Радиационная биология. Радиоэкология, 2019, T. 59, № 2, стр. 170-176

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЦИТОКИНОВ В КАЧЕСТВЕ РАДИОЗАЩИТНЫХ СРЕДСТВ

Цитокины представляют собой отдельный класс эндогенных полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, синтезируемых клетками организма для регуляции ряда нормальных физиологических функций и для обеспечения восстановления гомеостаза, нарушенного в результате воздействия физических, химических и биологических факторов, включая ионизирующее облучение. Цитокины за счет плейотропного типа биологического действия выполняют роль организации взаимодействия между клетками различного происхождения и с разными функциональными свойствами на местном и системном уровне [1]. Достижения современной биотехнологии позволяют получать различные генно-инженерные препараты цитокинов, обладающие радиозащитными и антитоксическими свойствами. Среди них в последние годы особое внимание уделяется препаратам рекомбинантных цитокинов, стимулирующих кроветворение, например, колоние-стимулирующих факторов (КСФ) и интерлейкина-1.

В их ряду одними из главных активаторов костномозгового кроветворения служат КСФ для гранулоцитарного ростка кроветворения (Г-КСФ), а также КСФ для гранулоцитов и макрофагов (ГМ-КСФ). Сравнение препаратов Г-КСФ и ГМ-КСФ свидетельствует о большей клинической эффективности Г-КСФ. В первую очередь это связано с более быстрым увеличением числа гранулоцитов при стимуляции кроветворения, более эффективной мобилизацией стволовых клеток и использованием для лечения более широкого круга заболеваний, включая наследственные нейтропении. Во-вторых, Г-КСФ имеет гораздо меньше побочных эффектов. Г-КСФ является главным ростовым фактором для нейтрофильных гранулоцитов, обеспечивая нормальное функционирование системы кроветворения и поддержание необходимого уровня этого типа клеток.

В экспериментальных исследованиях продемонстрировано, что введение препарата Г-КСФ Лейкостим в ранние сроки после острого облучения мышей в смертельных дозах приводит к снижению тяжести цитопенического синдрома и вызывает ускорение восстановления костномозгового кроветворения [2]. Клиническое применение Г-КСФ у онкологических больных эффективно восстанавливает содержание гранулоцитов в периферической крови, сниженное в результате высокодозной химио- и радиотерапии рака, и препятствует развитию инфекционных осложнений. В настоящее время в клинической практике используются два основных варианта рекомбинантного Г-КСФ человека: негликозилированный Г-КСФ, получаемый в E. coli (наиболее известные торговые названия медицинских препаратов – Нейпоген, Филграстим), и гликозилированный Г-КСФ, получаемый из трансформированных клеток СНО (Chinese hamster ovary cells), под торговой маркой Граноцит. В клинической практике также применяется Г-КСФ с пролонгированным действием на основе полиэтиленгликоля, что позволяет уменьшить число введений препарата и улучшить фармакокинетику с достижением более плавной кривой изменения концентрации Г-КСФ в циркуляции [3]. Г-КСФ и ГМ-КСФ использовались для коррекции лейкопении у пациентов, пострадавших при радиационных авариях, при этом было продемонстрировано их лейкостимулирующее действие [4]. В США препараты Г-КСФ и ГМ-КСФ включены в список средств лечения пострадавших при радиационных авариях [5, 6]. Среди цитокинов в качестве радиопротекторов исследовались также ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-11, тромбопоэтин, интерфероны и некоторые другие, однако по разным причинам на их основе не создано радиозащитных препаратов.

Многочисленные экспериментальные и клинические исследования показали, что наиболее эффективным радиозащитным средством среди цитокинов является интерлейкин-1β (ИЛ-1). В опытах, проведенных в Институте биофизики МЗ РФ, Военно-медицинской академии и Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России на краткосрочных культурах костного мозга, линейных мышах и беспородных собаках, показано, что однократное применение ИЛ-1 в пределах от нескольких минут до 2 ч после радиационного воздействия оказывает положительное влияние на течение и исход острого лучевого поражения. В основе радиозащитного действия ИЛ-1 лежит активация миелопоэза и других ростков кроветворения, начиная с уровня стволовых кроветворных клеток, и тканевых процессов репарации. В опытах на собаках, облученных в дозе, превышающей минимальную абсолютно смертельную (ЛД_95/45), экстренное применение ИЛ-1 с последующей поддерживающей терапией антибиотиками в разгар острой лучевой болезни позволяло спасать часть животных от гибели при отсутствии положительного эффекта от применения одних антибиотиков [7–10].

Генно-инженерный препарат рекомбинантного ИЛ-1 человека под названием Беталейкин зарегистрирован в РФ в качестве гемостимулирующего, иммуностимулирующего и радиозащитного средства. Беталейкин стимулирует костномозговое кроветворение, усиливает функции клеток врожденного и приобретенного иммунитета и регенерацию поврежденных тканей за счет активации пролиферации и функциональной активности эпителиальных клеток и фибробластов. В клинических исследованиях у онкологических больных, перенесших высокодозную радио- и химиотерапию, применение препарата Беталейкин сокращало сроки и глубину лейкопении, приводило к более быстрому восстановлению кроветворения [11]. Смысл применения ИЛ-1β у больных раком заключается в его способности быстро восстановить кроветворение, подавленное вследствие применения цитостатиков или лучевой терапии. Это может позволить проводить курсы химиотерапии в нужном режиме и дозировках, обеспечивающих достижение желаемого противоопухолевого эффекта.

Основным свойством Беталейкина, не присущим гемопоэтическим колониестимулирующим факторам – препаратам Г-КСФ и ГМ-КСФ, является его способность оказывать стимулирующий эффект в отношении лейкопоэза, что позволяет расширить возможности проведения химиотерапии и соответственно повысить ее эффективность при умеренном лейкопеническом фоне. Принципиальные различия между ИЛ-1 и препаратами КСФ заключаются в механизмах их действия и связаны, прежде всего, с некоторыми различиями в клетках-мишенях для их действия. Препараты КСФ стимулируют пролиферацию поздних предшественников кроветворных клеток гранулоцитарного ростка кроветворения или более ранних предшественников гранулоцитов и макрофагов, вызывая за счет этого увеличение числа лейкоцитов периферической крови. Гемостимулирующий эффект ИЛ-1 обусловлен индукцией выработки нескольких эндогенных КСФ и синергичным с ними усилением пролиферации и дифференцировки клеток различных ростков кроветворения. ИЛ-1 действует на кроветворные клетки на разных этапах их созревания, включая стадию полипотентных стволовых клеток. Поэтому применение приводит к возрастанию не только количества гранулоцитов, но также тромбоцитов и лимфоцитов, что позволяет ему более эффективно восстанавливать нормальное кроветворение. Кроме того, действие ИЛ-1 заключается не только в увеличении количества лейкоцитов, но и приводит к усилению их функциональной активности по показателям активации хемотаксиса, продукции кислородных радикалов и фагоцитоза нейтрофильных гранулоцитов, что является составной частью иммуностимулирующего действия. Клинические испытания у больных раком показали, что важной особенностью применения Беталейкина является возможность его использования одновременно с курсом химиотерапии. Препараты КСФ не могут быть использованы до окончания химиотерапии и их применение ограничено только восстановлением подавленного лейкопоэза. Таким образом, препарат Беталейкин может быть использован и как средство лечения, и как средство профилактики токсической лейкопении, вызванной применением различных схем комбинированной химио- и радиотерапии. Принципиальные отличия препаратов на основе ИЛ-1 и препаратов КСФ были показаны еще в ранних радиобиологических экспериментах на смертельно облученных мышах и собаках. Оказалось, что ИЛ-1 обладает выраженной способностью экстренного противолучевого действия при однократном введении, тогда как эффективность Г-КСФ и ГМ-КСФ существенно ниже [12].

Согласно утвержденной МЗ РФ инструкции по применению препарата, Беталейкин разрешен к применению в условиях аварийного острого облучения в качестве средства экстренной патогенетической терапии и рекомендуется для подкожного введения пострадавшим от острых тотальных и субтотальных аварийных облучений в дозах выше 0.5–1 Гр в течение 2 ч после лучевого воздействия. В перспективе возможно его использование в качестве препарата индивидуального применения в форме шприца-тюбика как средства экстренной терапии при острых аварийных облучениях человека. Получены первые данные о способности ИЛ-1 снижать проявления отдаленных последствий пролонгированного воздействия низкоинтенсивного γ-излучения [13]. При проведении клинических испытаний выяснилось, что Беталейкин защищал кроветворную систему и от гемосупрессивного воздействия химиопрепаратов. Поэтому он может быть использован не только как радиозащитное средство, но и в качестве средства борьбы с последствиями поражения токсическими веществами. В экспериментальных исследованиях также показано местное ранозаживляющее действие ИЛ-1 при лучевых ожогах кожи [14], что весьма важно при радиационных авариях и при проведении лучевой терапии опухолей.

По мнению Л.М. Рождественского, очень важно не смешивать применение Беталейкина в качестве средства экстренной терапии после аварийного облучения с его возможным использованием в качестве гемостимулятора и иммуномодулятора при химио- и радиотерапии злокачественных опухолей. В онкологии Беталейкин используют путем курсового (5 инъекций) внутривенного введения, и в этих условиях применения врачам приходится порой купировать чрезмерную пирогенную реакцию с помощью нестероидных противовоспалительных препаратов. Однако при однократном подкожном введении, которое рекомендовано в случае применения Беталейкина при радиационной аварии, реакции организма намного умереннее, что относится и к пирогенной реакции. Последняя вообще должна рассматриваться как важный компонент неспецифической реакции по мобилизации защитных сил организма (так называемого острофазового ответа), инициируемой Беталейкином. Поэтому полностью предотвращать эту реакцию при введении Беталейкина после аварийного облучения не рекомендуется. Но во избежание чрезмерной пирогенной реакции не следует и распространять условия применения Беталейкина в клинике (в частности, внутривенное введение) на его применение в качестве средства экстренной терапии [15, 16].

В качестве средства экстренной терапии при острых аварийных облучениях человека препарат на основе рекомбинантного интерлейкина-1β – Беталейкин является препаратом выбора. В настоящее время это единственный радиозащитный препарат, действие которого реально изучено у человека, как при химио- и радиотерапии у онкологических больных, так и в качестве иммуностимулятора. Беталейкин может быть использован в армии в качестве табельного индивидуального средства экстренной защиты от лучевого поражения, а также на объектах, связанных с использованием ядерной энергии. Использование Беталейкина при чрезвычайных ситуациях может привести к существенному увеличению числа людей, спасенных от гибели после воздействия ионизирующего излучения.

РАДИОЗАЩИТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ – ИНДУКТОРЫ СИНТЕЗА ЭНДОГЕННЫХ ЦИТОКИНОВ

В течение длительного времени в России и в мире разрабатывались различные радиозащитные препараты на основе компонентов бактерий, других микроорганизмов, водорослей, ДНК и т.п. [17]. Лишь в последние годы выяснилось, что механизм действия большинства подобных препаратов связан, главным образом, со стимуляцией клеток, относящихся к системе врожденного иммунитета через паттерн-распознающие рецепторы (ПРР), в основном мембранные Толл-подобные рецепторы (TLR). Такая активация врожденного иммунитета бактериальными производными приводит к интенсивному синтезу эндогенных цитокинов. Именно индукция продукции цитокинов служит важнейшим механизмом радиозащитного действия данной группы препаратов, так как позволяет им индуцировать синтез сразу нескольких эндогенных ростовых факторов, нужных для постлучевой регенерации тканей и восстановления нормальной жизнедеятельности организма в целом.

ПРР представляют собой группу различных по строению и происхождению молекул, обладающих способностью взаимодействовать с патогенами и их производными с целью их прямой нейтрализации либо для запуска каскада провоспалительных реакций. TLR являются молекулами, распознающими структуры патогенов и способными обеспечить активацию клеток после взаимодействия практически с любыми типами микроорганизмов, а также стать связующим звеном между распознаванием патогена и развитием воспаления. TLR конститутивно экспрессируются, главным образом, на клетках миеломоноцитарного ряда и различных популяциях лимфоцитов.

Общим свойством всех TLR является проведение активационного сигнала, указывающего на присутствие патогена и ведущего к активации защитных реакций. Уникальность структурно-функциональной организации TLR заключается в том, что, несмотря на гомологию внеклеточных доменов, особенности их строения позволяют распознать все типы патогенов. Второе не менее важное обстоятельство связано с наличием гомологичных внутриклеточных доменов у всех TLR и одинаковых адапторных молекул, обеспечивающих запуск сходных путей передачи активационного сигнала. Это означает, что разные патогены могут вызвать развитие универсального пути активации реакций врожденного иммунитета. При развитии воспалительного ответа TLR2 распознают пептидогликаны грам-положительных и липопротеины грам-отрицательных бактерий, TLR4 – ЛПС грам-отрицательных бактерий, TLR5 – флагеллин, TLR9 – бактериальную ДНК.

В цитоплазме клеток с TLR ассоциированы два типа адаптерных молекул: MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88) и TRIF (TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFNβ) [18]. Фосфорилирование MyD88 приводит к последовательной активации нескольких цитоплазматических киназ, транслокации в ядро транскрипционного фактора NF-κB и индукции экспрессии генов провоспалительных цитокинов и других факторов, обеспечивающих развитие воспалительной реакции. Описанный механизм инициации воспаления развивается не только при ответе на патогены, но и в ответ на воздействие целого ряда эндогенных молекул, называемых молекулами опасности, которые продуцируются клетками в ответ на повреждение, а также при формировании стерильного воспаления под воздействием физических и химических факторов без участия инфекционных агентов. При этом синтез цитокинов и формирование воспалительной реакции – универсальная основа тканевого ответа на внедрение патогенов и воздействие повреждающих факторов, включая ионизирующее излучение.

В ряду первых генов, экспрессирующихся под влиянием NFκB, стоят гены цитокинов семейства IL-1. Именно их экспрессия, активный синтез и секреция определяют ход дальнейших событий в развитии воспалительной реакции, активации каскада синтеза других цитокинов и медиаторов иммунитета, стимуляции функций антигенпредставляющих клеток и лимфоцитов, нужных для взаимодействия механизмов врожденного и приобретенного иммунитета, а также для вовлечения других органов и систем в организацию комплекса защитных реакций, включая активацию костномозгового кроветворения. Важнейшей функцией цитокинов является восстановление целостности поврежденных тканей. При воспалении синтезируются цитокины, стимулирующие защитные реакции против патогенов и одновременно индуцирующие процессы регенерации тканей, т.е. в патогенезе самой воспалительной реакции изначально заложены пути активации репаративных процессов [19].

В связи с этим радиозащитные свойства препаратов на основе бактериальных производных, видимо, во многом зависят от способности вызывать синтез эндогенных цитокинов, которые, в свою очередь, обеспечивают активацию костномозгового кроветворения и регенерацию тканей. Подобный механизм действия известен и для одного из последних активно разрабатываемых радиозащитных препаратов – флагеллина.

Флагеллин представляет собой структурный компонент жгутиков сальмонелл. Он взаимодействует с клеточным рецептором врожденного иммунитета TLR5 [20, 21], запуская каскад воспалительных реакций и синтез цитокинов, о чем было сказано выше. Лекарственные препараты на основе агонистов TLR привлекают внимание исследователей, поскольку активация TLR в эксперименте сопровождается мощным иммуностимулирующим действием, что может быть использовано не только для лечения инфекций, но и в борьбе с онкологическими, аллергическими и другими заболеваниями. Важно также, что агонисты TLR5 являются мощными адъювантами при системной и мукозальной вакцинации [22]. В США разработан препарат CBLB502 под торговой маркой “энтолимод”, представляющий собой генно-инженерный несколько видоизмененный вариант флагеллина (FliC) из Salmonella Dublin. В опытах на мышах и приматах при воздействии летальных доз ионизирующего излучения энтолимод оказался эффективным радиозащитным препаратом при использовании как до, так и после облучения при достаточно низком уровне токсичности [23, 24].

В Военно-медицинской академии были проведены исследования противолучевой эффективности отечественного варианта рекомбинантного флагеллина FliC Salmonella Typhimurium, полученного в Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов. Для исследований биологической активности были получены два генно-инженерных препарата на основе флагеллина: полноразмерный флагеллин и делетированный флагеллин, предложенный L. Burdelya et al. [23], где вариабельный и наиболее иммуногенный домен заменен на короткий гибкий мостик. Укороченная форма флагеллина, по данным авторов, обладает пониженной иммуногенностью, но при этом лучше растворима, менее склонна к агрегации и имеет более высокую активность.

Профилактическое применение препарата делетированного флагеллина в дозах 200 мкг/кг и 1 мг/кг за 30 мин до воздействия летальных доз рентгеновского излучения существенно повышало выживаемость облученных мышей и снижало степень и выраженность радиационно-индуцированного падения массы тела животных в период развития острой лучевой болезни. В модели эндогенного колониеобразования показано, что механизм радиозащитного действия флагеллина связан со стимуляцией гемопоэза [25–27].

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОМБИНИРОВАННЫХ РАДИОЗАЩИТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Теоретические предпосылки совместного использования разных радиозащитных средств для усиления суммарного эффекта активно обсуждаются. В последние годы считается перспективным подход, направленный на комплексное применение противолучевых средств, особенно обладающих разными механизмами действия, в расчете на получение синергетического эффекта. Предполагается, что комбинации препаратов могут способствовать более эффективному воздействию на разные звенья патогенеза лучевых повреждений и их репарации, в том числе и при использовании меньших доз исходных препаратов, что позволит снизить риск возникновения неблагоприятных эффектов [16, 28].

Рекомбинантные флагеллин и ИЛ-1, введенные одновременно в профилактических целях или последовательно (флагеллин до облучения, ИЛ-1 после облучения) оказывают выраженное протекторное действие на выживаемость мышей, подвергнутых воздействию летальных доз рентгеновского излучения, что может быть использовано при разработке новых эффективных хорошо переносимых человеком комбинированных средств защиты организма от лучевого воздействия [27].

Особый интерес в плане радиозащитных свойств представляют препараты, способные блокировать свободные формы кислорода, активно образующиеся при облучении организма и ответственные за постлучевое повреждение органов и тканей. Среди них в качестве радиопротекторов могут быть использованы различные антиоксиданты [29], в том числе ингибиторы NO-синтазы [30], фермент супероксиддисмутаза (СОД) [31–33].

СОД представляет собой металлофермент, относящийся к классу окислительно-восстановительных ферментов и присутствующий у всех высших эукариот. Этот фермент защищает клетки от интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода, являясь “перехватчиком” супероксидных радикалов (${\text{О }}_{2}^{{ \bullet - }}$). Супероксидные радикалы вызывают повреждение биологических структур (инициирование перекисного окисления липидов мембран, повреждение молекул ДНК, окисление сульфгидрильных групп белков, инактивация ферментов и т.д.). СОД является эндогенным акцептором свободных кислородных радикалов, избыточное накопление которых в клетке имеет значение в развитии целого ряда кислородзависимых патологических процессов. Препараты СОД оказывают противовоспалительное действие, обладают протекторным эффектом при ионизирующем излучении, являются антиоксидантами и антицитолитиками за счет торможения развития свободнорадикальных процессов в клетках. Кроме того, СОД предотвращает накопление нейтрофилов, которые секретируют значительные количества лизосомальных ферментов, разрушающих близлежащие ткани [34].

Теоретической предпосылкой сочетания в комбинированном препарате гемостимулирующего препарата ИЛ-1 и антиоксидантного фермента СОД послужил анализ механизмов их действия. В составе композиции ИЛ-1 должен обеспечивать активацию костномозгового кроветворения за счет усиления пролиферации и дифференцировки предшественников гемопоэза и стимуляцию метаболизма соединительной ткани и эпителия для ускорения заживления пораженных тканей. В свою очередь СОД нейтрализует избыточные свободные радикалы кислорода, являющиеся основным фактором, вызывающим повреждение тканей при воздействии облучения. Таким образом, предлагаемый комплексный радиозащитный препарат может сочетать в себе два основных свойства, нужных при постлучевом восстановлении: активацию кроветворения и блокирование свободных форм кислорода.

По-видимому, подобные комбинированные радиозащитные препараты имеют большие перспективы для существенного улучшения борьбы с последствиями воздействия на организм ионизирующего излучения.