Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 6, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 6, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 6, стр. 589-598

Характеристика штаммов группы Bacillus cereus complex, выделенных из вечной мерзлоты в якутии, для оценки микробиологических рисков при изменении климата

Ю. О. Гончарова 1, *, В. В. Евсеева 1, Р. И. Миронова 1, К. В. Хлопова 1, А. Г. Богун 1, А. А. Сизова 1, В. И. Соломенцев 1, Г. М. Титарева 1, И. В. Бахтеева 1, Т. Б. Кравченко 1, А. В. Брушков 2, 3, В. С. Тимофеев 1, С. Г. Игнатов 1, 2, **

1 Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
142279 р.п. Оболенск, Серпухов, Московская область, Россия

2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
119991 Москва, Россия

3 Тюменский государственный университет
625003 Тюмень, Россия

* E-mail: iulia.belay@yandex.ru
** E-mail: ignatov@obolensk.org

Поступила в редакцию 20.06.2023
После доработки 30.06.2023
Принята к публикации 06.07.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Из проб почвы в регионе вечной мерзлоты (Якутия, Россия) выделены штаммы рода Bacillus и дана их фенотипическая характеристика. Анализ полученных данных позволил отнести их к группе Bacillus cereus complex. ПЦР-анализ позволил определить профиль генов синтеза токсинов В. cereus в геномах исследуемых штаммов. Получена генетическая характеристика путем RAPD-генотипирования и с использованием MLVA-локусов, применяемых для генотипирования возбудителя сибирской язвы. Результаты генотипирования разного уровня разрешения позволили дифференцировать исследуемые штаммы от вида B. anthracis, показать их внутривидовые генетические различия и степень родства. Осуществлено полногеномное секвенирование, на основе данных которого проведено MLST-генотипирование, которое выявило 2 известных сиквенс-типа и один новый, впервые описанный в настоящей работе. Полученные результаты имеют прикладное значение и крайне интересны с точки зрения эволюции и филогеографии группы В. cereus complex, поскольку факт выделения штаммов из вечной мерзлоты дает основания предположить, что их возраст может быть гораздо выше предполагаемого.

Ключевые слова: Bacillus cereus complex, Bacillus anthracis, токсины, генотипирование, MLVA, MLST, RAPD, вечная мерзлота

Сценарии изменения климата прогнозируют повышение среднегодовой температуры воздуха во всем мире. Такие климатические изменения могут иметь важные последствия: возникновение микробиологических рисков, связанных с высвобождением патогенов из вечной мерзлоты. Особенно резкие климатические изменения наблюдаются в Арктическом регионе России, на который приходится более половины всей арктической территории и населения [1]. Для прогнозирования биологических рисков, связанных с потеплением, необходимо выделение и характеристика потенциальных патогенов из мерзлотных в настоящее время областей. Спорообразующие бактерии группы Bacillus cereus complex представляют собой интересную модель для изучения воздействия изменения климата на патогены [2].

Группа Bacillus cereus complex образована 9 близкородственными видами, для которых характерна высокая степень генетического сходства, что создает проблему определения вида при исследовании выявленных штаммов рода Bacillus [3]. Эта проблема усугубляется наличием в группе опасных патогенов, таких как В. cereus, который вызывает пищевые токсикоинфекции человека [4], и В. anthracis, который относится ко II группе патогенности и является возбудителем сибирской язвы – карантинной инфекции травоядных животных и человека [5]. При выделении нового штамма рода Bacillus из того или иного источника, актуально в максимально сжатые сроки определить его вид, а также получить фенотипическую характеристику и оценить патогенный потенциал.

Основными широко используемыми приемами, которыми осуществляют фенотипическую характеристику штаммов бацилл являются: определение подвижности, лецитиназной, фосфатазной и гемолитической активностей, а также чувствительности к диагностическим бактериофагам. Эти подходы также позволяют определить вид исследуемого штамма и дифференцировать его от вида B. anthracis [6].

Для более полноценной и точной характеристики применяют методы типирования, такие как хромосомный рестрикционный анализ ДНК, плазмидное типирование, риботипирование и импульсно-полевой гель-электрофорез (PFGE – pulsed-field gel electrophoresis) [7]. Используются также методы генотипирования, основанные на ПЦР, например, случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD – randomly amplified polymorphic DNA), которая позволяет дифференцировать анализируемые штаммы на основе сравнения размера и числа продуктов амплификации с использованием нескольких ПЦР-праймеров [8, 9]. Широко используется метод полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP – amplified fragment length polymorphism) [10, 11] и мультилокусный электрофорез ферментов (MEE – multilocus enzyme electrophoresis) [12]. Мультилокусное сиквенс-типирование (MLST – Multilocus Sequence Typing), основанное на анализе нуклеотидных последовательностей нескольких локусов генов домашнего хозяйства, позволяет отнести штамм к тому или иному сиквенс-типу (ST), который характерен для одного из видов группы В. cereus complex [13, 14]. Для возбудителя сибирской язвы разработан подход мультилокусного анализа вариабельных нуклеотидных тандемных повторов (MLVA – multiple locus VNTR analysis), который рекомендуется использовать в качестве генетического анализа первой линии [15, 16]. Эти методы позволяют не только определить видовую принадлежность штамма, но и дифференцировать штаммы одного вида между собой с разной степенью разрешения.

Безусловно, при отнесении штамма к виду В. cereus, важно охарактеризовать его возможные патогенные свойства. Одними из факторов патогенности В. cereus являются токсины. Термостабильный токсин цереулид опосредует рвотный синдром при пищевом отравлении, вызванном В. cereus. Синтез данного токсина осуществляет белковый комплекс, компоненты которого кодируют несколько генов [17, 18]. Диарейный синдром вызывают энтеротоксины, такие как: негемолитический энтеротоксин (Nhe), гемолизин BL (Hbl), цитотоксин К (CytK) и энтеротоксин FM (EntFM) [19]. Эти токсины выявляются с помощью иммуноферментного анализа, ПЦР [17, 20–22] и масс-спектрометрии MALDI-TOF [23]. Путем ПЦР-амплификации в геномах анализируемых штаммов можно обнаружить гены перечисленных токсинов и выдвинуть предположение об их патогенности [21].

В Якутии (Россия) из проб почвы, находящейся в вечной мерзлоте, отобранных на месте находки мумий пещерных львят, были выделены и всесторонне изучены 3 штамма возбудителя сибирской язвы, описанных нами ранее [16]. Помимо них, из тех же самых проб были выделены другие 26 штаммов рода Bacillus, 10 из которых отнесены к группе В. сereus complex и исследованы в настоящей работе.

Цель работы – получение фенотипической и генетической характеристики 10 выделенных из вечной мерзлоты штаммов группы В. сereus complex для оценки микробиологических рисков, поскольку виды этой группы генетически близки к виду В. anthracis.

МЕТОДИКА

Штаммы микроорганизмов. В работе исследованы 10 штаммов группы В. cereus complex: YakM1, YakM2, YakM3, YakM4, YakМ7, YakМ8, YakM9, YakM10, YakM11-2 и YakМ15. Все штаммы были выделены в 2016 г. из образцов почвы, находящейся в вечной мерзлоте.

Определение культуральных и морфологических характеристик. Культуры штаммов рассевали до получения единичных колоний и выращивали на плотной питательной среде ГРМ-агар (панкреатический гидролизат рыбной муки, ГНЦ ПМБ, Россия) при температуре 37°C в течение 18–24 ч. Морфологию колоний оценивали по микроскопии с использованием микроскопа “AxioStar” (“K. Zeiss”, Германия, окуляр – 10×, объектив – 40×).

Подвижность, фосфатазную и лецитиназную активности, а также чувствительность к бактериофагам определяли согласно Маринину [6].

Подвижность микробных клеток определяли методом микроскопического исследования в раздавленной капле.

Фосфатазную активность выявляли при выращивании культур на плотной питательной среде агар Хоттингера (ГНЦ ПМБ, Россия) с добавлением 0.001% фенолфталеинфосфата натрия в течение 24 ч. при 36°С. После этого в крышку чашки Петри помещали фильтровальную бумагу и наливали 1–2 мл 23%-ного водного раствора аммиака. Под действием паров аммиака колонии, продуцирующие щелочную фосфатазу, окрашивались в розовый цвет.

Лецитиназную активность определяли путем выращивания культур на плотной яично-желточной среде, которую готовили путем добавления желтка куриного яйца в агар Хоттингера. Учет проводили через 12, 24 и 48 ч. культивирования при 36°С по ореолу преципитации.

Гемолитическую активность проверяли, выращивая культуры штаммов на агаризованной среде, содержащей 5% дефибринированной крови. Высевы выдерживали 18–20 ч при 36°С, после чего учитывали результаты.

Определение чувствительности микробной культуры к бактериофагам осуществляли следующим образом: на агаризованную среду высевали по 0.2 мл 18-часовой бульонной культуры, в центр подсохшего газона наносили препарат бактериофага, содержащий 1 × 106 БОЕ/см3, результаты учитывали через 18–24 ч.

Выделение нуклеиновых кислот. Выделение ДНК исследуемых штаммов осуществляли с помощью набора “Genomic DNA Purification Kit” (“Thermo Fisher Scientific”, США). Обеззараживание материала осуществляли в соответствии с МУ 1.3.2569-2009.

Полногеномное секвенирование. Библиотеки были подготовлены с помощью набора “Nextera DNA Library Preparation Kit” (“Illumina”, США). Полногеномное секвенирование осуществляли с использованием прибора “MiSeq” (“Illumina”, США) и соответствующего набора реагентов “Miseq Reagent Kit v3” (“Illumina”, США).

RAPD-генотипирование и ПЦР-индикация наличия в геноме штамма группы В. cereus генов энтеротоксинов. RAPD-генотипирование осуществляли, как описано в работе Инатсу с соавт. [24], с использованием праймеров, представленных в работе Кувана с соавт. [25] (табл. 1).

Таблица 1.

Праймеры для проведения RAPD-генотипирования

Праймер Последовательность 5' → 3'
Primer A ATCAGCGCACCA
Primer B GCCAGCTGTACG
Primer C TGCCTCGCACCA
Primer D GCCCCGTTAGCA
Primer E CCGCAGTTAGAT
Primer F ACTGGCCGAGGG
Primer G TTCGGACGAATA
Primer H AGAATTGGACGA

Наличие в геномах штаммов генов синтеза токсинов (cytK, hblC, entFM, nheA, ces, CER) определяли методом ПЦР-детекции с использованием праймеров, предложенных в работе Ким с соавт. [21] (табл. 2).

Таблица 2.

Праймеры для ПЦР-индикации наличия в геноме штамма группы В. cereus complex генов энтеротоксинов

Энтеротоксин В. cereus Ген-мишень Последовательность 5'→3' Размер ПЦР-продукта, п.о.
Цитотоксин К cytK TGCTAGTAGTGCTGTAACTC 881
CGTTGTTTCCAACCCAGT
Негемолитический энтеротоксин А nheA GGAGGGGCAAACAGAAGTGAA 750
CGAAGAGCTGCTTCTCTCGT
Гемолизин BL hblC CGCAACGACAAATCAATGAA 421
ATTGCTTCACGAGCTGCTTT
Цереулид ces TTCCGCTCTCAATAAATGGG 634
TCACAGCACATTCCAAATGC
CER GCGTACCAAATCACCCGTTC 546
TGCAGGTGGCACACTTGTTA
Энтеротоксин FM entFM AGGCCCAGCTACATACAACG 327
CCACTGCAGTCAAAACCAGC

Реакции амплификации проводили с использованием термоциклера “T100 thermal cycler” (“Bio-Rad”, США) и набора реагентов и “5X реакционная смесь qPCRmix-HS” (“Евроген”, Россия) согласно инструкциям производителей. В качестве источника матрицы добавляли раствор ДНК исследуемых штаммов (5–20 нг ДНК на реакцию). Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1.0–1.2%-ном агарозном геле (“Sigma-Aldrich”, США) в 1 × Трис-ацетатном электродном буфере (ТАЕ). Размер фрагмента определяли по маркеру молекулярных масс “GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder” (“Thermo Fisher Scientific”, США).

MLVA-генотипирование. MLVA-генотипирование осуществляли согласно протоколу, описанному в работе [26], по 17 MLVA-маркерам [15, 26–29]: vrrA, bams03, bams05, bams22, bams34, bams44, VNTR23, vrrC2, bams01, bams21, bams23, bams24, bams25, bams28, bams51, vrrB1, vrrB2, используемым для MLVA-генотипирования B. anthracis. Генотипирование штамма включало 17 ПЦР-реакций. Праймеры представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Праймеры для MLVA-генотипирования

Локус Наименование праймера Последовательность 5'→3'
vrrA vrrA-F CACAACTACCACCGATGGCACA
vrrA-R GCGCGTTTCGTTTGATTCATAC
vrrB1 vrrB1-F ATAGGTGGTTTTCCGCAAGTTATTC
vrrB1-R GATGAGTTTGATAAAGAATAGCCTGTG
vrrB2 vrrB2-F CACAGGCTATTCTTTATCAAACTCATC
vrrB2-R CCCAAGGTGAAGATTGTTGTTGA
vrrC2 vrrC2-F CCAGAAGAAGTGGAACCTGTAGCAC
vrrC2-R GTCTTTCCATTAATCGCGCTCTATC
bams01 bams01-F GTTGAGCATGAGAGGTACCTTGTCCTTTTT
bams01-R AGTTCAAGCGCCAGAAGGTTATGAGTTATC
bams03 bams03-F GCAGCAACAGAAAACTTCTCTCCAATAACA
bams03-R TCCTCCCTGAGAACTGCTATCACCTTTAAC
bams05 bams05-F GCAGGAAGAACAAAAGAAACTAGAAGAGCA
bams05-R ATTATTAGCAGGGGCCTCTCCTGCATTACC
bams21 bams21-F TGTAGTGCCAGATTTGTCTTCTGTA
bams21-R CAAATTTTGAGATGGGAGTTTTACT
bams22 bams22-F ATCAAAAATTCTTGGCAGACTGA
bams22-R ACCGTTAATTCACGTTTAGCAGA
bams23 bams23-F CGGTCTGTCTCTATTATTCAGTGGT
bams23-R CCTGTTGCTCCTAGTGATTTCTTAC
bams24 bams24-F CTTCTACTTCCGTACTTGAAATTGG
bams24-R CGTCACGTACCATTTAATGTTGTTA
bams25 bams25-F CCGAATACGTAAGAAATAAATCCAC
bams25-R TGAAAGATCTTGAAAAACAAGCATT
bams28 bams28-F CTCTGTTGTAACAAAATTTCCGTCT
bams28-R TATTAAACCAGGCGTTACTTACAGC
bams34 bams34-F CAGCAAAATCAATCGAATCAAA
bams34-R TGTGCTAAATCATCTTGCTTGG
bams44 bams44-F GCGAATTAATTGCTCCTCAAAT
bams44-R GCACTTGAATATTTGGCGGTAT
bams51 bams51-F ATTTCCTGAGCAGGTTGTGTT
bams51-R TGCATCTAACAATGCAGAACAA
VNTR23 VNTR23-F TTTAGAAACGTTATCACGCTTA
VNTR23-R GTAATACGTATGGTTCATTCCC

Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 2–3%-ном агарозном геле и 0.5× Трис-боратном электродном буфере (ТВЕ). Размер фрагмента определяли по маркерам молекулярных масс “GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder” (“Thermo Fisher Scientific”, США) и “EZ Load 20 bp Molecular Ruler” (“Bio-Rad”, США) с использованием программы “PhotoCamptMw 99.04” (“VilberLourmat”, Франция). В качестве референсного штамма для сравнения длин фрагментов использовали B. anthracis Pasteur II (“ГКПМ-Оболенск”, Россия). Полученные размеры ампликонов переводили в количество тандемных повторов для данного локуса, как описано в работе [29]. В результате получали MLVA-профили штаммов.

MLST-генотипирование. Для MLST-генотипирования использовали схему, описанную в работе Прист с соавт. в 2004 г. [14]. Для исследуемой выборки получены сборки и определены нуклеотидные последовательности следующих локусов: glpF, gmk, ilvD, pta, pur, pycA, tpi. Полученным последовательностям присваивали номера аллелей, а на основе комбинации номеров аллелей определяли ST штаммов в соответствии с сервисом базы данных PubMLST (https://pubmlst.org/bcereus/).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Культуральная и морфологическая характеристика штаммов. На первом этапе у исследуемых штаммов был определен ряд диагностически важных фенотипических признаков: морфология колоний, подвижность, лецитиназная, фосфатазная и гемолитическая активности, чувствительность к диагностическим сибиреязвенным бактериофагам Гамма А-26 и В-Fah (ВНИИВВиМ). Результаты представлены в табл. 4. Каждый штамм имел мономорфные колонии, однако между собой штаммы морфологически различались. Полученные результаты в совокупности позволили отнести все исследуемые штаммы к группе B. cereus complex и дифференцировать их от вида B. anthracis. Однако, интересно отметить, что штамм YakM4 не обладал гемолитической активностью, характерной для данного вида, а штаммы YakM7, YakM10 и YakM15 оказались чувствительны к сибиреязвенному бактериофагу Гамма А-26. Это позволило сделать предположение о тесной связи перечисленных штаммов с B. anthracis, поскольку ранее уже были описаны подобные случаи негемолитичных и чувствительных к гамма-фагу штаммов B. cereus, близкородственных возбудителю сибирской язвы [30, 31].

Таблица 4.

Фенотипическая характеристика штаммов

Штамм Подвижность Лейцитиназная
активность 		Фосфатазная
активность 		Гемолитическая активность Гамма А-26 В-Fah
YakM1 +* + + + – –
YakM2 + + + + – –
YakM3 + + + + – –
YakM4 + + + – – –
YakМ7 + + + + + –
YakМ8 + + + + – –
YakM9 + + + + – –
YakM10 + + + + + –
YakM11-2 + + + + – –
YakМ15 + + + + + –

Примечание: *+ – признак выражен; – признак не выражен.

Определение профиля энтеротоксинов. Штаммы В. cereus способны вызывать серьезные пищевые токсикоинфекции, поэтому одним из важных аспектов при исследовании вновь выделенного штамма является определение профиля энтеротоксинов, как основных факторов патогенности данного вида микроорганизмов. Одним из способов решения этой задачи является ПЦР-индикация генов, кодирующих соответствующие токсины в геноме штамма [17, 21]. Нами были использованы праймеры, предложенные в работе [21] для ПЦР-индикации 6 генов синтеза токсинов – цитотоксина К (cytK), негемолитического энтеротоксина А (nheA), гемолизина BL (hblC), энтеротоксина FM (entFM) и рвотного токсина цереулида (ces и CER). Перечисленные токсины синтезируются штаммами В. cereus, вызывающими пищевые токсикоинфекции с диарейной или рвотной симптоматикой [20]. Полученные результаты приведены в табл. 5.

Таблица 5.

Профиль генов синтеза токсинов штаммов группы В. cereus complex

Штамм Детектируемый ген
cytK hblC entFM nheA ces CER
YakM1 – + – + – –
YakM2 – + – + – –
YakM3 – – + + – –
YakM4 – + – + – –
YakМ7 – – + + – –
YakМ8 – – + + – –
YakM9 – – + + – –
YakM10 – – + + – –
YakM11-2 – – + + – –
YakМ15 – – + + – –

Как видно из табл. 5, только штаммы YakM1, YakM2 и YakM4 несут в геноме ген hblC и лишены гена entFM, ген nheA выявлен у всех штаммов исследуемой выборки и ни у одного из штаммов не выявлено положительной реакции на гены cytK, CER и ces. Однако, согласно результатам полногеномного секвенирования, ген cytK обнаружен у YakM9 и YakM11-2, ген hblC выявлен в геномах YakM1, YakM2, YakM3, YakM7, YakM10 и YakM15, entFM обнаружен у YakM1 и YakM15, nheA выявлен у всех штаммов, за исключением YakM4. Расхождение результатов ПЦР и секвенирования может быть обусловлено отсутствием референсного штамма и, соответственно, генома, для вида B. cereus и группы B. cereus complex, а также выраженным полиморфизмом перечисленных генов.

Эти результаты интересны с учетом факта выделения штаммов из вечной мерзлоты. Поскольку функция токсинов, как факторов патогенности, заключается в поражении желудочно-кишечного тракта хозяина, интересно предположить, в отношении каких видов-хозяев данные токсины могли использоваться при условии экспрессии генов, наличие которых выявлено в геномах.

Помимо фенотипических характеристик, которые, в свою очередь, определили спектр следующих подходов, примененных для изучения данных штаммов, возникла необходимость также охарактеризовать штаммы с генетической точки зрения.

RAPD-генотипирование. RAPD-генотипирование является одним из наиболее простых методов генотипирования штаммов рода Bacillus [8, 9, 24, 32], позволяет получить генетическую характеристику штамма за несколько часов и не требует использования данных секвенирования, что крайне важно с финансовой точки зрения, поэтому оно было проведено в первую очередь. Этот подход позволил определить, являются ли штаммы, имеющие одинаковую фенотипическую характеристику, идентичными на уровне генома.

RAPD-генотипирование показало, что все исследуемые изоляты имеют различия. Однако наиболее схожий RAPD-профиль выявлен у штаммов: YakМ8, YakМ9 и YakМ11-2, а также YakМ10 и YakМ15. Примеры результатов RAPD-генотипирования представлены на рис. 1 и 2.

Рис. 1.

RAPD-генотипирование с использованием праймера Primer A: 1, 12 – маркер молекулярных масс “GeneRuler 100 bp DNA Ladder”; продукты амплификации штаммов: 2 – YakМ1, 3 – YakМ2, 4 – YakМ3, 5 – YakМ4, 6 – YakМ7, 7 – YakМ8, 8 – YakМ9, 9 – YakМ10, 10 – YakМ11-2, 11 – YakМ15.

Рис. 2.

RAPD-генотипирование с использованием праймера Primer B: 1, 12 – маркер молекулярных масс “GeneRuler 100 bp DNA Ladder”; продукты амплификации штаммов: 2 – YakМ1, 3 – YakМ2, 4 – YakМ3, 5 – YakМ4, 6 – YakМ7, 7 – YakМ8, 8 – YakМ9, 9 – YakМ10, 10 – YakМ11-2, 11 – YakМ15.

Эти результаты позволили сделать предварительный вывод о том, что штаммы, взятые из одной географической точки, имеют генетические различия, что вызывало интерес к проведению более глубоких генетических исследований.

Применение MLVA-локусов B. anthracis в отношении других видов группы B. cereus complex. Поскольку B. anthracis и другие виды группы В. сereus complex являются крайне близкородственными на генетическом уровне, было выдвинуто предположение о возможности применения хромосомных VNTR-локусов B. anthracis для MLVA-генотипирования и дифференцирования других штаммов данной группы. В ряде работ была показана возможность не только применения этого высокоразрешающего метода для генетической характеристики штаммов B. anthracis, но и возможность его использования для дифференцирования B. anthracis от других видов рода Bacillus, поскольку по ряду VNTR-локусов возможна амплификация продуктов, размер которых значительно отличается от типичных для B. anthracis [15, 31, 33]. Мы предположили, что в случае успешного использования данного подхода, возможно выявление наиболее близких с филогенетической точки зрения штаммов к виду B. anthracis, как, например B. cereus bv. anthracis, который известен способностью вызывать схожее с сибирской язвой заболевание у приматов [34]. Поэтому, мы применили предложенные рядом авторов праймеры для MLVA-генотипирования B. anthracis [15, 26–29] при генотипировании исследуемых в данной работе штаммов. Результаты приведены в табл. 6.

Таблица 6.

MLVA-профили штаммов

Штамм VNTR-локус
vrrA bams03 bams05 bams44 VNTR23 bams21 bams24 bams25 bams28 bams51 vrrB1 vrrB2
YakM1 5 НЛ НЛ 7 10 НЛ 10 14 16 7 НЛ 13
YakM2 5 НЛ НЛ 7 10 НЛ 10 14 16 7 НЛ 13
YakM3 8 НЛ 6 4 2 9 7 11 15 7 26 15
YakM4 5 НЛ НЛ 7 10 НЛ 10 14 16 7 НЛ 13
YakМ7 8 НЛ 6 4 2 9 7 11 15 НЛ 26 НЛ
YakМ8 7 33 6 8 2 НЛ 10.5 НЛ 16 9 23 13
YakM9 7 33 6 8 2 НЛ 10.5 НЛ 16 9 23 13
YakM10 8 НЛ 6 4 2 9 7 11 15 НЛ 26 НЛ
YakM11-2 7 33 6 8 2 НЛ 10.5 НЛ 16 9 23 13
YakМ15 8 –* 6 4 2 9 7 11 14 НЛ 26 3

Примечание: цифрами обозначено число нуклеотидных повторов в VNTR-локусах; * – размер фрагмента слишком большой для определения по результатам электрофореза в агарозном геле; НЛ – нет локуса (локус не амплифицируется).

Таким образом, осуществлен MLVA-анализ исследуемой выборки с использованием 17 VNTR-локусов. Обнаружено, что несмотря на то, что используемые праймеры сконструированы для B. anthracis, по ряду локусов у исследуемых изолятов проходила амплификация. Однако часть локусов (bams01, bams22, bams23, bams34, vrrC2) оказалась неприменима из-за отсутствия продукта амплификации или его неспецифичного накопления, при котором размер составил более 900 п.н., в связи с чем невозможно определить его точный размер по результатам электрофореза в агарозном геле. Тем не менее, одинаковый MLVA-профиль выявлен у штаммов YakM1, YakM2 и YakM4, YakM8, YakM9 и YakM11-2, а также YakМ7 и YakM10. Близкий, хоть и не одинаковый, MLVA-профиль характерен для штаммов YakM3, YakM15 и YakМ7, YakM10. Данные результаты частично согласуются с результатами RAPD-генотипирования, однако MLVA может иметь более низкое разрешение и основано на полиморфизме других локусов. Это говорит в пользу необходимости комплексного подхода генотипирования при исследовании таких мономорфных групп как B. cereus complex. Однако, поскольку данный метод является одним из наиболее высокоразрешающих способов генотипирования B. anthracis, вероятно, одинаковый MLVA-профиль исследуемых нами штаммов говорит о их крайне близком родстве, либо о том, что они, по сути, являются одним штаммом. Ранее была показана возможность использования сибиреязвенных MLVA-локусов для дифференцирования B. anthracis от B. cereus и B. thuringiensis, а также поиска наиболее тесно связанных с B. anthracis других штаммов рода Bacillus [31, 33]. В настоящей работе показана возможность дифференцирования путем MLVA штаммов B. anthracis и группы В. сereus complex и выявлены различия по ряду локусов между исследуемыми штаммами.

MLST-генотипирование. MLST является одним из самых надежных способов генотипирования для группы В. cereus complex и особенно успешно позволяет определить вид исследуемого изолята. Мы использовали одну из наиболее популярных схем MLST в отношении исследуемых штаммов [14]. По результатам полногеномного секвенирования были определены номера аллелей и ST в соответствии с базой данных (https://pubmlst.org/bcereus/). Результаты представлены в табл. 7.

Таблица 7.

MLST-генотипирование штаммов группы В. cereus complex

Штамм Аллельный профиль MLST-ST
glpF gmk ilvD pta pur pycA tpi
YakM1 8 10 79 36 56 22 11   –*
YakM2 8 10 79 36 56 22 11 –
YakM3 86 57 81 80 80 90 32 217
YakM4 8 10 79 36 56 22 11 –
YakМ7 86 57 81 80 80 90 32 217
YakМ8 5 4 3 4 15 6 16 32
YakM9 5 4 3 4 15 6 16 32
YakM10 86 57 81 80 80 90 32 217
YakM11-2 5 4 3 4 15 6 16 32
YakМ15 86 57 81 80 80 90 32 217

Примечание: цифрами обозначены номера аллелей по каждому из локусов и номера сиквенс-типов, согласно сервису PubMLST; *выявлен впервые описанный сиквенс-тип.

Среди исследуемой выборки к ST-217 принадлежали 4 штамма, а к ST-32 – 3 штамма. В базе данных PubMLST, в которой на момент написания работы содержалась информация о 5521 штаммах группы В. сereus complex, к ST-217 относится один штамм – KW14 (место и дата выделения неизвестны), а к ST-32 отнесены 27 штаммов (выделены из пищевых продуктов в США, Канаде, Южной Корее, Китае и Тайване). Как видно из табл. 7, у штаммов YakM1, YakM2 и YakM4 выявлена комбинация аллелей, которая не соответствует ни одному из ранее описанных сиквенс-типов. Однако, согласно PubMLST, данный ST входит в состав 196 клонального комплекса, куда входят 58 других ST. Таким образом, в данной работе мы выявили новый ранее не описанный MLST-ST у штаммов группы В. сereus complex, найденных в почве вечной мерзлоты.

Выявление как редких, так и ранее не описанного ST представляет интерес с точки зрения эволюции группы В. сereus complex. В географической точке на месте находки мумий пещерных львят, был выделен ряд штаммов B. anthracis, причем 3 из них принадлежали разным эволюционным линиям – А и В [16, 35]. Позднее из тех же образцов почвы были выделены и штаммы, исследуемые в настоящей работе. Интересно, что эти 10 штаммов относятся к трем известным и одному новому ST, а штаммы B. anthracis отнесены к ST-1 и ST-3. То есть большинство штаммов рода Bacillus относятся к разным эволюционным ветвям и в данной географической точке наблюдается значительный полиморфизм как среди B. anthracis, так и среди группы В. сereus complex в целом. Кроме того, важно отметить, что локусы, используемые для MLST-генотипирования, представляют собой гены домашнего хозяйства, которые обладают сравнительно медленной эволюцией, что является еще одним аргументом в пользу высокого биоразнообразия штаммов, принадлежащих к близкородственным видам и выделенных буквально в одной точке [14]. Необходимо обратить внимание на то, что все штаммы выделены в Якутии из образцов почвы, находящейся в аллювиальных отложениях Голоцена [16]. Несмотря на то, что ранее время консервации штаммов B. anthracis в мерзлоте определено, как относящееся к XIII-XVI векам, факт выделения их из вечной мерзлоты дает основания предположить, что их возраст может быть гораздо больше предполагаемого, вплоть до нескольких тысячелетий, в то время как вид B. anthracis появился приблизительно 12–26 тыс. лет назад [36]. Это свидетельствует о важности данного региона Якутии в происхождении и эволюции самого вида B. anthracis. Поэтому данная гипотеза требует дальнейшей разработки, а новые штаммы – более глубокого изучения.

Таким образом, в настоящей работе проведено исследование 10 штаммов В. сereus complex, выделенных из образцов почвы, находящейся в вечной мерзлоте на территории Якутии. Проведено фенотипическое исследование штаммов культуральными и биохимическими методами. Методом ПЦР определен профиль наличия в их геноме генов, кодирующих энтеротоксины. Затем проведено MLVA-генотипирование с использованием локусов, применяемых для генотипирования штаммов возбудителя сибирской язвы, что позволило дифференцировать штаммы В. сereus complex от B. anthracis и выявить их различия и сходства по ряду локусов. На основе результатов проведенного секвенирования геномов осуществлено MLST-генотипирование, в результате которого выявлено 2 ранее описанных, но достаточно редких ST и один не описанный и не зарегистрированный в базе данных PubMLST ST, что очень важно в целом для фундаментальных и филогенетических исследований группы В. cereus complex.

Полученные результаты подчеркивают важность использования методов генотипирования при исследовании такой мономорфного группы как В. сereus complex, причем необходимо использовать именно комплекс подходов, преимущественно основанных на данных полногеномного секвенирования. Исследование данной группы микроорганизмов показало свою актуальность и с точки зрения оценки микробиологических рисков в Арктическом регионе при изменении климата, в связи с выявлением вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы, а также крупной вспышкой этого заболевания среди оленей летом 2016 г., которая была спровоцирована таянием вечной мерзлоты с законсервированными в ней спорами, а также выделением других родов микроорганизмов, имеющих патогенный потенциал [16, 39, 40].

Материал подготовлен в рамках секторальной программы Роспотребнадзора. Работа частично выполнена в рамках Соглашения о научно-тоническом сотрудничестве между ГНЦ ПМБ и АНО “Губернская академия”.

Список литературы

  1. Stepanov I., Makarov I., Makarova E. et al. // Climatic Change. 2023. V. 176. № 4. P. 39. https://doi.org/10.1007/s10584-023-03512-5

  2. Baldwin V.M. // Front. Microbiol. 2020. P. 11. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01731

  3. Carroll L.M., Kovac J., Miller R.A., Wiedmann M. // Appl. Environ. Microbiol. 2017. V. 83. № 17. e01096-17. https://doi.org/10.1128/AEM.01096-17

  4. Jovanovic J., Ornelis V.F.M., Madder A., Rajkovic A. // Compr. Rev. Food. Sci. Food. Saf. 2021. V. 20. № 4. P. 3719–3761. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12785

  5. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Тюрин Е.А., Степанов А.В. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. / М.: ЗАО МП Гигиена, 2008. 416 с.

  6. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н. Методы изучения биологических и молекулярно-генетических свойств возбудителя сибирской язвы: учебно-методическое пособие. / Ред. И.А. Дятлов. М.: Издательство “Династия”, 2021. 240 с.

  7. Drean P., Fox E.M. // Methods Mol. Biol. 2015. № 1301. P. 71–83. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2599-5_7

  8. Daffonchio D., Borin S., Frova G., Gallo R., Mori E., Fani R. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 3. P. 1298–303. https://doi.org/10.1128/AEM.65.3.1298-1303.1999

  9. Oh M.H., Ham J.S., Cox J.M. // Int. J. Food Microbiol. 2012. V. 152. № 1–2. P. 1–8. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.09.018

  10. Ripabelli G., McLauchlin J., Mithani V., Threlfall E.J. // Lett. Appl. Microbiol. 2000. V. 30. № 5. P. 358–63. https://doi.org/10.1046/j.1472-765x.2000.00729.x

  11. Hill K.K., Ticknor L.O., Okinaka R.T., Asay M., Blair H., Bliss K.A. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. № 2. P. 1068–1080. https://doi.org/10.1128/AEM.70.2.1068-1080.2004

  12. Helgason E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A., Fouet A., Mock M., Hegna I., Kolstø A.B. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 6. P. 2627–2630. https://doi.org/10.1128/AEM.66.6.2627-2630.2000

  13. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A., Kolstø A.B. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. № 1. P. 191–201. https://doi.org/10.1128/AEM.70.1.191-201.2004

  14. Priest F.G., Barker M., Baillie L.W., Holmes E.C., Maiden M.C. // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 23. P. 7959–7970. https://doi.org/10.1128/JB.186.23.7959-7970.2004

  15. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L., Schupp J.M., Okinaka R. et al. // J. Bacteriol. 2000. V. 182. № 10. P. 2928–2936. https://doi.org/10.1128/JB.182.10.2928-2936.2000

  16. Timofeev V., Bahtejeva I., Mironova R., Titareva G., Lev I., Christiany D. et al. // PLoS One. 2019. V. 14. № 5. e0209140. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209140

  17. Ehling-Schulz M., Guinebretiere M.H., Monthan A., Berge O. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. V. 260. № 2. P. 232–240. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2006.00320.x

  18. Marxen S., Stark T.D., Frenzel E., Rütschle A., Lücking G., Pürstinger G. et al. // Anal. Bioanal. Chem. 2015. V. 407. № 9. P. 2439–2453. https://doi.org/10.1007/s00216-015-8511-y

  19. Dietrich R., Jessberger N., Ehling-Schulz M., Märtlbauer E., Granum P.E. // Toxins (Basel). 2021. V. 13. № 2. P. 98. https://doi.org/10.3390/toxins13020098

  20. Kim J.B., Kim J.M., Kim S.Y., Kim J.H., Park Y.B., Choi N.J. et al. // J Food Prot. 2010. V. 73. № 7. P. 1219–1224. https://doi.org/10.4315/0362-028x-73.7.1219

  21. Kim J.M., Forghani F., Kim J.B., Park Y.B., Park M.S., Wang J. et al. // Food Science and Biotechnology. 2012. V. 21. № 5. P. 1439–1444. https://doi.org/10.1007/s10068-012-0189-8

  22. Tallent S.M., Hait J.M., Bennett R.W. // J. Appl. Microbiol. 2015. V. 118. № 4. P. 1068–1075. https://doi.org/10.1111/jam.12766

  23. Tsilia V., Devreese B., de Baenst I., Mesuere B., Rajkovic A., Uyttendaele M. et al. // Anal. Bioanal. Chem. 2012. V. 404. № 6–7. P. 1691–1702. https://doi.org/10.1007/s00216-012-6254-6

  24. Inatsu Y., Chotiko A., Ananchaipattana C. // Japan Agricultural Research Quarterly: JARQ. 2020. V. 54. № 1. P. 47–51. https://doi.org/10.6090/jarq.54.47

  25. Kuwana R., Imamura D., Takamatsu H., Watabe K. // Biocontrol Sci. 2012. V. 17. № 2. P. 83–86. https://doi.org/10.4265/bio.17.83

  26. Le Flèche P., Hauck Y., Onteniente L., Prieur A., Denoeud F., Ramisse V. et al. // BMC Microbiol. 2001. V. 1. P. 2. https://doi.org/10.1186/1471-2180-1-2

  27. Lista F., Faggioni G., Valjevac S., Ciammaruconi A., Vaissaire J., le Doujet C. et al. // BMC Microbiol. 2006. V. 6. P. 33. https://doi.org/10.1186/1471-2180-6-33

  28. Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y., Okinaka R.T., Hugh-Jones M.E., Ravel J. et al. // PLoS One. 2007. V. 2. № 5. e461. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000461

  29. Thierry S., Tourterel C., Le Flèche P., Derzelle S., Dekhil N., Mendy C. et al. // PLoS One. 2014. V. 9. № 6. e95131. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0095131

  30. Turnbull P.C. // J. Appl. Microbiol. 1999. V. 87. № 2. P. 237–240. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.1999.00876.x

  31. Marston C.K., Gee J.E., Popovic T., Hoffmaster A.R. // BMC Microbiol. 2006. V. 6. P. 22. https://doi.org/10.1186/1471-2180-6-22

  32. Calvigioni M., Cara A., Celandroni F., Mazzantini D., Panattoni A., Tirloni E. et al. // J. Appl. Microbiol. 2022. V. 133. № 2. P. 1078–1088. https://doi.org/10.1111/jam.15636

  33. Valjevac S., Hilaire V., Lisanti O., Ramisse F., Hernandez E., Cavallo J.D. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. № 11. P. 6613–6623. https://doi.org/10.1128/AEM.71.11.6613-6623.2005

  34. Antonation K.S., Grützmacher K., Dupke S., Mabon P., Zimmermann F., Lankester F. et al. // PLoS Negl. Trop. Dis. 2016. V. 10. № 9. e0004923. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004923

  35. Goncharova Y., Bahtejeva I., Titareva G., Kravchenko T., Lev A., Dyatlov I., Timofeev V. // Pathogens. 2021. V. 10. № 12. P. 1556. https://doi.org/10.3390/pathogens10121556

  36. Kolstø A.B., Tourasse N.J., Økstad O.A. // Annu. Rev. Microbiol. 2009. № 63. P. 451–476. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.091208.073255

  37. Federhen S., Rossello-Mora R., Klenk H.P., Tindall B.J., Konstantinidis K.T., Whitman W.B. et al. // Stand. Genomic Sci. 2016. V. 11. № 1. https://doi.org/10.1186/s40793-016-0134-1

  38. Ciufo S., Kannan S., Sharma S., Badretdin A., Clark K., Turner S. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2018. V. 68. № 7. P. 2386–2392. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002809

  39. Stella E., Mari L., Gabrieli J., Barbante C., Bertuzzo E. // Sci. Rep. 2020. V. 10. № 1. P. 16460. https://doi.org/10.1038/s41598-020-72440-6

  40. da Silva T.H., Queres Gomes E.C., Gonçalves V.N., da Costa M.C., Valério A.D., de Assis Santos D. et al. // Fungal Biol. 2022. V. 126. № 8. P. 488–497. https://doi.org/10.1016/j.funbio.2022.04.003

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал