Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 4, стр. 369-375

МЕТОДИКА

Объект исследования и условия культивирования. В работе использовали штамм микромицета A. terreus 2, отобранный в результате предыдущей работы в качестве продуцента протеиназ – активаторов прекалликреина плазмы крови человека [13].

Для получения посевного материала с поверхности культуры микромицета, выращенной в пробирках на скошенном сусло-агаре в течение 7 сут при 25°C, проводили смыв спор в качалочные колбы емкостью 750 со 100 мл питательной среды с суслом, глюкозой и пептоном [18]. Через 2 сут выращивания в термостатированном шейкере инкубаторе (ES-20/80, “Biosan”, Латвия) при 28°С и 200 об./мин, часть биомассы переносили в ферментационную среду следующего состава (%): глюкоза – 3.0, глицерин – 7.0, гидролизат рыбной муки – 0.5, NaNO₃ – 0.2, KH₂PO₄ – 0.05, MgSO₄ – 0.05, рН 5.5 [13]. Культивирование микромицета продолжали при тех же условиях в течение 5 сут.

Выделение протеиназы – активатора прекалликреина. Протеиназу выделяли из 1 л фильтрата культуральной жидкости (КЖ) осаждением белков сульфатом аммония при степени насыщения 0.8 на холоду в течение 12 ч, центрифугированием полученного осадка и его последующим диализом в диализных мешках против 0.0001 М Трис-НСl-буфера, рН 8.2. Полученный после диализа раствор лиофильно высушивали. Фракционирование белков полученного препарата осуществляли препаративным изоэлектрофокусированием при 4°С в градиенте рН амфолинов 2.5–5.0 и градиенте плотности сахарозы 0–40% в колонке объемом 110 мл (“LKB”, Швеция) при напряжении 800 В в течение 36 ч [11, 12]. Во фракциях, полученных с колонки, определяли рН, поглощение при 280 нм и протеолитическую активность. Чистоту протеиназы определяли с помощью электрофореза в 15%-ном ПААГ с Na-ДДС по методу Лэммли.

Для определения молекулярной массы фермента использовали набор метчиков Unstained Protein Molecular Weight Marker (“Thermoscientific”, США). Окрашивание геля осуществляли ацетатно-спиртовым раствором Кумасси бриллиантового синего R-250. Для отмывки геля от красителя использовали 7%-ную уксусную кислоту.

Определение белка. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм в кювете с длиной пути в 1 см [19].

Определение активности протеиназы A. terreus 2. Протеолитическую активность определяли по расщеплению хромогенного пептидного субстрата плазмина – Н-D-валил-L-лейцил-L-лизин-п-нитроанилида (H-D-Val-Leu-Lys-pNA), как описано ранее [13]. Активаторную к прекалликреину активность определяли по расщеплению хромогенного пептидного субстрата H-D-пролил-L-фенилаланил-L-аргинин-п-нитроанилида (H-D-Pro-Phe-Arg-pNA) после предварительной инкубации пробы с плазмой человека как писано в работе [13].

За 1 единицу активности (Е) принимали количество мкмоль п-нитроанилина, образующегося в результате гидролиза в 1 мл пробы за 1 мин. Измерение оптической плотности проводили при 405 нм на спектрофотометре Hitachi 200-20 (“Hitachi”, Япония).

Выявление углеводного компонента протеиназы. Углеводный компонент в составе выделенной протеиназы определяли с использованием периодной кислоты и реактива Шиффа (фуксинсернистой кислоты) методом дот-блоттинга на нитроцеллюлозных мембранах [20]. В качестве положительного контроля на реакцию использовали раствор внеклеточной дрожжевой инвертазы, в качестве отрицательного – БСА, в концентрациях 0.5 мг/мл.

Определение субстратной специфичности. Субстратную специфичность протеиназы определяли по гидролизу хромогенных пептидных субстратов – пара-нитроаналидов, расщепляемых протеиназами системы гемостаза: плазмина – H-D-Val-Leu-Lys-pNA (S-2251), Xa фактора – Bz-Ile-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNA (S-2222) и Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (S-2765), урокиназы – pGlu-Gly-Arg-pNA (S-2444), тромбина – Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (Chromozym TH) и тканевого активатора плазминогена – H-D-Ile-Pro-Arg-pNA (S-2288); а также хромогенные субстраты трипсина Bz-Arg-pNA, химотрипсина Ac-Phe-pNA и субтилизина Z-Ala-Ala-Leu-pNA, использовали субстраты с разным сочетанием аминокислот в хромопептиде: Ac-Leu-Gly-Arg-pNA, Z-Gly-Gly-Leu-pNА, pGlu-Ala-Ala-Phe-Leu-pNA, Suc-Ala-Ala-Ala-pNA и Ac-Leu-Tyr-pNA. Реакции с данными субстратами проводили по методике определения активности как описано выше.

Изучение действия ингибиторов протеиназ. Использовали ингибиторы: ЭДТА (1.1 мг/мл) и о-фенантролин (0.5 мг/мл) – ингибиторы металлопротеиназ; п-ХМБ (0.5 мг/мл) – ингибитор цистеиновых протеиназ; PMSF (фенилметилсульфонил фторид, 0.3 мг/мл) – ингибитор сериновых протеиназ; TPCK (тозилфенилаланилхлорметилкетон, 0.4 мг/мл) – ингибитор химотрипсиноподобных протеиназ; TLCK (тозиллизинхлорметилкетон, 0.4 мг/мл) и соевый ингибитор трипсина (1.1 мг/мл) – ингибиторы трипсиноподобных протеиназ. Действие ингибиторов исследовали в молярном соотношении фермент : ингибитор 1 : 10 и 1 : 100 [15]. Начальную и остаточную протеолитическую активности фермента определяли при 37°С как описано выше после предынкубации фермента с ингибитором в течение 60–120 мин при 25°С и выражали в процентах от контроля (без ингибитора).

Определение физико-химических свойств протеиназы. Кинетические параметры – максимальную скорость реакции (V_max), и константу Михаэлиса (K_m) определяли по гидролизу субстратов плазмина и тромбина, которые использовали в концентрациях 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 мг/мл соответственно. Кинетику реакции снимали в автоматическом режиме при использовании компьютерного обеспечения на спектрофотометре Cary 50 UV-Vis (“Varian”, США). Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов строили в координатах Лайнуивера – Берка.

рН-оптимум активности протеиназы определяли в 0.4 М универсальном (натрий-ацетат-фосфат-боратном) буфере со значениями рН от 3.0 до 11.0. К 150 мкл буфера с соответствующим значением рН добавляли 100 мкл раствора фермента и 100 мкл раствора субстрата.

Для определения рН-стабильности фермента проводили инкубацию протеиназы в растворах буфера с разными значениями рН при 37°С в течение 2 ч, после чего определяли активность с субстратом тромбина. Остаточную активность выражали в % от исходной.

Температурный оптимум действия протеиназы определяли в 0.05 М Трис-HCl-буфере, рН 8.2 по тромбиноподобной активности при 25, 30, 37, 45, 55 и 65°С. Термостабильность фермента оценивали после инкубации фермента при заданных температурах в течение 2 ч и выражали в % от исходной .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Протеиназу – активатор прекалликреина, образуемую A. terreus 2, выделяли из культуральной жидкости осаждением сульфатом аммония, затем с помощью препаративного колоночного изоэлектрофокусирования. Фракции с наибольшей активаторной к прекалликреину и плазминоподобной активностью имели pI 4.6–4.7 (рис. 1). Удельная активаторная к прекалликреину активность выделенной протеиназы составила 1.1 Е/мг белка × 10^–3.

Рис. 1.

Изоэлектрофокусирование препарата внеклеточных белков культуральной жидкости A. terreus 2. 1 – рН, 2 – активаторная к прекалликреину активность, 3 – белок.

Для проверки гомогенности полученной белковой фракции с наибольшим значением целевых активностей после изоэлектрофокусирования и установления молекулярной массы активного фермента использовали разделение белков с помощью электрофореза в ПААГ с Na-ДДС по методу Лэммли. Было установлено, что внеклеточная протеиназа микромицета A. terreus 2 представляла собой белок с молекулярной массой около 37 кДа (рис. 2).

Рис. 2.

Денатурирующий электрофорез в ПААГ (по Лэммли) протеиназы – активатора прекалликреина, образуемой A. terreus 2. 1 – активная фракция после изоэлектрофокусирования, М – метчики.

Выявление углеводного компонента у протеиназы-активатора прекалликреина, образуемой A. terreus 2, показало, что фермент гликозилирован (рис. 3). Примечательно, что протеиназа-активатор другого профермента системы гемостаза – протеина С, полученная при культивировании A. ochraceus L-1 не была гликозилированным белком [20].

Рис. 3.

Результат качественной реакции на гликопротеины с протеиназой – активатором прекалликреина, образуемой A. terreus 2. 1–инвертаза (положительный контроль); 2 – БСА (отрицательный контроль), 3 – протеиназа A. terreus 2.

Была изучена субстратная специфичность внеклеточной протеазы A. terreus 2 с хромогенными пептидными субстратами. Из представленных в табл. 1 данных видно, что выделенная протеиназа-активатор проявляла высокую протеолитическую активность только с субстратами тромбина и плазмина. С остальными использованными хромогенными субстратами наблюдались лишь следовые активности, вне зависимости от аминокислотной последовательности в хромопептиде. Замена аминокислот в положениях P₁, Р₂ и Р₃ хромогенных пептидных субстратов не оказывала существенного влияние на их расщепление (табл. 1).

Таким образом, на основе проведенного анализа субстратной специфичности, можно сделать вывод, что протеиназа-активатор прекалликреина, образуемая микромицетом A. terreus 2, имела довольно широкую субстратную специфичность. По-видимому, в результате процессинга, протеиназа проявляет автокаталитическую функцию, чем обусловлена ее способность к реакции ограниченного протеолиза – активации прекаллекреина – в участке полипептидной цепи, гомологичной по аминокислотному составу, а экскретируясь, она обеспечивает микромицет разнообразием аминокислот, расщепляя различные белковые субстраты.

Кинетические параметры выделенной протеиназы A. terreus 2 определяли в реакциях с хромогенными пептидными субстратами плазмина и тромбина. Рассчитанное значения K_m для субстрата H-D-Val-Leu-Lys-pNA составило 3.17 ммоль/мл, V_max – 4.16 ммоль/мин × мл. Для субстрата Tos-Gly-Pro-Arg-pNA значения K_m и V_max составили 2.91 ммоль/мл и 4.26 ммоль/мин × мл соответственно.

Значения K_m и V_max для протеиназ, образуемых A. ochraceus L-1 и A. terreus 2 оказались близки. Однако, судя по сравнению величин K_m, скорость реакции протеиназы A. ochraceus L-1 ниже по сравнению с протеиназой-активатором из A. terreus 2 [20, 21].

По результатам ингибиторного анализа было сделано заключение о принадлежности протеиназы-активатора A. terreus 2 к классу сериновых протеаз. Ингибирование активности протеиназы-активатора PMSF в молярном соотношении фермент : ингибитор 1 : 100 составило 86%. Остальные использованные ингибиторы существенного влияния на активность протеиназы не оказывали (табл. 2).

Изучение зависимости активности протеиназы – активатора прекалликреина A. terreus 2 от рН показало, что наибольшее значение активности приходилось на значение рН 10 (рис. 4). Из литературы известно, что микромицеты вида A. terreus способны образовывать щелочные протеиназы, в том числе, находящие применение в промышленности в качестве компонентов моющих средств [14].

Рис. 4.

Влияние рН (а) и температуры (б) на активность (1) и стабильность (2) протеиназы – активатора прекалликреина, образуемой A. terreus 2.

Кроме того, фермент при рН 10 был и наиболее стабилен (рис. 4). После инкубации при этом рН, протеиназа проявляла высокую тромбиноподобную активность, тогда как при рН 11 активность резко снижалась и составляла после выдерживания в течении 2 ч уже порядка 32% от максимального. Также высокая активность протеиназы-активатора сохранялась после инкубации в растворе с рН 9 (76% от максимальной активности).

Была установлена оптимальная температура для проявлении активности внеклеточной протеиназы A. terreus 2 – 37°С, однако протеиназа проявляла активность в широком диапазоне температур: от 25 до 55°С (рис. 5 ). Активность протеиназы при 65°С снижалась почти в 3 раза по сравнению с максимальным значением активности при 37°С. Эта характеристика протеиназы крайне важна, так как максимум активности соответствовал физиологической температуре человеческого тела, что может быть значимым при разработке диагностического набора на прекалликреин плазмы крови человека с использованием выделенной протеиназы.

Изучение термостабильности протеиназы, показало, что она наиболее стабильна при инкубации при температуре 30°С. Несколько меньшие значения активности протеаза показала при температуре 25°С. После длительной инкубации при температуре от 37°С и выше протеиназа стремительно теряла активность (рис. 4).

Выделенная протеиназа-активатор, образуемая A. terreus 2 по ряду свойств, таких как значение pI, гликозилирование и активация прекалликреина, отличалась от близкой протеиназы-активатора, микромицета A. ochraceus L-1 (табл. 3). Установленные различия позволяют рассматривать протеиназы аспергиллов, способные к реакциям ограниченного протеолиза как новый пул ферментов, имеющих перспективы применения в диагностике при нарушениях системы гемостаза, а именно в качестве экзогенных активаторов с широкой или узкой субстратной специфичностью к проферментам этой системы.

Активатор прекалликреина человека, представляющий собой активированный β-фрагмент фактора Хагемана, интересен тем, что запускает трансформацию прекалликреина в калликреин, а это, в свою очередь, через серию биохимических реакций приводит к синтезу вазоактивного пептида – брадикинина. Поиск экзогенных активаторов этого фактора системы гемостаза может позволить проводить более корректную диагностику ряда заболеваний и делает протеиназу A. terreus 2 интересным компонентом таких тест-систем.

Таким образом, протеиназа-активатор прекалликреина плазмы крови человека, выделенная из культуральной жидкости микромицета A. terreus 2, представляет собой сериновую гликозилированную протеиназу с молекулярной массой ~34 кДа и оптимумом рН для проявления активности 10.0 и оптимумом температуры 37°С. По ряду свойств данная протеиназа сходна с протеиназой-активатором протеина С, образуемой микромицетом A. ochraceus L-1.

Работа выполнена при финансовой поддержке Совета по грантам Президента РФ № СП-3906.2021.4.