Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 5, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 5, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 5, стр. 465-471

Сравнение биохимических свойств рекомбинантных химозинов альпака (Vicugna pacos), полученных в про- и эукариотеческой системах экспрессии

С. В. Беленькая 1, 2, В. В. Ельчанинов 3, В. Ю. Чиркова 4, Д. Н. Щербаков 1, 4, *

1 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора
630559 р. п. Кольцово, Россия

2 Новосибирский государственный университет
630090 Новосибирск, Россия

3 Федеральный Алтайский научный центр агробиотехнологий, Сибирский НИИ сыроделия
656910 Барнаул-51, Россия

4 Алтайский государственный университет
656049 Барнаул, Россия

* E-mail: dnshcherbakov@gmail.com

Поступила в редакцию 28.03.2023
После доработки 23.04.2023
Принята к публикации 28.04.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

На основе дрожжей Kluyveromyces lactis разработан штамм-продуцент рекомбинантного прохимозина альпака (Vicugna pacos). Проведен сравнительный анализ биохимических свойств рекомбинантного химозина альпака, полученного в системах экспрессии K. lactis и Escherichia coli. Установлено, что рекомбинантный химозин альпака, синтезированный в K. lactis превосходил аналог, полученный в E. coli, по числу оборотов фермента в 12.9 раза, а по каталитической эффективности – в 2.9 раза. По сравнению с химозином, экспрессированным в E. coli, фермент, полученный в эукариотическом продуценте, имел повышенный на 5°C порог термостабильности. Замена прокариотического продуцента на эукариотический, усиливала падение молокосвертывающей активности фермента в ответ на изменение рН молока от 6.1 до 6.9, что сопровождалось увеличением продолжительности коагуляции на 8–35%. При повышении концентрации CaCl2 в субстрате коагуляционная активность целевого фермента, синтезированного в E. coli была на 12–14% выше, чем у его аналога, полученного в K. lactis.

Ключевые слова: рекомбинантный химозин альпака, прокариотическая система экспрессии, эукариотическая система экспрессии, Kluyveromyces lactis, биохимические свойства, кинетика Михаэлиса-Ментен

Химозин (Хн) (КФ 3.4.23.4) – аспарагиновая протеаза, которая широко применяется в качестве коагулянта молока при производстве различных видов сычужных сыров. Традиционно Хн получали из сычугов молочных телят, но сегодня его основным источником являются генетически модифицированные штаммы микроорганизмов [1]. Актуальность исследования новых видов рекомбинантных Хн (рХн) обусловлена возможностью обнаружения ферментов, превосходящих по комплексу биохимических свойств уже известные генно-инженерные коагулянты молока [2].

Общеизвестно, что у прокариотов, в отличие от эукариотов, почти полностью отсутствуют посттрансляционные модификации (ПТМ) белков. В подавляющем большинстве случаев, одни и те же рекомбинантные белки, полученные в про- и эукариотической системе экспрессии, различаются по физико-химическим и биохимическим характеристикам. Однако однозначного ответа на вопрос о характере влиянии системы экспрессии на биохимические свойства получаемых рекомбинантных белков – не существует. Литературные данные, посвященные изучению этого вопроса, [3–9] свидетельствуют, преимущественно, о том, что a priori прогнозировать влияние системы экспрессии на биохимические свойства целевого рекомбинантного белка крайне затруднительно.

Сравнение свойств субъединицы B термолабильного энтеротоксина (LTB) кишечной палочки, полученного в системах экспрессии Pichia (Komagataella) pastoris и Escherichia coli, показало, что в первом случае, за счет гликозилирования, целевой белок имел бóльшую молекулярную массу, а также повышенную аффинность к ганглиозиду GM1, что усиливало его иммуноадьювантные свойства. Интересно, что уровень экспрессии LTB в системе P. pastoris был примерно в 3 раза выше, чем в гомологичном для этого белка прокариотическом продуценте [3].

В работе [4] представлен сравнительный анализ кинетических параметров рекомбинантной дофамин-сульфотрансферазы человека, синтезированной в системах продукции E. coli, Saccharomyces cerevisiae и в клетках млекопитающих (трансформированные фибробласты обезьяны, линия COS-7 и фибробласты хомячка, линия V79). Показано, что Km сульфотрансфераз, экспрессированных в про- и эукариотических системах были примерно равны и составляли около 1 мкМ. В то же время, отношение Vmax/Km у фермента, полученного в E. coli, было в 31, 138 и 629 раз выше, чем для сульфотрансфераз, синтезированных в S. cerevisiae, V79 и COS-7, соответственно.

Система экспрессии – P. pastoris или E. coli – не оказывала влияния на рН- и температурный оптимумы рекомбинантной фитазы бактерий рода Shigella. Оба фермента проявляли высокую специфичность к фитиновой кислоте и были резистентны к действию трипсина. Однако удельная активность фермента, полученного в эукариотическом продуценте, была в 3.1 раза ниже. По термостабильности при 60 и 70°C фитаза, синтезированная клетками P. pastoris, превосходила фермент, синтезированный в системе экспрессии E. coli, на 33 и 24% соответственно [5].

По данным [6], при экспрессии рекомбинантной монооксигеназы 1B1 кролика система (E. coli или S. cerevisiae) не оказывала достоверного влияния на термостабильность, электрофоретические и каталитические свойства фермента.

Противоречивые данные получены для рекомбинантных белков и ферментов, вовлеченных в систему гемостаза. Генно-инженерные внеклеточные домены тканевого фактора человека, синтезированные в дрожжах (S. cerevisiae), бактериях (E. coli) и клетках млекопитающих (культура CHO), обладали почти идентичными прокоагулянтными свойствами и, согласно спектрам ядерного магнитного резонанса, кругового дихроизма и флуоресценции, демонстрировали высокую структурную гомологию [7]. Фибринолитическая активность рекомбинантной человеческой урокиназы, полученной в бактериях (E. coli) и клеточных культурах млекопитающих (клетки миеломы мыши), была в 5 раз выше, чем у аналога, синтезированного в дрожжах (P. pastoris) [8].

Рекомбинантные сахарозосинтазы 1 картофеля, экспрессированные в S. cerevisiae и E. coli количественно и качественно различались по субстратной специфичности, а также по параметрам кинетики Михаэлиса–Ментен [9]. Сравнение биохимических свойств рекомбинантных химозинов, синтезированных в про- и эукариотических системах экспрессии, не проводилось.

Таким образом, скудные и неоднозначные экспериментальные данные не позволяют обобщить наши представления о влиянии системы экспрессии на свойства целевого рекомбинантного фермента и в каждом конкретном случае требуют экспериментального изучения.

Цель работы – сравнительный анализ биохимических свойств рекомбинантного химозина альпака (рХн-Vic), полученного в системах экспрессии E. coli (рХн-Vic-EС) и K. lactis (рХн-Vic-KL).

МЕТОДИКА

Конструирование экспрессионного вектора. Для получения рекомбинантного прохимозина (рПроХн) альпака в дрожжевой системе был сконструирован оригинальный плазмидный вектор pPOG-Vic (рис. 1), обеспечивающий синтез и секрецию зимогена целевого белка клетками K. lactis. Вектор включал следующие структурные элементы: последовательность промотора глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAP), сигнальную последовательность (Ost2); нуклеотидную последовательность прохимозина альпака (VIC); терминатор транскрипции гена цитохром С-оксидазы S. cerevisiae (CYC); промотор гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter); ген фактора устойчивости к зеоцину (BleoR); ориджин репликации (ori); ген фактора устойчивости к ампициллину (AmpR).

Рис. 1.

Схема конструирования вектора pPOG-Vic.

Фрагменты вектора (рис. 1) были амплифицированы с использованием рассчитанных праймеров (табл. 1), выделены из агарозного геля и очищены при помощи набора Cleanup Standard (“Евроген”, Россия).

Таблица 1.

Олигонуклеотидные праймеры, использованные для амплификации компонентов вектора pPOG-Vic

Название Последовательность (5'–3') Матрица ПЦР-продукт
A-F gaattctaagtatcccgggaagctt pJet 1.2 ori и AmpR
A-R aggtagtatgacctgcagtaagtatcacgtgaagctt
B-F aggtcatactacctcggaagattcc ДНК K. lactis 5'-GAP
B-R ccaaacttgtctcattgtgtaatattctttttttttacttgaaactg
C-F gaatattacacaatgagacaagtttggttctcttggatcg pGH-Ost2 Ost2
C-R ggatccagcctctcttttttcca
D-F agagaggctggatccgcagagataactcgtatacctttatacaagggc pGH-Vic VIC
D-R aaggaaaaggggcctgtcctaggctagatggcctttg
I-F acaggccccttttcctttgtcg pKLAC2 CYC и ADH1 promoter
I-R ggtggcagatctggaattgct
F-F agcaattccagatctgccaccatggccaagttgaccagtg pPICZ BleoR
F-R atcccagtcggtactgactcagtcctgctcctcggc
G-F gtcagtaccgactgggatcttg ДНК K. lactis 3'-GAP
G-R tcccgggatacttagaattccatgtccggtggtgacc

Сборку фрагментов ДНК проводили с использованием Gibson Assembly Master Mix (“NEB”, США). Полученной реакционной смесью трансформировали компетентные клетки E. сoli (штамм NEB Stable). Для проверки корректности сборки, плазмидную ДНК клонов секвенировали по методу Сэнгера. В результате получали вектор pPOG-Vic (рис. 1).

Получение рХн альпака в системе экспрессии K. lactis. Для получения рекомбинантного штамма-продуцента, электрокомпетентные клетки K. lactis (штамм SVB-1) трансформировали вектором pPOG-Vic. Клетки продуцента рПроХн альпака культивировали по ранее описанной методике [10]. Зимоген, накапливающийся в культуральной жидкости, активировали путем ступенчатого изменения рН [11] и получали препарат рХн-Vic-KL.

Получение рХн альпака в системе экспрессии E. coli. Рекомбинантный Хн альпака, экспрессированный в системе E. coli (штамм BL21), получали по методике, описанной в работе [12].

Исследование биохимических свойств. Для сравнения полученных рХн использовали показатели кинетики Михаэлиса–Ментен и биохимические свойства, характеризующие молокосвертывающие протеиназы: молокосвертывающую активность (МА), общую протеолитическую активность (ПА), коагуляционную специфичность (МА/ПА), термостабильность (ТС), зависимость МА от рН и концентрации ионов кальция в молочном субстрате.

Общую и удельную МА, неспецифическую ПА, МА/ПА, ТС и зависимость МА от рН, концентрации ионов кальция определяли по методикам, опубликованным в работах [13, 14]. При определении биохимических свойств в качестве ферментов сравнения использовали коммерческие препараты рХн коровы (рХн-Bos) и рХн верблюда (рХн-Cam), производства компании “Chr. Hansen” (Дания).

Определение параметров кинетики Михаэлиса–Ментен. Предельную скорость реакции (Vmax), константу Михаэлиса (Km), число оборотов фермента(kcat) и каталитическую эффективность (kcat/Km) определяли по методике [14], с использованием флуоресцентно меченого пептидного субстрата, имитирующего Хн-чувствительную область κ-казеина (κ-CN) коровы.

Статистическую обработку данных проводили в вычислительной среде программы Microsoft Excel (“Microsoft Corporation”, США). Результаты определения количественных переменных представлены в виде среднего арифметического (М) с указанием среднеквадратического отклонения (±SD). На графиках не указывали 95%-ный доверительный интервал, поскольку его значения были меньше 10% от значений переменных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кинетика Михаэлиса-Ментен. Система экспрессии существенно влияла на кинетические параметры рХн-Vic (табл. 2). Значения Кm показали, что аффинность рХн-Vic-KL к флуоресцентно меченому пептидному субстрату в 4.4 и 2.2 раза ниже, чем у рХн-Vic-EС и рХн-Bos соответственно. По-видимому, активный центр рХн-Vic-KL быстрее освобождался от продуктов гидролиза субстрата, что отражалось на его kcat и kcat/Km. В результате, рХн-Vic, синтезированный в K. lactis, превосходил аналог, полученный в E. coli, по числу оборотов фермента более чем на порядок (в 12.9 раза), а по каталитической эффективности – в 2.9 раза.

Таблица 2.

Параметры кинетики Михаэлиса-Ментен рекомбинантных химозинов

Препарат Vmax, нМ/с Km, мкМ kcat, с–1 kcat/Km, мкМ–1 с–1
рХн-Vic-KL 938.3 ± 66.0 51.1 ±1.5 150.1 ± 10.6 2.9 ± 0.3
рХн-Vic-EС 145.0 ± 14.5 11.6 ± 0.2 11.6 ± 1.2 1.0 ± 0.1
рХн-Bos 177.3 ± 29.8 22.9 ± 2.8 141.9 ± 23.9 6.2 ± 0.7

Превосходство рХн-Bos над рХн-Vic-EС и рХн-Vic-KL в каталитической эффективности может быть связано с различиями в первичной структуре Хн-чувствительных участков κ-CN коровы и представителей семейства Верблюдовые, к которым относится Vicugna pacos. По сравнению с κ-CN коровы, на участке Е96-N119 κ-CN альпака обнаруживается 9 аминокислотных замен. Одна из них затрагивает Хн-чувствительную связь F105–M106, в которой наблюдается замена M106 → I [2].

Молокосвертывающая активность, специфичность. Поскольку МА является частным случаем общей ПА фермента, направленной на гидролиз связи F105–M106 в молекуле κ-CN, для сравнения специфичности разных рХн используется соотношение МА/ПА. Специфичность новых видов рХн традиционно сравнивается с характеристиками рХн коровы – первого генно-инженерного коагулянта молока для сыроделия [1, 2, 15].

По специфичности рХн-Vic-KL и рХн-Vic-ЕС превосходили рХн коровы, но уступали рХн одногорбого верблюда. При этом, удельная МА рХн-Vic-KL оказалась на 25% выше, чем у рХн-Vic-EС. По сравнению с рХн-Vic, полученным в E. coli, экспрессия целевого фермента в K. lactis приводила к снижению его общей ПА на 24% (табл. 3). В результате, соотношение МА/ПА рХн-Vic-KL становилось в 5 раз выше, чем у рХн-Bos и приближалось к показателю рХн-Cam, специфичность которого по отношению к связи F105-M106 была максимальной среди известных молокосвертывающих аспартатных протеиназ [1, 15].

Таблица 3.

Удельная молокосвертывающая активность, общая протеолитическая активность и специфичность рекомбинантных химозинов

Препарат Удельная МА, УЕ/мг Удельная МА, % Общая ПА, % Специфичность, МА/ПА
рХн-Vic-KL 107500 ± 1182 129 26 5.0
рХн-Vic-EС 85710 ± 771 103 34 3.0
рХн-Bos 83394 ± 1167 100 100 1.0
рХн-Cam 134698 ± 1616 162 24 6.8

Термостабильность. Порогом ТС считали температуру прогревания, при которой снижение остаточной МА фермента составляло ≥20%. Согласно данному критерию, пороги ТС рХн-Vic-EC и рХн-Vic-KL равны 55 и 60°C соответственно (рис. 2). Пороги ТС рХн коровы и верблюда также различались на 5°C, что согласуется с данными других авторов [1].

Рис. 2.

Зависимость остаточной молокосвертывающей активности (МА, %) от температуры прогревания (Т, °C): 1 – рХн-Bos; 2 – рХн-Vic-EC; 3 – рХн-Cam; 4 – рХн-Vic-KL.

Низкую ТС рХн-Vic-EC можно объяснить незавершенным рефолдингом фермента, полученного в прокариотической системе экспрессии, в частности, неполным (или некорректным) замыканием дисульфидных связей. По данным [16] разрушение связи C45–C50 в молекуле рХн коровы, экспрессированного в E. coli, значительно снижает его ТС [16]. Другое возможное объяснение этого феномена – отсутствие ПТМ гетерологичных белков, полученных в E. coli. В частности, это относится к гликозилированию, которое может влиять на терморезистентность Хн. Так, в работе [17] приводятся данные, свидетельствующие о том, что при снижении степени гликозилирования рХн одногорбого верблюда ТС фермента – падает.

Зависимость МА от рН. Говоря о влиянии рН на продолжительность ферментативного свертывания молока, необходимо учитывать два аспекта. Во-первых, концентрация Н+ влияет на баланс электростатических и гидрофобных сил, стабилизирующих мицеллы казеина [18, 19]. При повышении рН молока, суммарные отрицательные заряды казеинов увеличиваются. Как следствие, возрастают силы межмицеллярного электростатического отталкивания и ослабевают казеин-казеиновые гидрофобные взаимодействия, что негативно влияет на скорость сычужного свертывания молока. Во-вторых, изменение рН субстрата отражается на ферментативных свойствах Хн. Оптимумы активности различных вариантов рХн находятся в диапазоне рН 4.5–5.5 [https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.23.4#pH%20OPTIMUM] и удаление от него приводит к снижению их коагуляционной способности.

По мере нарастания рН молока в диапазоне 6.1–6.9 скорость образования сгустка под действием генно-инженерных химозинов-замедляется [1].

Графики, представленные на рис. 3, показали, что наибольшую чувствительность к снижению концентрации Н+ в молочном субстрате демонстрировал рХн коровы, а наименьшую – рХн альпака, полученный в эукариотической системе продукции. При увеличении рН с 6.1 до 6.9 продолжительность коагуляции (ПК) молока, после внесения рХн-Bos, увеличивалась в 5.8 раза. Генно-инженерные Хн представителей семейства Верблюдовых (Camelidae) – одногорбого верблюда и альпака – были менее чувствительны к увеличению рН молока. Повышение рН с 6.1 до 6.9 замедляло свертывание молока, после внесения рХн-Vic-EC, рХн-Vic-KL и рХн-Cam, в 3.3, 3.7 и 4.1 раза соответственно.

Рис. 3.

Зависимость продолжительности коагуляции (ПК) от рН молочного субстрата: 1 – рХн-Bos; 2 – рХн-Cam; 3 – рХн-Vic-KL; 4 – рХн-Vic-EC.

Сравнивая рХн-Vic-EC и рХн-Vic-KL следует отметить постоянно увеличивающиеся различия в коагуляционной способности этих ферментов по мере увеличения рН субстрата. Если при рН 6.3 продолжительность свертывания молока под действием рХн-Vic-KL была всего на 8% больше, чем для рХн-Vic-EC, то при рН 6.9 эта разница составляла уже 35%. Таким образом, замена прокариотической системы экспрессии на эукариотическую усиливала негативную чувствительность коагуляционной активности рХн альпака к нарастанию рН субстрата в диапазоне 6.1–6.9, что приводило к увеличению продолжительности образования молочного сгустка на 8–35%.

Зависимость МА от концентрации ионов кальция. Внесение хлорида кальция в молоко ускоряет его свертывание под действием различных видов натуральных и генно-инженерных химозинов [1]. Стимулирующее действие экзогенного кальция обусловлено его влиянием и на первичную (ферментативную), и на вторичную (агрегационную) фазу сычужного свертывания молока. Повышение концентрации Са2+ в молоке вызывает экранирование отрицательного заряда стабилизирующего “волоскового слоя”, который образуют на поверхности казеиновых мицелл анионные С-терминальные участки κ-CN. Снижение плотности анионных групп на поверхности мицелл облегчает доступ молокосвертывающего фермента к Хн-чувствительной связи κ-CN (F105–M106) и ускоряет удаление “волоскового слоя” в первичной фазе сычужного свертывания. Во вторичной фазе экзогенный кальций усиливает агрегацию дестабилизированных мицелл за счет образования ионных мостиков между фосфорилированными остатками серина альфа- и бэта-казеинов сокращая, тем самым, продолжительность коагуляции молока [20].

Коммерческие рХн различаются по чувствительности к концентрации ионов кальция в молоке. Согласно литературным данным [1, 13, 15], коагуляционная активность рХн одногорбого верблюда в меньшей степени зависит от концентрации хлорида кальция, чем активность рХн коровы.

В данном исследовании при внесении в молоко 1 мM CaCl2 продолжительность образования сгустка под действием рХн-Bos и рХн-Cam сокращалась на 30 и 19% соответственно. Разница в 11–12% между этими ферментами сохранялась на протяжение всего исследуемого диапазона концентраций хлорида кальция (рис. 4).

Рис. 4.

Зависимость продолжительности коагуляции (ПК) от концентрации хлорида кальция (мМ) в молочном субстрате: 1 – рХн-Bos; 2 – рХн-Vic-EC; 3 – рХн-Cam; 4 – рХн-Vic-KL.

Система экспрессии оказывала значительное влияние на чувствительность рХн альпака к изменению концентрации хлорида кальция в диапазоне 1–5 мM. Фермент, синтезированный в прокариотической системе, ведет себя как рХн коровы, а Хн полученный в K. lactis, напротив, в большей степени напоминает рХн-Cam (рис. 4).

Так же, как и в паре “фермент коровы – фермент верблюда”, рХн-Vic-EC свертывал молоко на 12–14% быстрее, чем рХн-Vic-KL, во всем исследованном диапазоне концентраций CaCl2. Предположительно, разная чувствительность химозинов, синтезированных в про- и эукариотах, к изменениям концентрации Ca2+ обусловлена наличием посттрансляционного процессинга целевого фермента в системе экспрессии K. lactis и его отсутствием в E. coli [21].

Таким образом, впервые проведено сравнение биохимических свойств рХн альпака, полученного в системах экспрессии E. coli и K. lactis. Показано, что замена прокариотического продуцента рХн-Vic на эукариотический, на 8–35% усиливала падение МА фермента, в ответ на изменение рН молока от 6.1 до 6.9, приводила к росту его ТС на 5°C, на 12–14% снижала чувствительность МА к изменению концентрации хлорида кальция в диапазоне 1–5 мМ, а также увеличивала коагуляционную специфичность и улучшала показатели каталитической эффективности фермента.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Список литературы

  1. Belenkaya S.V., Balabova D.V., Belov A.N, Koval A.D., Shcherbakov D.N., Elchaninov V.V. // Appl. Biochem. Microbiol. 2020. V. 56. № 4. P. 363–372.

  2. Ельчанинов В.В. Проблема поиска новых молокосвертывающих ферментов для сыроделия: критерии выбора источников генов для получения рекомбинантных химозинов. Барнаул: Изд. Алтайского гос. ун-та, 2021. 170 с.

  3. Ma X., Yao B., Zheng W., Li L. // J. Microbiol. Biotechnol. 2020. V. 20. № 3. P. 550–557.

  4. Dajani R., Sharp S., Graham S., Bethell S.S., Cooke R.M., Jamieson D.J., Coughtrie M.W. // Protein Expr. Purif. 1999. V. 16. №1. P. 11–18.

  5. Pal Roy M., Mazumdar D., Dutta S., Saha S.P., Ghosh S. // PloS one. 2016. V. 11. № 1. P. e0145745.

  6. Lawton M.P., Philpot R.M. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 8. P. 5728–5734.

  7. Stone M.J., Ruf W., Miles D.J., Edgington T.S., Wright P.E. // Biochem. J. 1995. V. 310. № 2. P. 605–614.

  8. Wang P., Zhang J., Sun Z., Chen Y., Gurewich V., Liu J.N. // Thromb. Res. 2000. V. 100. № 5. P. 461–467.

  9. Sauerzapfe B., Engels L., Elling L. // Enzyme Microb. Technol. 2008. V. 43. № 3. P. 289–296.

  10. Belenkaya S.V., Elchaninov V.V., Shcherbakov D.N. // Biotekhnologiya. 2021. V. 37. № 5. P. 20–27.

  11. Рудометов А.П., Беленькая С.В., Щербаков Д.Н., Балабова Д.В., Кригер А.В., Ельчанинов В.В. // Сыроделие и маслоделие. 2017. Т. 6. С. 40–43.

  12. Belenkaya S.V., Rudometov A.P., Shcherbakov D.N., Balabova D.V., Kriger A.V., Belov A.N., Koval A.D., Elchaninov V.V. // Appl. Biochem. Microbiol. 2018. V. 54. № 6. P. 569–576.

  13. Belenkaya S.V., Shcherbakov D.N., Balabova D.V., Belov A.N., Koval A.D., Elchaninov V.V. // Appl. Biochem. Microbiol. 2020. V. 56. № 6. P. 647–656.

  14. Belenkaya S.V., Bondar A.A., Kurgina T.A., Elchaninov V.V., Bakulina A.Yu., Rukhlova E.A., Lavrik O.I., Ilyichev A.A., Shcherbakov D.N. // Biochemistry (Moscow). 2020. V. 85. № 7. P. 781–791.

  15. Kappeler S.R., van den Brink H.(J.)M., Rahbek-Nielsen H., Farah Z., Puhan Z., Hansen E.B., Johansen E. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2006. V. 342. № 2. P. 647–654.

  16. Zhang Y., Li H., Wu H., Don Y., Liu N., Yang K. // Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1997. V. 1343. № 2. P. 278–286.

  17. Jensen J.L., Molgaard A., Poulsen J.-C.N., Harboe M.K., Simonsen J.B., Lorentzen A.M., Hjerno K., van den Brink J.M., Qvist K.B., Larsen S. // Acta Cryst. (Section D, Biol. Crystallogr.). 2013. V. 69. № 5. P. 901–913.

  18. Horne D.S. // Curr. Opin. Coll. Interface Sci. 2002. V. 7. P. 456–461.

  19. Horne D.S. // Int. Dairy J. 1998. V. 8. P. 171–177.

  20. Lucey J.A. // J. Dairy Sci. 2002. V. 85. № 2. P. 281–294.

  21. Spohner S.C., Schaum V., Quitmann H., Czermak P. // J. Biotechnol. 2016. V. 222. P. 104–116.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал