Прикладная биохимия и микробиология. T. 59, Номер 6, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 59, № 6, 2023

Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 6, стр. 581-588

Конъюгационная система доставки векторов для молекулярного клонирования в клетки бактерий рода Bacillus

А. С. Гуринович 1, И. А. Федюшко 1, М. А. Титок 1, *

1 Белорусский государственный университет, биологический факультет, кафедра микробиологии
220030 Минск, Республика Беларусь

* E-mail: ma_titok@bsu.by

Поступила в редакцию 03.05.2023
После доработки 29.05.2023
Принята к публикации 03.07.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Разработана система доставки векторов для молекулярного клонирования в клетки бактерий рода Bacillus. Особенность созданной системы заключается в использовании плазмиды pBS72, обеспечивающей конъюгационный перенос полученного условно летального вектора pKS1mob в клетки исследуемых бактерий. Способность вектора pKS1mob реплицироваться в клетках Escherichia coli и B. subtilis при пониженной температуре (30°C), наличие двух полилинкеров вокруг гена канамицинрезистентности позволяет клонировать в его состав фрагменты целевых генов с использованием традиционных генно-инженерных подходов. Инактивация гена rok в плазмиде pBS72 позволила с высокой эффективностью трансформировать содержащий ее штамм сконструированным вектором pKS1mob. Скрещивание донорного штамма B. subtilis 168, содержащего конъюгативную pBS72 и мобилизуемую pKS1mob плазмиды, со штаммом-реципиентом рода Bacillus позволило ввести в него плазмиду pKS1mob. Показана возможность использования созданной системы для инактивации гена codY бактерий Bacillus licheniformis.

Ключевые слова: B. subtilis, плазмида pBS72, Rok белок, вектор pKS1mob, конъюгационный перенос, компетентность

Бактерии рода Bacillus, благодаря способности синтезировать широкий спектр биологически активных соединений, широко используются в биотехнологии в качестве продуцентов ферментов, антибиотиков, стимуляторов роста растений и животных [1]. В связи с этим большой практический и научный интерес представляют исследования, направленные на изучение функциональной организации их геномов, а также отдельных генетических детерминант, определяющих практически важные свойства. Следует отметить, что для генетического анализа бактерий используются подходы, основанные на естественных процессах генетического обмена, в ходе которых генетический материал, попадая в клетку путем конъюгации, трансформации и трансдукции, встраивается в геном за счет гомологичной рекомбинации, либо наследуется вне хромосомы в составе мобильных генетических элементов. Эти широко распространенные в мире прокариот процессы обеспечивают появление новых комбинаций генов и быструю адаптацию микроорганизмов в изменяющихся условиях внешней среды. В лабораторных условиях для большинства бактерий традиционно используется метод трансформации (электропорации), позволяющий вводить генно-инженерные конструкции для изучения функциональной организации генетического материала и создания штаммов с заданными свойствами. Однако, несмотря на наличие в геноме представителей рода Bacillus (например, Bacillus subtilis) генетической системы, обеспечивающей их природную компетентность, внесение в клетки этих бактерий чужеродной ДНК может быть затруднено, либо невозможно. Весьма показательным является пример коллекционного штамма B. subtilis 168, широко использующегося для генетических и генно-инженерных исследований. Природные бактерии, на основе которых этот штамм был получен, содержали плазмиду pBS32, препятствующую трансформации [2]. Аналогичное наблюдали у природных бактерий B. subtilis, содержащих конъюгативную плазмиду pLS20 [3]. Сложности, возникающие при введении чужеродной ДНК путем трансформации (электропорации), наблюдали и для других биотехнологически значимых бактерий этой таксономической группы (например, природных бактерий B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus и др.) [4]. При этом в клетках многих из них присутствовали плазмиды, роль которых в подавлении процесса трансформации до сих пор не известна. В связи с этим, для введения генно-инженерных конструкций в клетки данных микроорганизмов пристальное внимание уделяется процессу конъюгации. В настоящее время показана возможность использования конъюгативного транспозона ICEBs1 и конъюгативной плазмиды pLS20 [4, 5]. Поскольку конъюгационные системы этих мобильных элементов подвержены негативной регуляции, было важно изучить возможность использования плазмиды pBS72, способной передаваться путем конъюгации и мобилизовать конъюгационный перенос векторных молекул вне зависимости от условий скрещивания (в частности, перенос не зависел от времени скрещивания и обеспечивался на плотной и в жидкой среде разного химического состава) [6].

Цель настоящей работы – создание системы конъюгационной переноса векторов в клетки бактерий рода Bacillus с использованием плазмиды pBS72.

МЕТОДИКА

В работе использовали штаммы B. subtilis 72 с плазмидой pBS72 [7], B. subtilis d16, B. licheniformis FD9, B. vezelensis 7IA3 из коллекции кафедры микробиологии Белорусского государственного университете (БГУ), коллекционные штаммы B. subtilis 168, содержащие маркированную геном эритромицинрезистентности плазмиду pBS72 и/или плазмиду pCB16 [8], E. coli XL1-Blue, E. coli TG1 и фитопатогенные грибы Fusarium culmorum, Botrytis cinerea, Alternaria radicina из коллекции кафедры ботаники БГУ, а также плазмиды рMTL21С и pKS1 [9]. Бактерии выращивали в полноценной среде LB [10] и минимальной среде [11] при 37°C с аэрацией (240 об./мин). Для роста фитопатогенных грибов использовали картофельно-морковный агар: картофель – 20 г/л, морковь – 20 г/л, агар – 15 г/л.

В работе использовали коммерческие препараты ампициллина (100 мкг/мл), хлорамфеникола (10 мкг/мл), эритромицина (10 мкг/мл), стрептомицина (50 мкг/мл), тетрациклина (25 мкг/мл), и канамицина (50 мкг/мл).

Тотальную ДНК выделяли саркозиловым методом [12]. Трансформацию бактерий E. coli и B. subtilis осуществляли согласно методам, приведенным в работах [10, 13].

Для амплификации использовали Phusion HF ДНК-полимеразу производства “ThermoScientific” (США) и праймеры производства ОДО “Праймтех” (Беларусь). Реакционная смесь для ПЦР (50 мкл) содержала около 100 нг ДНК-матрицы, 0.2 ммоль/л каждого дНТФ, 0.5 мкмоль/л каждого праймера, 0.02 ед. ДНК-полимеразы и соответствующий буфер.

Для амплификации фрагмента гена rok плазмиды pBS72 размером 421 п.н использовали праймеры Frok-nok (5'-TCT CTC TCT ACC TGT TTT TGC AG-3') и Rrok-nok (5'-TGT GTC AAA TGC CAA ACG AC-3'), для амплификации mobV-сайта плазмиды рBC16 размером 1863 п.н. – праймеры Fmob (5'-GC GCG ATT GCT GAA TAA AAG ATA C-3') и Rmob (5'-CAC TTC AAC GCA CCT TTC AG-3'), для амплификации гена KmR плазмиды pKS1 размером 1009 п.н. – праймеры FKmR (5'-CGGT CCG GAG TCG ATA CTA TGT TAT ACG CCA AC-3') и RKmR (5'-CGG TCC GGA CGG CAA TTG AGC TTT TTA GAC ATC TAA ATC TAG GTA C-3'), содержащие на 5'-концах сайт рестрикции для фермента Kpn2I.

Амплификацию фрагментов гена codY бактерий B. licheniformis FD9 размером 239 п.н. и 156 п.н. проводили соответственно с использованием праймеров F1codY (5'-CCG CGG CGG AAA CGT CAT CTA ACC TTG-3') и R1codY (5'-GAT CTC TTC CGC TTT CTC TCT GAT CCG GAG AAT TTC CAT TCC TAC GAC AGT G-3'), F2codY (5'-CGG TCC GGA TCA GAG AGA AAG CGG AAG AGA TC-3') и R2codY (5'-CAA TTT TAC TAG CGA CAA GCA GG-3'). Внутренние праймеры R1codY и F2codY содержали на 5'-концах сайт рестрикции для фермента Kpn2I. Полученные ПЦР-продукты использовали в качестве матрицы для амплификации гена codY размером 381 п.н. с внешними праймерами F1codY и R2codY, содержащими на 5'-концах сайты рестрикции для ферментов SacII и Eco147I соответственно.

Рестрикцию и лигирование осуществляли в условиях, рекомендуемых фирмой-изготовителем (“Thermo Scientific”, США). Все продукты ПЦР встраивали в вектор pMTL21C в уникальный SmaI-сайт. Последовательность mobV-сайта вырезали из плазмиды pMTL21C рестриктазами KpnI и HindIII с последующим встраиванием в плазмиду pKS1, предварительно обработанную этими же рестриктазами. В сайт Kpn2I гена codY встраивали маркер канамицинрезистентности, вырезанный из плазмиды pMTL21C с помощью этой же рестриктазы. Встраивание гена codY, маркированного канамицинрезистентностью, осуществляли между сайтами SacII и Eco147I вектора pKS1mob.

Интеграцию вектора рMTL21С, содержащего фрагмент гена rok, в состав плазмиды pBS72 устанавливали с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймера M13F (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3'), отжигающегося на последовательности вектора рMTL21С, и праймера Rrok-out (5'-GTT GGG TTA TCG ATA GCG AAG-3'), комплементарно связывающегося вне области встраивания гибридной плазмиды (был получен фрагмент искомого размера 567 п.н.). Интеграцию гибридного вектора pKS1mob, содержащего фрагмент гена codY, в хромосому бактерий B. licheniformis FD9 устанавливали с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймера FKmR (5'-CGG TCC GGA GTC GAT ACT ATG TTA TAC GCC AAC-3'), отжигающегося на последовательности вектора pKS1mob, и праймера FcodY-out (5'-GAA CAT TTT CGT CGT CAG CC-3'), комплементарно связывающегоcя вне области встраивания гибридной плазмиды. В результате был получен фрагмент искомого размера 1385 п.н.

Для определения частоты переноса конъюгативной плазмиды pBS72 в изогенной системе скрещивания культуру донора и реципиента в логарифмической фазе роста смешивали 1 : 1 и скрещивали в жидкой среде LB с аэрацией в течение 1, 2, 3, 4 или 24 ч с последующим высевом на селективные среды. Для определения частоты переноса мобилизуемого вектора в гетерогенных системах культуру донора и реципиента в логарифмической фазе роста разводили в 10 раз в свежей полноценной среде (800 мкл) с последующим культивированием с аэрацией в течении 3 или 24 ч при температуре 30°С. После 3 и 24 ч скрещивания клетки высевали на минимальную среду с канамицином и культивировали при 37°С. Полученные трансконъюганты проверяли на наличие маркеров антибиотикорезистентности методом реплик. Присутствие в клетках трансконъюгантов плазмид дополнительно определяли с использованием ПЦР-анализа.

Определение антифунгальной активности осуществляли методом рассева 100 мкл взвеси конидий в концентрации (100 кон./мл) на поверхность подсушенной агаризованной питательной среды. После этого вырезали лунки диаметром 0.5 см, в которые вносили по 100 мкл жидкой культуры бактерий-антагонистов и культивировали при 28°С в течение 5 сут. Через 5 сут отмечали зону лизиса. В качестве контроля использовали питательный бульон, в котором выращивали штаммы-антагонисты. На основании трех независимых экспериментов с шестью повторами проводили статистическую обработку данных с использованием программы Microsoft Excel. Достоверность различий была подтверждена однофакторным дисперсионным анализом.

Для анализа аминокислотных последовательностей белков Rok, кодируемых плазмидами pBS72 (APB62404) и pLS20 (BAJ76946.1), а также хромосомным геном бактерий B. subtilis 168 (NP_389307) использовали программу BLASTN2.10.0 (сайт: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Аминокислотные последовательности гомологичных белков выравнивали с помощью программы “ClustalOmega” (сайт https://www.ebi.ac.uk/Tools/common/tools/help/ index.html?tool=clustalo).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для создания системы конъюгационного переноса векторов с использованием плазмиды pBS72 необходимо было решить следующие задачи. Во-первых, определить возможность введения векторов в клетки коллекционных бактерий B. subtilis 168, содержащих маркированную плазмиду pBS72, и при отсутствии трансформации установить наличие в составе плазмидного репликона генов, ингибирующих данный процесс. Во-вторых, сконструировать вектор пригодный для молекулярного клонирования и способный передаваться путем конъюгации за счет плазмиды pBS72. Для этих целей предполагали использовать известный вектор pKS1, способный копироваться в клетках E. coli, отличительной особенностью которого являлась зависимая от температуры репликация. Он стабильно наследовался в бактериях разных систематических групп (E. coli и рода Bacillus) при температуре 30°C и утрачивался клетками при 37°C [9]. Это позволяло использовать данный репликон для введения чужеродного генетического материала при пониженной температуре и направленного мутагенеза при повышенной температуре культивирования. Для этого необходимо было клонировать в его состав mobV-сайт, обеспечивающий его конъюгационный перенос плазмидой pBS72. И, наконец, установить возможность использования созданной системы для генетического анализа бактерий рода Bacillus. Для этого предполагали встроить в состав созданного мобилизуемого вектора фрагменты бактериального гена codY природных бактерий B. licheniformis FD9. Поскольку известно, что данная детерминанта кодировала негативный регулятор синтеза антимикробных соединений (показана негативная регуляция синтеза лихенизина, определяющего антифунгальные свойства данных бактерий) [15], предполагали, что внесение направленной мутации в данный ген приведет к изменению антифунгальной активности исследуемых бактерий.

На первом этапе работы было установлено, что бактерии B. subtilis 168, содержащие плазмиду pBS72 не трансформируются вектором pKS1. Отсутствие трансформантов свидетельствовало о присутствии в геноме плазмиды pBS72 детерминант, подавляющих поглощение чужеродной ДНК. Действительно, в результате анализа полной нуклеотидной последовательности плазмиды pBS72 была выявлена открытая рамка считывания 135, способная кодировать белок Rok, ингибирующий трансформацию у бактерий B. subtilis. Представлялось важным охарактеризовать данный полипептид и определить его роль в трансформации, что имело принципиальное значение при введении векторов в клетки, содержащие плазмиду pBS72. Молекулярно-генетический анализ исследуемого белка Rok в сравнении с известными, кодируемыми хромосомным геном B. subtilis и плазмидой pLS20, позволил установить, что он подобно гомологичным полипептидам содержал вариабельную N-концевую (аминокислоты 1–45) и консервативную C-концевую (аминокислоты 96–191) аминокислотную последовательности (рис. 1). Исследуемый белок проявлял больше сходства с N- и C-концевыми последовательностями хромосомного белка бактерий B. subtilis 168 (идентичность составила 63 и 59% соответственно), чем с таковым, кодируемым плазмидой pLS20 (идентичность составила 42 и 59% соответственно). Присутствие в C-концевом участке ключевых аминокислот, обеспечивающих связывание с молекулами ДНК, свидетельствовало в пользу его возможной функциональной активности. Известно, что основная роль белка Rok заключалась в репрессии транскрипции гена comK, являющегося позитивным регулятором экспрессии большого числа генов, продукты которых необходимы для установления состояния компетентности и поглощения чужеродной ДНК бактериальной клеткой в процессе трансформации [16]. Следует отметить, что функция подавления трансформации установлена для белка Rok, кодируемого плазмидой pLS20. Показано, что мутация в гене rok увеличивала в 100 раз способность содержащих плазмиду pLS20 бактерий трансформироваться чужеродной ДНК [3]. Для белка, кодируемого хромосомным геном rok B. subtilis, изучен более широкий спектр функциональной активности. Помимо подавления компетентности установлена его способность негативно регулировать экспрессию большого числа генов (около 250), в том числе в составе мобильных генетических элементов (в частности, ингибировать конъюгационный перенос транспозона ICE Bs1) [17].

Рис. 1

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков Rok, кодируемых плазмидами pBS72 и pLS20 и хромосомным геном бактерий B. subtilis 168: * – функционально значимые несинонимические замены; : – функционально незначимые замены. Функционально значимые аминокислоты, определяющие взаимодействие с молекулой ДНК, обозначены стрелками; N-концевые, спейсерные и C-концевые аминокислотные последовательности обозначены сплошной, пунктирной и жирной пунктирной линиями соответственно (согласно данным, приведенным в работе [17]).

Сходство белка, кодируемого открытой рамкой считывания 135 с известными полипептидами, подавляющими трансформацию, обосновало внесение мутации в ген rok плазмиды pBS72. Инактивацию данной детерминанты осуществляли с использованием суицидального вектора pMTL21, содержащего фрагмент гена rok. В результате встраивания данного вектора в состав исследуемой плазмиды был отобран мутантный вариант (локализация инсерции определена с использованием ПЦР-анализа). При этом, помимо нарушения в гене rok, мутантная плазмида содержала селективный маркер хлорамфениколрезистентности. Мутант получен в результате встраивания в ген rok плазмиды pMTL21. Использование бактерий B. subtilis 168, содержащих мутантную плазмиду pBS72 с нарушенным геном rok, позволило трансформировать их вектором pKS1. При этом частота трансформации вектора не отличалась от таковой при его внесении в безплазмидные клетки B. subtilis 168. и составила 4.6 × 103 и 5.9 × 103 соответственно (приведены значения частот трансформации рассчитанные на 1 мкг ДНК плазмиды pKS1). Кроме того, было установлено, что мутация гена rok не влияла на частоту конъюгационного переноса плазмиды pBS72. Частота переноса исходной и мутантной плазмид в изогенной системе бактерий B. subtilis составила 10–2–10–3 при скрещиваниях в жидкой среде в течение 1, 2, 3, 4 и 24 ч (приведены частоты переноса рассчитанные относительно количества клеток донора).

Следующий этап работы был посвящен созданию мобилизуемого вектора pKS1. Для этого в его состав с использованием генно-инженерных манипуляций (ПЦР, рестрикция) был встроен mobV-сайт размером 1863 п.н. плазмиды pBC16, обеспечивающий ее конъюгационный перенос плазмидой pBS72 [6]. На основании ПЦР- и рестрикционного анализа было установлено, что полученная конструкция содержала все функционально значимые участки для ее дальнейшего использования. В частности, термочувствительный по репликации rep-ген, mobV-сайт, ген эритромицинрезистентности, а также два полилинкера, расположенных перед и за геном канамицинрезистентности: BseYI. PspFI, XmaI, SmaI, SpeI, NotI, SacII, BstXI, BstZ17I и HindIII, SbfI, StuI, XhoI, BglII, NcoI, MluI, ZraI, SalI соответственно, пригодные для встраивания фрагментов чужеродной ДНК (рис. 2). Поскольку mobV-сайт изолировали с использованием ПЦР, не исключали возможности наличия в нем нуклеотидных замен и, как следствие, потерю функциональной активности. Для доказательства способности встроенного mob-сайта обеспечивать конъюгационный перенос плазмиды pKS1 (обозначена как pKSmob) ее вносили в бактерии B. subtilis 168, содержащие плазмиду pBS72 с нарушенным геном rok, и проверяли частоту ее переноса в скрещиваниях с природными бактериями рода Bacillus (табл. 1).

Рис. 2.

Схема организации вектора pKS1mob: rep – ген, кодирующий термочувствительный белок инициации репликации плазмиды pKS1; mob – сайт, обеспечивающий конъюгационный перенос вектора путем мобилизации; EryR – ген, определяющий устойчивость к эритромицину; KmR – ген, определяющий устойчивость к канамицину; BseYI. PspFI, XmaI, SmaI, SpeI, NotI, SacII, BstXI, BstZ17I и HindIII, SbfI, StuI, XhoI, BglII, NcoI, MluI, AatII, ZraI, SalI – уникальные сайты рестрикции.

Таблица 1.

Частота конъюгационного переноса вектора pKS1mob в клетки бактерий рода Bacillus

Реципиент Время скрещивания, ч Частота конъюгационного переноса вектора pKS1mob
B. subtilis d16 3 1.51 × 10–4
24 1.63 × 10–4
B. licheniformis FD9 3 1.11 × 10–6
24 2.71 × 10–6
B. velezensis 7I3A 3 1.80 × 10–6
24 2.93 × 10–8

Примечание: приведены частоты переноса относительно количества клеток донора.

В результате при скрещивании в течение 3 и 24 ч был установлен конъюгационный перенос вектора pKS1mob в клетки всех исследованных бактерий. При этом частота его переноса в клетки бактерий B. subtilis d16 и B. licheniformis FD9 составила соответственно 10–4 и 10–6 вне зависимости от времени скрещивания. Тогда как в клетки B. velezensis 7I3A перенос вектора снижался со временем и составил 1.80 × 10–6 при скрещивании в течение 3 и 2.93 × 10–8 при скрещивании в течение 24 ч (табл. 1).

Установлено, что в клетках отобранных трансконъюгатов отсутствовала мобилизующая плазмида pBS72, а векторная молекула pKS1mob не наследовалась при культивировании бактерий в неселективных условиях при 37°С. Полученные результаты обосновали возможность использования вектора pKS1mob для клонирования фрагментов гена codY природных бактерий B. licheniformis FD9 с целью последующей инактивации данной детерминанты.

Ген codY был изолирован с использованием техники перекрывающейся ПЦР, с последующим встраиванием в его состав гена канамицинрезистентности. Фрагмент гена codY, маркированный геном канамицинрезистентности был встроен в вектор pKS1mob (рис. 3). Следует отметить, что все манипуляции осуществляли с использованием бактерий E. coli, что являлось наиболее оптимальным при создании генно-инженерных конструкций.

Рис. 3.

Схема организации вектора pKS1mob с клонированными фрагментами гена codY: rep – ген, кодирующий термочувствительный белок инициации репликации плазмиды pKS1; mob – сайт, обеспечивающий конъюгационный перенос вектора путем мобилизации; EryR – ген, определяющий устойчивость к эритромицину; KmR – ген, определяющий устойчивость к канамицину; codY – фрагменты гена codY бактерий B. licheniformis FD9; SacII, BstZ17I, StuI, XhoI, BglII, NcoI, MluI, ZraI, AatII SalI – уникальные сайты рестрикции.

Полученной гибридной плазмидой трансформировали коллекционные бактерии B. subtillis 168, содержащие плазмиду pBS72 с нарушенным геном rok. Полученный донорный штамм скрещивали с бактериями B. licheniformis FD9. В результате конъюгационных скрещиваний трансконъюганты бактерий B. licheniformis были отобраны с частотой 7.9 × 10–5 (в пересчете на количество клеток донора) на минимальной среде с добавлением канамицина в концентрации 50 мкг/мл. Было установлено, что отобранные трансконъюганты при выращивании в неселективных условиях стабильно наследовали маркер канамицинрезистентности и не содержали устойчивости к эритромицину (ген локализовался в плазмиде pKS1mob). Это свидетельствовало в пользу того, что в результате гомологичной рекомбинации произошла замены гена codY дикого типа на его фрагмент, содержащий ген канамицинрезистентности. Отсутствие в хромосоме плазмидного репликона дополнительно подтверждено с использованием ПЦР-анализа.

Сравнительный анализ антифунгальной активности исходного и мутантного штаммов B. licheniformis FD9 показал, что нарушение в гене codY не влияло на его способность подавлять развитие гриба Botrytis cinerea, полностью название рода (табл. 2). В то же время относительно фитопатогенных грибов Fusarium culmorum полностью и Alternaria radicina полностью уровни антимикробной активности бактерий дикого типа и мутанта отличались и зависели от времени их культивирования. При этом наиболее высокие значения активностей, определяемые по размеру зоны задержки роста гриба, наблюдались для мутантного штамма (различия статистически достоверны, р < 0.001).

Таблица 2.

Антимикробная активность исходного и мутантного штаммов B. licheniformis FD9

Патоген Зона задержки роста гриба бактериями, мм
дикий тип B. licheniformis FD9 мутант B. licheniformis FD9*
время культивирования бактерий, ч
24 48 24 48
F. culmorum 21.2 ± 3.0 14.4 ± 4.0 12.8 ± 4.0 32.0 ± 2.0
B. cinerea 25.6 ± 4.0 29.5 ± 4.0 27.2 ± 4.0 29.6 ± 4.0
A. radicina 17.8 ± 2.0 27.2 ± 3.0 38.6 ± 3.0 15.1 ± 3.0

* Бактерии B. licheniformis FD9 с инактивированным геном codY.

Таким образом, в результате выполнения исследования создана конъюгационная система доставки векторов для молекулярного клонирования в клетки бактерий рода Bacillus. Для этого отобран мутантный вариант плазмиды pBS72 с нарушенным геном rok, не препятствующий введению векторов методом трансформации в содержащие его клетки и сохраняющий на уровне дикого типа конъюгационные свойства. Сконструирован вектор, содержащий mobV-сайт (pKS1mob), обеспечивающий его конъюгационный перенос плазмидой pBS72 в клетки природный бактерий рода Bacillus. Способность вектора pKS1mob копироваться в клетках E. coli и наличие двух полилинкеров вокруг гена канамицинрезистентности позволяет клонировать в него фрагменты анализируемых генов с использованием традиционных генно-инженерных подходов. Присутствие в векторе pKS1mob термочувствительной системы репликации позволяет направленно инактивировать исследуемые гены для последующего функционального анализа. Преимущество созданной системы состоит в том, что для введения векторов существенно сокращаются материальные и временные затраты. Искомые мутантные варианты можно отобрать на минимальной агаризованной среде с канамицином при 37°C (отсутствие триптофана является контрселектирующим маркером) через 3 ч после скрещивания в жидкой полноценной среде при 30°C донорных и реципиентных бактерий рода Bacillus. При этом в качестве доноров необходимо использовать бактерии B. subtillis 168, содержащие конъюгативную плазмиду pBS72 с нарушенным геном rok и мобилизуемый вектор с фрагментами анализируемого гена.

Работа выполнялась при финансовой поддержке Государственной программы научных исследований “Биотехнологии-2” (задание 3.6.2) и гранта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (№ Б21-142).

Список литературы

  1. Harwood C.R., Mouillon J.M., Pohl S., Arnau J. // FEMS Microbiol. Rev. 2018. V. 42. P. 721–738. https://doi.org/10.1093/femsre/fuy028

  2. Burton A.T., Kearns D.B. // J. Bacteriol. 2020. V. 202. № 18. P. e00290-20. https://doi.org/10.1128/JB.00290-20

  3. Singh P.K., Ramachandran G., Duran-Alcalde L., Alonso C., Wu L.J., Meijer W.J. // Environ. Microbiol. 2012. V. 14. № 10. P. 2812–2825. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2012.02819x

  4. Jeong D.E., Kim M.S., Kim H.R., Choi S.K. // Front. Microbiol. 2022. V. 13. P. 802040. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.802040

  5. Brophy J.A.N., Triassi A.J., Adams B.L. // Nat. Microbiol. 2018. V. 3. P. 1043–1053. https://doi.org/10.1038/s41564-018-0216-5

  6. Gurinovich A.S., Titok M.A. // Microbiology. 2022. V. 91. № 4. P. 395–408. https://doi.org/10.1134/S002626172230018X

  7. Titok M.A., Chapuis J., Selezneva Y.V., Lagodich A.V., Prokulevich V.A., Ehrlich S.D., Jannière L. // Plasmid. 2003. V. 49. № 1. P. 53–62. https://doi.org/10.1016/s0147-619x(02)00109-9

  8. Gurinovich A.S., Titok M.A. // Microbiology. 2020. V. 89. № 6. P. 660–669. https://doi.org/10.1134/S0026261720060065

  9. Shatalin K.Y., Neyfakh A.A. // FEMS Microbiology Letters. 2005. V. 245. № 2. P. 315–319. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.03.029

  10. Harwood C.R., Cutting S.M. Molecular Biological Methods for Bacillus. / Ed. C.R. Harwood and S.M. Cutting Chichester, New York: Wiley, 1990. 581 p.

  11. Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. 1961. V. 81. № 5. P. 741–746. https://doi.org/10.1128/jb.81.5.741-746.1961

  12. te Riele H., Michel B., Ehrlich S.D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 2541–2545. https://doi.org/10.1073/pnas.83.8.2541

  13. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 468 p.

  14. Poluektova E.U., Fedorina E.A., Lotareva O.V., Prozorov A.A. // Plasmid. 2004. V. 52. P. 212–217. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2004.07.001

  15. Fujita Y, Satomura T, Tojo S, Hirooka K. // J. Bacteriol. 2014. V. 196. P. 3793–3806. https://doi.org/10.1128/JB.02055-14

  16. Hoa T.T., Tortosa P., Albano M., Dubnau D. // Mol. Microbiol. 2002. V. 43. № 1. P. 15–26. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2002.02727.x

  17. Smits W.K., Grossman A.D. // PLoS Genet. 2010. V. 11. № 6. P. e1001207. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1001207

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал