 41. P. 311–323.

  6. Das J.K., Xiong X., Ren X., Yang J.-M., Song J. // J. Oncol. 2019. V. 2019. 3267207.https://doi.org/10.1155/2019/3267207

  7. Hu C., Yang J., Qi Z., Wu H., Wang B., Zou F., Mei H., Liu J., Wang W., Liu Q. // MedComm. 2022. V. 3. № 3. e161. https://doi.org/10.1002/mco2.161

  8. Staroverov S.A., Kozlov S.V., Brovko F.A., Fursova K.K., Shardin V.V., Fomin A.S. et al. // Biosens. Bioelectron. X. 2022. V. 11. 100211. https://doi.org/1.1016/j.biosx.2022.100211

  9. Murshid A., Gong J., Stevenson M.A., Calderwood S.K. // Expert Rev. Vaccines. 2011. V. 10. № 11. P. 1553–1568.

  10. Троицкая О.С., Новак Д.Д., Рихтер В.А., Коваль О.А. // Acta Naturae. 2022. Т. 14. № 1. С. 40–53.

  11. Shevtsov M., Multhoff G. // Front. Immunol. 2016. V. 7. P. 171. https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.00171

  12. Komarova E.Y., Suezov R.V., Nikotina A.D., Aksenov N.D., Garaeva L.A., Shtam T.A. et al // Sci. Rep. 2021. V. 11. 21314. https://doi.org/10.1038/s41598-021-00734-4

  13. Tsan M.F., Gao B. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2004. V. 286. № 4. P. C739–C744.

  14. Maki R.G., Livingston P.O., Lewis J.J., Janetzki S., Klimstra D., Desantis D., Srivastava P.K., Brennan M.F. // Dig. Dis. Sci. 2007. V. 52. № 8. P. 1964–1972.

  15. Bolhassani A., Rafati S. // Expert Rev. Vaccines. 2008. V. 7. № 8. P. 1185–1199.

  16. Kang J., Lee H.-J., Lee J., Hong J., Kim Y.H., Disis M.L., Gim J.-A., Park K.H. // J. Immunother. Cancer. 2022. V. 10. e004702. https://doi.org/10.1136/jitc-2022-004702

  17. Alberti G., Vergilio G., Paladino L., Barone R., Cappello F., de Macario E.C. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. 7792. https://doi.org/10.3390/ijms23147792

  18. Testori A., Richards J., Whitman E., Mann G.B., Lutzky J., Camacho L. et al. // J. Clin. Oncol. 2008. V. 26. № 6. P. 955–962.

  19. Lin M.J., Svensson-Arvelund J., Lubitz G.S., Marabelle A., Melero I., Brown B.D., Brody J.D. // Nat. Cancer. 2022. V. 3. P. 911–926.

  20. Fritah H., Rovelli R., Chiang C.L.-L., Kandalaft L.E. // Cancer Treat. Rev. 2022. V. 106. 102383. https://doi.org/10.1016/j.ctrv.2022.102383

  21. Liu J., Fu M., Wang M., Wan D., Wie Y., Wei X. // J. Hematol. Oncol. 2022. V. 15. P. 28. https://doi.org/10.1186/s13045-022-01247-x

  22. Dykman L.A., Staroverov S.A., Kozlov S.V., Fomin A.S., Chumakov D.S., Gabalov K.P. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. № 22. 14313. https://doi.org/10.3390/ijms232214313

  23. Jolly C., Morimoto R.I. // J. Natl. Cancer Inst. 2000. V. 92. № 19. P. 1564–1572.

  24. Yun C.W., Kim H.J., Lim J.H., Lee S.H. // Cells. 2020. V. 9. № 1. P. 60. https://doi.org/10.3390/cells9010060

  25. Cornford P.A., Dodson A.R., Parsons K.F., Desmond A.D., Woolfenden A., Fordham M., Neoptolemos J.P., Ke Y. // Cancer Res. 2000. V. 60. № 24. P. 7099–7105.

  26. Saini J., Sharma P.K. // Curr. Drug Targets. 2017. V. 19. № 13. P. 1478–1490.

  27. Ciocca D.R., Calderwood S.K. // Cell Stress Chaperon. 2005. V. 10. № 2. P. 86–103.

  28. Seigneuric R., Mjahed H., Gobbo J., Joly A.-L., Berthenet K., Shirley S., Garrido C. // Front. Oncol. 2011. V. 1. P. 37. https://doi.org/10.3389/fonc.2011.00037

  29. Ramirez-Valles E.G., Rodríguez-Pulido A., Barraza-Salas M., Martínez-Velis I., Meneses-Morales I., Ayala-García V.M., Alba-Fierro C.A. // Technol. Cancer Res. Treat. 2020. V. 19. 1533033820957033. https://doi.org/10.1177/1533033820957033

  30. Mahato K., Maurya P.K., Chandra P. // 3 Biotech. 2018. V. 8. P. 149. https://doi.org/10.1007/s13205-018-1148-8

  31. Cavallaro S., Horak J., Hååg P., Gupta D., Stiller C., Sahu S.S., Görgens A. et al. // ACS Sens. 2019. V. 4. № 5. P. 1399–1408.

  32. Baghbaderani S.S., Mokarian P., Moazzam P. // Curr. Anal. Chem. 2022. V. 18. № 1. P. 63–78.

  33. Smith G.P. // Science. 1985. V. 228. № 4705. P. 1315–1317.

  34. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. // Nature. 1990. V. 348. № 6301. P. 552–554.

  35. Zhao F., Shi R., Liu R., Tian Y., Yang Z. // Food Chem. 2021. V. 339. 128084. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128084

  36. Ye J., Guo J., Li T., Tian J., Yu M., Wang X. et al. // Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2022. V. 21. № 2. P. 1843–1867.

  37. Guliy O.I., Evstigneeva S.S., Dykman L.A. // Biosens. Bioelectron. 2023. V. 222. 114909. https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114909

  38. Trilling A.K., De Ronde H., Noteboom L., Van Houwelingen A., Roelse M., Srivastava S.K. et al // PLoS One. 2011. V. 6. № 10. e26754. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026754

  39. Vostakolaei M.A., Molavi O., Hejazi M.S., Kordi S., Rahmati S., Barzegari A., Abdolalizadeh J. // J. Cell. Biochem. 2019. V. 120. № 9. P. 14711–14724.

  40. Skarga Y., Vrublevskaya V., Evdokimovskaya Y., Morenkov O. // Biomed. Chromatogr. 2009. V. 23. № 11. P. 1208–1216.

  41. Aguilera R., Saffie C., Tittarelli A., Gonzalez F.E., Ramírez M., Reyes D. et al. // Clin. Cancer Res. 2011. V. 17. № 8. P. 2474–2483.

  42. Улитин А.Б., Капралова М.В., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Булгакова Е.В., Фурсова К.К. и др. // Доклады Академии наук. 2005. Т. 405. № 4. С. 555–558.

  43. Staroverov S.A., Kozlov S.V., Fomin A.S., Gabalov K.P., Khanadeev V.A., Soldatov D.A. et al. // ADMET & DMPK. 2021. V. 9. № 4. P. 255–266.

  44. Frens G. // Nature Phys. Sci. 1973. V. 241. P. 20–22.

  45. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. // Биохимия. 1997. Т. 62. № 4. С. 411–418.

  46. Shah K., Maghsoudlou P. // Br. J. Hosp. Med. 2016. V. 77. № 7. P. C98–C101.

  47. Gunther S., Ostheimer C., Stang S., Specht H.M., Mozes P., Jesinghaus M. et al // Front. Immunol. 2015. V. 6. P. 556. https://doi.org/10.3389/fimmu.2015.00556

  48. Romanucci M., Bastow T., Della Salda L. // Cell Stress Chaperon. 2008. V. 13. № 3. P. 253–262.

  49. Ramkaran, Preeti, Kumar R., Kumar S., Gera S. // Pharma Innov. J. 2019. V. 8. № 2. P. 431–434.

  50. Petrenko V.A., Gillespie J.W., Xu H., O’Dell T., De Plano L.M. // Viruses. 2019. V. 11. 785. https://doi.org/10.3390/v11090785

  51. Yu Q., Zhao Q., Wang S., Zhao S., Zhang S., Yin Y., Dong Y. // Anal. Biochem. 2020. V. 594. 113591. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113591

  52. Djebbi K., Xing J., Weng T., Bahri M., Elaguech M.A., Du C. et al // Anal. Chim. Acta. 2022. V. 1208. 339778. https://doi.org/10.1016/j.aca.2022.339778

  53. Li Y., Hu K., Yu Y., Rotenberg S.A., Amatore C., Mirkin M.V. // J. Am. Chem. Soc. 2017. V. 139. № 37. P. 13055–13062.

  54. Vaneev A.N., Gorelkin P.V., Garanina A.S., Lopatukhina H.V., Vodopyanov S.S., Alova A.V. et al. // Anal. Chem. 2020. V. 92. P. 8010−8014.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал