Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 5, стр. 472-482

МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования был выбран штамм Caldalkalibacillus mannanilyticus IB-OR17-B1 из коллекции Уфимского института биологии УФИЦ РАН. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) под номером В-2715D. Идентификация таксономического положения штамма была осуществлена ранее на основе изучения его физиолого-биохимических свойств и анализа гена 16S рРНК [20]. Последовательность 16S рДНК C. mannanilyticus IB-OR17-B1 депонирована в Генбанке NCBI под номером HE663240. После недавней таксономический ревизии семейства Bacillaceae [21], возникла необходимость в дополнительном уточнении филогенетического положения исследуемого штамма. Сравнительный анализ и поиск гомологичных последовательностей гена 16S рРНК проводили с помощью ресурсов EzBioCloud [22] и GenBank, а также онлайн-программ BLAST и MOLEBLAST [23]. Расчет эволюционных расстояний осуществляли по принципу максимального правдоподобия, филогенетическое дерево строили методом присоединения соседей, используя программу Mega X 10.0.4 [24]. Устойчивость топологии дендрограммы оценивали с помощью бутстреп-анализа из 500 заданных повторностей [25].

Культуру поддерживали на плотной питательной среде К1 следующего состава (мас. %,): крахмал картофельный – 1.0; пептон – 0.4; дрожжевой экстракт – 0.5; КH₂PO₄ – 0.1; Na₂HPO₄ – 0.1; агар – 1.5, рН среды доводили до 7.9–8.0 добавлением 10%-ного стерильного раствора Na₂CO₃. Для наработки препарата ЦГТазы штамм выращивали в жидкой среде того же состава без добавления агара (см. выше). Культивирование проводили в течение 96 ч в колбах Эрленмейера на 250 мл в шейкере-инкубаторе Innova 40R (“New Brunswick Scientific”, США) при 250 об./мин и 50°C.

Бактериальный рост оценивали по оптической плотности (ОП₆₀₀) культуральной жидкости (КЖ), измеренной на спектрофотометре СФ-56 (“ЛОМО-Спектр”, Россия) каждые 24 ч на протяжении 2–7 сут. Повторность измерений пятикратная.

Для выделения ЦГТазы из КЖ C. mannanilyticus IB-OR17-B1 бактериальные клетки удаляли центрифугированием на центрифуге ОПН-8 (“Дастан”, Киргизия) при 6000 об./мин в течение 30 мин. Полученный супернатант концентрировали с помощью ультрафильтрации на модуле VivaFlow 200 (“Sartorius”, Германия) с диаметром пор 30 кДа. Очистку ЦГТазы проводили методом крахмальной адсорбции по Мартинсу [26] с модификациями. К 20 мл концентрированного ферментного препарата добавляли нерастворимый кукурузный крахмал (5% вес/об.) и сульфат аммония до концентрации 1.0 М. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при пониженной температуре (8°C) и постоянном умеренном перемешивании для обеспечения максимально полной адсорбции фермента. Затем крахмал отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин и дважды промывали равным объемом холодной воды. Адсорбированный фермент элюировали, инкубируя субстрат в течение 30 мин в присутствии 5 мл 1.0 мМ β-ЦД в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 8.0) при 37°C и постоянном встряхивании, после чего смесь снова центрифугировали, как описано выше. Процедуру повторяли еще один раз с использованием 2 мл буфера для элюирования. Полученные элюаты объединяли (7 мл) и диализовали против 50 мМ трис-HCl буфера (рН 8.0) при 8°C.

Измерение активности ЦГТазы проводили фенолфталеиновым методом на спектрофотометре СФ-56 (“ЛОМО-Спектр”, Россия) при длине волны 553 нм [27]. Повторность измерений пятикратная. За 1 ед. активности ЦГТазы принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоля β-ЦД из 2%-ного раствора растворимого картофельного крахмала (рН 6.9) в течение 1 мин при 50°C.

Наличие циклизующей активности у исследуемого фермента оценивали модифицированным методом Тильдена-Хадсона [28]. Формирование кристаллов комплекса α- и β-ЦД в присутствии йода определяли после 30-минутной инкубации при 37°C 3%-ного растворимого картофельного крахмала и раствора ферментного препарата в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 6.9). Визуально образование кристаллов оценивали в световом микроскопе “Leica DL1000” (“Leica Microsystems”, Германия) при увеличении ×100. Изображения получали с помощью цифровой камеры “Leica DFC290” того же производителя.

Молекулярную массу и степень чистоты фермента оценивали методом денатурирующего электрофореза в 12%-ном ПААГ по Лэммли. Белки в геле окрашивали Кумасси ярко-синим G-250 (“Fluka”, Швейцария) по методике [29]. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор неокрашенных рекомбинантных белков “PageRuler Broad Range” 5–250 кДа (“Thermo Scientific”, США). Концентрацию белка в растворах определяли спектрофотометрически по методу Варбурга и Кристиана [30].

рН-Оптимум очищенной ЦГТазы (5.5 ед./мл) определяли в интервале рН 3–10, используя в качестве растворителя 50 мМ фосфатно-цитратный (рН 4–7), натрий-фосфатный (рН 7–8), трис-HCl (рН 8–9) и глицин-NaOH (pH 9–11) буферные растворы. Стабильность фермента при разных рН оценивали, инкубируя его в тех же буферных растворах (рН 3–10, разведение 1 : 10 об./об.) в течение 1 ч при 28°C, после чего измеряли остаточную активность при рН 8.0. Активность образца, не подвергавшегося инкубации, принимали равной 100%.

Для определения температурного оптимума ЦГТазы реакционную смесь инкубировали в течение 60 мин при рН 8.0 и температурах от 40 до 90°C с дальнейшей оценкой скорости накопления ЦД по стандартной методике. Термостабильность фермента оценивали по уровню его остаточной активности (%) после 60 мин инкубации в диапазоне 40–90°C в отсутствии субстрата. Перед термообработкой очищенную ЦГТазу (5.5 ед./мл) разбавляли в 10 раз 0.1 М натрий-фосфатным буфером, рН 8.0.

Влияние катионов металлов на активность ЦГТазы оценивали, выдерживая очищенный фермент в присутствии 5, 10 и 15 мМ разных солей Ag⁺, Ca²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, K⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, Ni²⁺, Pb²⁺ и Zn²⁺ (рис. 7). Все использованные в работе соли были марки “х. ч.”. Раствор фермента (5.5 ед./мл) разбавляли в 10 раз 0.1 М натрий-фосфатным буфером (pH 8.0), содержащим соли металлов в указанных концентрациях, и инкубировали смесь при 28°C в течение 1 ч, после чего определяли остаточную ферментативную активность стандартным методом. Аналогичным образом оценивали влияние ионов кальция и магния на термостабильность ЦГТазы при 70–80°C.

Анализ продуктов трансформации крахмала очищенной ЦГТазой осуществляли с помощью ВЭЖХ на жидкостном хроматографе “Laboratori Pristoje Praha” (Чехия). Реакционную смесь (5 мл) с ферментом в различных концентрациях (0.2–15 ед./г субстрата) и картофельный крахмал (3 мас. %), клейстеризованый в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 8.0), инкубировали в течение 24 ч при 60°C. После инкубации из реакционной смеси отбирали пробы по 900 мкл в микроцентрифужные пробирки. К каждой из проб в качестве внутреннего стандарта добавляли 90 мкл 10%-ного раствора ксилозы, затем вносили 990 мкл ацетонитрила и удаляли остатки нетрансформированного крахмала центрифугированием при 8000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге CM-50 (“ELMI”, Латвия). Супернатант разделяли на колонке “SEPARON-NH₂”-5 мкм (3 × 150 мм, “Tessek Ltd.”, Чехия), используя в качестве элюента смесь ацетонитрил–вода в объемном соотношении 63 : 37. Подачу растворителя осуществляли насосом НРР-5001 со скоростью 0.7 мл/мин, в качестве детектора использовали рефрактометр RIDK-102 (“Laboratori Pristoje Praha”, Чехия). Регистрацию и оцифровку аналогового сигнала с последующей обработкой хроматограмм проводили с помощью программно-вычислительного комплекса “Мультихром” 1.59 (“Амперсенд”, Россия). Калибровку прибора осуществляли методом внутреннего стандарта, используя индивидуальные ЦД фирмы “Wacker Chemie” (США).

Эксперименты проводили в трехкратной повторности, статистическую обработку результатов осуществляли, используя программу Origin 7.0 (Origin Lab Corp., США). Достоверность отличий опытных вариантов от контрольных оценивали с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при критерии вероятности р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Культура алкалофильных аэробных спорообразующих бактерий С. mannanilyticus IB-OR17-B1, известная ранее как Bacillus mannanilyticus IB-OR17-B1, была выделена в 2009 г. из донных отложений содового озера Белое (Россия). Вид Bacillus mannanilyticus изначально был назван в 2005 г. японскими исследователями при таксономической ревизии ранее выделенных штаммов алкалофильных бактерий [31]. Изменение текущего родового названия этого вида обусловлено недавним пересмотром классификации рода Bacillus на основе новых данных сравнительного филогеномного анализа более 300 геномов Bacillus/Bacillaceae [21]. Полученные результаты позволили выделить из рода Bacillus 17 отдельных монофилетических групп, составляющих, соответственно, новые рода семейства Bacillaceae. Род Caldalkalibacillus включает в настоящее время, помимо С. mannanilyticus еще три вида бактерий, проявляющих алкалофильные/алкалотолерантные и термофильные свойства [32, 33].

В связи с этим, текущее филогенетическое положение B. mannanilyticus IB-OR17-B1 было уточнено на основе сравнительного анализа последовательности гена 16S рРНК данного штамма и ранее охарактеризованных 4 видов Caldalkalibacillus, а также представителей близкородственных родов алкалофильных бактерий Alkalihalobacillus (7 видов), Fermentibacillus, Halalkalibacterium и Alkalihalobacterium. В эту группу включены также ближайшие по уровню сходства гена 16S рРНК последовательности алкалофильных продуцентов ЦГТаз. На филогенетическом дереве С. mannanilyticus IB-OR17-B1 образует общую кладу с референтными штаммами рода Caldalkalibacillus при высоком значении бутстреп-поддержки и показывает степень сходства 99.93% по отношению к типовому штамму вида Caldalkalibacillus mannanilyticus (рис. 1). Оценка филогенетического положения C. mannanilyticus IB-OR17-B1 внутри семейства Bacillaceae по последовательности гена 16S рРНК показала более высокую степень сходства данного штамма с представителями родов алкалофильных и галофильных бактерий, в отличие от аэробных и анаэробных термофилов, в том числе, продуцентов ЦГТаз, таких как Anaerobranca, Caldanaerobacter и Thermoanaerobacterium (последовательности не представлены на рис. 1). Топология филогении C. mannanilyticus IB-OR17-B1 совпадала с результатами филогенетической реконструкции, проведенной ранее для Caldalkalibacillus [34].

Рис. 1.

Филогенетическое положение штамма C. mannanilyticus IB-OR17-В1 по гену 16S рРНК (1523 п. о.) по отношению к ближайшим родам алкалофильных бактерий семейства Bacillaceae. Филогенетическое дерево построено методом присоединения соседей, в узлах приведены значения бутстреп-поддержки (>50%). В качестве внешней группы выбран представитель Paenibacillus polymyxa IAM 13419. Масштаб отражает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов.

Штамм С. mannanilyticus IB-OR17-B1 продуцировал внеклеточную β-маннаназу и хитиназу, а также обладал антагонистической активностью в отношении некоторых фитопатогенных грибов [20]. Однако до настоящего времени не сообщалось о способности бактерий этого вида к синтезу ЦГТаз и продукции ЦД.

Штамм С. mannanilyticus IB-OR17-B1 активно рос на агаризованной среде К1 при 45–50°С, формируя зоны просветления крахмала вокруг колоний, соответствующие области образования и накопления ЦД, что подтверждалось фенолфталеиновым методом (данные не представлены). Циклизующая активность исследуемого фермента в КЖ качественно подтверждалась положительной реакцией Тильдена–Хадсона на формирование кристаллов комплекса йод-ЦД. При микрокопировании продуктов ферментативной трансформации крахмала отмечалось образование небольших и коротких призм β-ЦД, окрашенных в светло-коричневый цвет и резко отличающихся от иглообразных друз, характерных для комплекса α-ЦД и йода (рис. 2).

Рис. 2.

Микрофотография кристаллов ЦД, образующихся при ферментативной трансформации 3%-ного растворимого картофельного крахмала (3 ч, 37°С) ЦГТазой C. mannanilyticus IB-OR17-В1, согласно тесту Тильдена-Хадсона. Стрелки и цифры показывают кристаллы α- (1) и β-ЦД (2) в виде игл и призм, соответственно. Световая микроскопия, цена деления = 100 мкм.

При культивировании в жидкой среде штамм показывал оптимум роста и синтеза ЦГТазы при 50°С. Накопление бактериальной биомассы достигало максимума на 48 ч, тогда как наибольший уровень секреции ЦГТазы достигался к 48−72 ч (рис. 3). Снижение ферментативной активности штамма к 96 ч культивирования, вероятно, связано не только с истощением исходного субстрата в среде, но и с накоплением в качестве побочных продуктов метаболизма глюкозы и мальтозы, оказывающих репрессирующее действие на синтез ЦГТазы [35].

Рис. 3.

Динамика роста (1) и продукции внеклеточной ЦГТазы (2) штаммом С. mannanilyticus IB-OR17-B1 при глубинном культивировании (250 об./мин, 50°C) в жидкой среде с 1%-ным картофельным крахмалом.

Основную изоформу фермента выделяли из фильтрата культуральной среды с помощью ультрафильтрации и последующей аффинной сорбции на крахмале. В ранее опубликованных работах очистка ЦГТаз осуществлялась, как правило, по более сложной схеме, включающей этапы ультрафильтрации, гель-фильтрации, адсорбции на крахмале и ионообменной хроматографии [36–39]. Для ЦГТазы из B. pseudalcaliphilus 20RF была применена комбинация ультрафильтрации и адсорбции на нерастворимом кукурузном крахмале (10 мас. %), что обеспечило мягкую и быструю процедуру очистки фермента с 18-кратным увеличением удельной активности и выходом 63% [40]. Данная схема была успешно воспроизведена для выделения ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1. Наиболее высокая степень очистки фермента отмечалась на этапе аффинной сорбции на крахмале (табл. 1). Предварительная оптимизация параметров сорбции ЦГТазы в зависимости от типа крахмала и его концентрации показала, что нерастворимый кукурузный крахмал (5 мас. %). является более эффективным сорбентом по сравнению с нерастворимым картофельным крахмалом, благодаря чему не требуется проведение дополнительных стадий очистки фермента (данные не представлены).

Итоговая степень очистки фермента составляла около 18× при выходе 56%, при этом фермент демонстрировал электрофоретическую гомогенность, достаточную для характеристики его физико-химических и каталитических свойств. Молекулярная масса очищенной ЦГТазы, согласно результатам денатурирующего электрофореза, составляла около 70 кДа (рис. 4).

Рис. 4.

Электрофореграмма препарата очищенной ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1 в 12.5%-ном ПААГ с 0.1% ДДС-Na (1); белковые маркеры М.М. (кДа) (2).

Близкие по молекулярной массе ЦГТазы были описаны ранее у штаммов алкалофильных бактерий Bacillus sp. 7–12 [41], B. pseudalcaliphilus 20RF [40] и B. pseudalcaliphilus 8SB [42].

Очищенный фермент проявлял наибольшую циклизующую активность при рН 8.0 (рис. 5а). рН-оптимум ранее охарактеризованных ЦГТаз варьировал в интервале рН 5–10, в зависимости от штамма-продуцента [40]. ЦГТаза С. mannanilyticus IB-OR17-B1 сохраняла 92–100% своей первоначальной активности в интервале рН 7–10. Очищенный фермент был более стабилен при щелочных значениях рН, теряя около 50% первоначальной активности при рН > 10, тогда как при рН < 7.0 полуинактивация фермента наблюдалась уже при рН ~ 5.5–5.6 (рис. 6а). Максимальная скорость конверсии крахмала ЦГТазой С. mannanilyticus IB-OR17-B1 отмечалась при 60°C, тогда как при 90°C фермент полностью терял свою активность (рис. 5б).

Рис. 5.

Влияние pH (а) и температуры (б) на активность очищенной ЦГТазы (%) С. mannanilyticus IB-OR17-B1. (Активность фермента в % от максимального значения).

Рис. 6.

Влияние pH при 28°C (а) и солей кальция и магния при 70°C (б) на стабильность очищенной ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1: 1 – контроль (фермент, инкубированный при 70°C без солей); 2, 3 – 5 и 10 мМ CaCl₂; 4, 5 – 5 и 10 мМ MgSO₄. На оси абсцисс – остаточная активность в % от первоначальной активности фермента, не подвергавшегося 1-часовой инкубации в интервале рН 4–11 (а) или 10–60-минутной термообработке при 70°C (б).

Важной особенностью ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1 была ее высокая термостабильность. Так, очищенный фермент сохранял более 60% первоначальной активности после 1 ч инкубации при 70°C (рис. 6б); период полуинактивации фермента составлял 1 ч при 75°C (данные не показаны). У штамма B. pseudalcaliphilus 20RF остаточная активность при 70°C составляла 31% после 30-минутной термообработки [40]. Охарактеризованные ранее ЦГТазы других видов алкалофильных бактерий отличались еще меньшей термостабильностью, сохраняя первоначальную активность при температурах не более 45–55°C [40]. Термостабильность ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1 при 70°C незначительно повышалась в присутствии 5–10 мМ хлорида кальция. Остаточная активность фермента после 1 ч инкубации возрастала примерно на 10% по сравнению с контролем (рис. 6б). Многие исследования показывают, что, подобно амилазам, ЦГТазы имеют консервативные сайты связывания ионов Ca²⁺, которые оказывают стабилизирующее действие на третичную структуру фермента, улучшая его термостабильность [38]. Добавление сульфата магния в тех же концентрациях оказывало менее выраженный положительный эффект: остаточная активность фермента после 30 мин термообработки увеличивалась не более чем на 5% (рис. 6б). Увеличение концентрации солей кальция и магния до 15 мМ не оказывало существенного влияния на стабильность фермента при 70°C (данные не представлены). Термостабильность ЦГТазы штамма B. pseudalcaliphilus 20RF кратно возрастала в присутствии катионов Ca²⁺ и Mg²⁺, а ее остаточная активность после 1 ч инкубации при 60°C составляла 72 и 46%, соответственно [40].рис. 7

Рис. 7.

Влияние катионов металлов на активность очищенной ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1. Концентрация солей металлов 5 мМ в 0.1 М натрий-фосфатном буфере (рН 8.0). 1 – NiCl₂, 2 – CaCl₂, 3 – MgSO₄, 4 – FeSO₄, 5 – CuSO₄, 6 – PbSO₄, 7 – ZnSO₄, 8 – MnSO₄, 9 – FeCl₃, 10 – CuCl₂, 11 – AgNO₃, 12 – K₂SO₄, 13 – Na₂SO₄. На оси абсцисс – остаточная активность фермента в % от активности в отсутствие солей (100%).

Таким образом, по сравнению с ЦГТазами, синтезируемыми штаммами других алкалофильных бактерий, ЦГТаза С. mannanilyticus IB-OR17-B1 отличалась высокой активностью и стабильностью при рН 7–10 и температурах 60–70°C, что является существенным фактором в выборе фермента для производства ЦД.

Влияние ионов металлов на ЦГТазы различного происхождения может носить как ингибирующий, так и активирующий характер. Катионы металлов зачастую необходимы для поддержания активной конформации многих ферментов [38]. Нами была проведена оценка влияния солей разных групп металлов в концентрации 5 мМ на активность очищенной ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1 (рис. 7). Наиболее выраженный ингибирующий эффект на ЦГТазу оказывали ионы серебра (снижение активности более, чем на 90%), далее в порядке убывания степени ингибирования следуют катионы меди, цинка, двух- и трехвалентного железа (снижение активности на 26, 23, 18 и 11% соответственно). Основной механизм ингибирования ЦГТазы катионами металлов может быть связан с окислением аминокислотных остатков фермента, участвующих в реакции циклизации [26]. Ранее сообщалось, что ионы меди оказывают значительное ингибирующее действие на ЦГТазы, продуцируемые штаммами Bacillus AL-6 [43], B. firmus [44, 45] и B. agaradhaerens [26], в отличие от фермента из B. pseudalcaliphilus 20RF, который сохранял 90% своей активности в присутствии 15 мМ Cu²⁺ [40]. В настоящей работе была проведена сравнительная оценка влияния сульфата и хлорида меди на активность ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1. В обоих случаях катионы Cu²⁺ оказывали ингибирующее действие на фермент, однако, в присутствии сульфата меди циклизующая активность фермента была почти на 10% ниже, чем в случае с хлоридом (данные не представлены). Таким образом, можно предположить, что катионы металлов в сочетании с ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$-анионом оказывают более сильное дестабилизирующее действие на фермент по сравнению с хлоридами тех же металлов. Сходные результаты были получены для ЦГТазы штамма Bacillus sp. G1 при использовании соответствующих солей цинка, двухвалентного железа и калия [14]. Имеются данные, что анионы неорганических кислот также могут играть значительную роль в стабилизации ЦГТазы [14, 46].

Катионы Ni⁺, Pb⁺, Mn²⁺, Na⁺ и K⁺ не оказывали существенного влияния на циклизующую активность ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1 (рис. 7). Активность очищенного фермента достоверно возрастала в присутствии катионов кальция (5 мМ CaCl₂), что является распространенным явлением среди ЦГТаз [26]. Катионы Mg²⁺, при концентрации 5 мМ, также стимулировали активность ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1, в отличие от аналогичных ферментов Bacillus sp. G1 и B. pseudalcaliphilus 20RF, активность которых снижалась в присутствии сернокислого магния на 55 [14] и 45% [40] соответственно. Активация ЦГТазы С. mannanilyticus IB-OR17-B1 катионами кальция и магния наблюдалась при концентрациях последних 5–10 мМ, однако при 15 мМ отмечалось ингибирование фермента солями обоих металлов на 35–37%.

Важнейшей характеристикой ЦГТаз является их специфичность в отношении спектра ЦД, образующихся при ферментативной конверсии крахмала. Определяющее значение для эффективности реакции, катализируемой ЦГТазой С. mannanilyticus IB-OR17-B1, имеет количество фермента в реакционной смеси. С увеличением концентрации фермента в реакционной смеси от 1 до 4 ед./г субстрата общий выход ЦД достигал максимума 42%, однако при дальнейшем увеличении концентрации фермента до 7–15 ед./г продукция ЦД резко снижалась до 26% от содержания субстрата (табл. 2). При избытке фермента в его действии начинала преобладать реакция диспропорционирования с образованием линейных мальтоолигосахаридов, что приводило к резкому снижению выхода ЦД. Эффективность конверсии крахмала в ЦД заметно снижалась также в присутствии низких концентраций ЦГТазы (0.2 ед./г), что обусловлено низкой скоростью ферментативной реакции в условиях полного насыщения фермента субстратом.

Таким образом, для получения удовлетворительного выхода ЦД количество добавляемого фермента необходимо оптимизировать. Полученные данные свидетельствовали, что оптимальной для трансформации крахмала в ЦД можно считать концентрацию ЦГТазы в диапазоне 1–4 ед./г субстрата. Действие исследуемой ЦГТазы на 3%-ный картофельный крахмал при 60°C и концентрации 1 ед./г субстрата приводило к одновременному накоплению α-, β- и γ-ЦД в соотношении 38.8 : 52.6 : 8.6 (мас. %) соответственно и выходу 42%, при этом реакция фактически прекращалась через 10–12 ч. По своим каталитическим свойствам ЦГТаза С. mannanilyticus IB-OR17-B1 была сопоставима с ЦГТазами из Geobacillus stearothermophilus ET1 и G. thermoglucosidans CHB1, которые продуцировали смесь α-, β- и γ-ЦД в соотношении 37.8 : 53.1 : 9.1 (мас. %) [47] и 32 : 56.2 : 11.8 (мас. %) [48] соответственно. При этом для ЦГТазы из G. stearothermophilus ET1 общий выход ЦД составлял 44% после 12 ч обработки клейстеризованного кукурузного крахмала при 60°C и pH 6.0, а для фермента из G. thermoglucosidans CHB1 60.3% после 21 ч обработки 3%-ного растворимого картофельного крахмала при 60°C и pH 6.0.

Таким образом, в представленной работе впервые дана характеристика свойств ЦГТазы, продуцируемой новым термоалкалотолерантным штаммом вида С. mannanilyticus IB-OR17-B1 – представителя рода Caldalkalibacillus, составляющего отдельный кластер алкалофильных эндоспорообразующих бактерий. Для выделения данного фермента в электрофоретически гомогенном состоянии успешно использована простая двухэтапная схема очистки, включающая ультрафильтрацию и адсорбцию на кукурузном крахмале. Молекулярная масса очищенного фермента близка значениям некоторых ранее описанных ЦГТаз и составляла около 70 кДа. Фермент показывал наибольшую активность при рН 8.0 и 60°C, был стабилен в интервале рН 7–10 и температуры 65–70°C. Катионы кальция и магния в концентрациях 5–10 мМ существенно увеличивали термостабильность ЦГТазы при 70°C, а также активировали сам фермент. Сильное ингибирование фермента отмечалось в присутствии ионов серебра (5 мМ), тогда как катионы меди, цинка, двух- и трехвалентного железа характеризовались умеренным или незначительным ингибирующим действием на активность ЦГТазы. Достигаемый уровень ферментативной конверсии картофельного крахмала в ЦД − 42% с преимущественным образованием α- и β-ЦД (38.8 и 52.6 мас. %, соответственно) и незначительным количеством γ-ЦД (8.6 мас. %) после 24 ч инкубации дает основания рассматривать ЦГТазу С. mannanilyticus IB-OR17-B1 в качестве перспективного кандидата для разработки технологии получения ЦД. Несомненно, термостабильность и алкалотолерантность исследованного фермента позволила также внести штамм С. mannanilyticus IB-OR17-B1 в список потенциальных доноров гена ЦГТазы при создании генетически модифицированных продуцентов, либо его использования в качестве одного из базовых продуцентов для дальнейшей селекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России по теме № 220131100163-4 “Межвидовые взаимодействия в микробных сообществах и растительно-микробных ассоциациях естественных и техногенных экосистем (генетические, биохимические и биотехнологические аспекты)”.

При проведении исследований использовали оборудование ЦКП “Агидель” УФИЦ РАН.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.