Радиационная биология. Радиоэкология, 2019, T. 59, № 3, стр. 261-273

ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА

С восьмидесятых годов прошлого века наш коллектив уже занимается различными проявлениями эффектов, не подчиняющихся классическим представлениям радиобиологии – нестабильностью генома, адаптивным ответом, “эффектом свидетеля”. Удивительное совпадение в том, что, по сути, занимаясь “немишенными эффектами”, мы еще не знали из мировой литературы о существовании такого понятия. Первые твердые экспериментальные доказательства и описания “немишенных эффектов” – способности передачи изменений, повреждений от облученных клеток к необлученным (radiation-induced non-targeted effects) в научной литературе появятся намного позже. Работы нашей группы начались до Чернобыльской катастрофы (1986 г.) и получили развитие после нее, а именно, в прилегающих к атомной станции районах, где значительное количество людей в течение многих лет подвергалось воздействию радиации в малых дозах [1–9].

В зоне аварии на ЧАЭС работал, в составе радиоэкологической экспедиции РАН под руководством И.Н. Рябова, большой коллектив сотрудников, специализировавшихся в различных направлениях радиационной биологии. Одной из групп руководила И.И. Пелевина (в группу входили Г.Т. Афанасьев, А.А. Альферович, В.Я. Готлиб, А.А. Конрадов, А.С. Cаенко, Б.И. Сынзыныс, аспиранты, студенты). Работы проводились с 1986 по 1992 г. вплоть до распада СССР и прекращения доступа в Чернобыльскую зону, поэтому перечислять каждый раз всех авторов не имеет смысла – это коллективные, комплексные исследования.

К началу 1990-х гг. коллектив И.И. Пелевиной с сотрудниками показал, что после облучения мышей и культуры клеток HeLa в зоне аварии на ЧАЭС (в 2 км от реактора) повреждения ДНК определяются в течение длительного времени и отмечаются в потомках облученных клеток (И.И. Пелевина и соавт. [2–10]). Этот же эффект – длительного существования повреждений обнаруживался после экспозиции клеток в 10-километровой зоне аварии на ЧАЭС. Был выявлен еще один удивительный факт: после экспозиции мышей в зоне аварии на ЧАЭС, через год и более после окончания экспозиции и помещения мышей в виварий, в коре головного мозга животных отмечалось уменьшение количества эндотелиоцитов (впоследствии отражено в работах Н.В. Любимовой и соавт., 1990–2004 [11–15]).

В 10-километровой зоне аварии на ЧАЭС, близ пос. Янов (у границы “Рыжего леса”), отмечалось сочетание воздействия всех трех типов излучения, причем на достаточно близком расстоянии дозы могли варьировать в 2–3 раза, поэтому приводятся данные, относящиеся к конкретным участкам. По γ-компоненте мощность дозы составляла 101–108 мР/ч, а согласно измерениям индивидуальных дозиметров, находившихся под клетками с мышами и флаконами с культурой – 93–129 мР/ч. Таким образом, в среднем на экспозиционную площадку мощность дозы γ-излучения составляла 100–129 мР/ч (2.4 сГр/сут). В формирование дозы существенный вклад вносило β-излучение (40 000–50 000 β-частиц/см²). Были обнаружены α-частицы, 2–13 частиц/см² в разных точках площадки. [7]. Клетки с мышами и клеточными культурами (использовались мыши С57BL/6 и культура клеток HeLa) устанавливали под навесом непосредственно на чернобыльской траве, животные получали местный корм и воду, вдыхали разнесенные ветром частицы топлива АЭС с α- излучателями.

Исследовались различные аспекты биологического действия радиации в малых дозах, влияние γ-излучения на организм и клетки млекопитающих (мыши С57BL/6). Выбранные дозы облучения (приведены выше) и его мощность в зоне аварии в определенной мере соответствовали тем, которым подвергались некоторые группы “ликвидаторов”, и потому представляли сравнительный интерес [3, 7]. Большое число работ нами проведено по изучению защитного действия облучения в малых дозах (адаптивного ответа). Было показано, что в некоторых ситуациях воздействие радиации в малых дозах приводит к противоположному эффекту – повышению радиочувствительности. При экспозиции мышей, облученных в зоне ЧАЭС в низких дозах и последующем радиационном воздействии в высоких дозах через 1 год, также отмечалась их повышенная радиочувствительность [6].

В дальнейшем были исследованы клетки крови взрослых и детей, проживавших в зоне “Чернобыльского следа” (г. Новозыбков) в условиях повышенной радиоактивности. Показано, что в стимулированных лимфоцитах повышен уровень микроядер [10, 16, 17]. Отметив актуальность микроядерного теста для современного изучения радиационно-индуцированных изменений и “немишенных эффектов” у животных и человека и его значимость для настоящего обзора, скажем, что в Новозыбкове было проведено одно из первых наших исследований по влиянию длительного облучения в малых дозах на организм человека, в котором были определены явления, требовавшие дальнейшего изучения. Выявлены снижение способности к адаптивному ответу и повышение радиочувствительности у взрослого населения зоны чернобыльского загрязнения, а также значительное уменьшение частоты лиц с выявляемым адаптивным ответом среди детей Новозыбкова по сравнению с московскими сверстниками (всего в г. Новозыбков и г. Москва были обследованы 434 ребенка в возрасте от 3–13 лет) [10, 18].

Сделано заключение, что воздействие радиации в малых дозах на биологические объекты, находящиеся в зоне Чернобыльской аварии, приводит к индукции нестабильности генома, которая является одним из проявлений “немишенных эффектов” [17]. Эта нестабильность регистрировалась как по повышенному уровню клеток с микроядрами в далеких потомках облученных клеток, так и по повышенной радиочувствительности мышей, регистрируемой через длительное время после воздействия на них радиации [6–9]. Из большого числа данных, которые к настоящему времени (далеко не все) опубликованы, можно сделать вывод: с проявлениями “немишенных эффектов” необходимо считаться, особенно в экспериментальных и эпидемиологических исследованиях.

В течение последних двух десятилетий роль и механизмы “немишенных эффектов” начали широко обсуждаться в мировой науке. Многократно было описано, что к “немишенным эффектам” можно отнести целый ряд явлений. Так, нестабильность генома проявляется в течение длительного времени в потомках обученных клеток; адаптивный ответ (АО) – защитное действие к высоким дозам после воздействия в малых; гормезис (увеличение роста и темпов развития клеток и организмов, а также их потомков); трансгенерационные эффекты; многократно обсуждаемый bystander effect, в переводе эффект свидетеля (ЭС), который, как уже говорилось выше, заключается в передаче повреждений от облученных клеток необлученным при непосредственном контакте или благодаря секретируемым агентам разной природы [19–24].

По определению Моргана (W.F. Morgan, 2015 [21]), “немишенные эффекты” – каскад сигнальных процессов, обнаруживаемых в необлученных клетках, получивших сигналы от облученных, регистрируются не обязательно во всех типах клеток, зависят от времени анализа, дозы и типа излучения. Сигналы, получаемые от облученных клеток, можно считать определенным стрессом, который, по Селье (1979) [23], “…есть неспецифический ответ организма на любое предъявленное ему требование”. Можно полагать, что клетка переходит при этом в другое физиологическое состояние, при котором будут реагировать самые разные системы, “…клетка испытывает неспецифическую потребность осуществить приспособительные функции и тем самым восстановить нормальное состояние”. Эти сигналы можно считать “сигналами опасности”, приводящими в движение все системы клеток и способными изменить все функции клеток и ее реакцию на последующие события.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ

В ряде работ (И.С. Колесникова, И.Е. Воробцова, 2011 [25]; М.М. Антощина и др., 2017 [26]), в том числе с нашим участием, была показана своего рода идеальная модель дистанционно-индуцированного “эффекта свидетеля”, созданная путем совместной культивации in vitro лимфоцитов разнополых доноров. Показателями наличия изменений в первом и другом случаях стало увеличение числа лимфоцитов с хромосомными аберрациями. Морфологические отличия лимфоцитов мужчин и женщин позволяют распознавать клетки облученных и здоровых доноров. И.Е. Воробцовой и И.С. Колесниковой [25] было выявлено, что необлученным клеткам здоровых людей в среде, имитирующей естественную, передаются радиационно-индуцированные изменения клеток противоположного пола, предварительно облученных в адаптирующей дозе.

М.М. Антощиной и др. [26] было показано, что принцип дистанционной передачи изменений от наблюдаемых in vitro облученных клеток человека к необлученным клеткам действует не только применительно к радиации, но и в отношении генотоксического воздействия опухолей. Была проведена совместная культивация лимфоцитов больных раком предстательной железы (РПЖ) мужчин и здоровых женщин. Клетки при этом были связаны посредством искусственной среды, которой послужила смесь, приготовленная из плазмы крови больных и здоровых доноров (1 : 1) с питательным раствором. Увеличение числа микроядер и хромосомных аберраций в лимфоцитах здоровых женщин свидетельствовали о том, что клетки опухоли оказывают существенное генотоксическое действие на нормальные лимфоциты периферической крови, что, по-видимому, обусловлено механизмом, подобным радиационно-индуцированному “эффекту свидетеля”.

Те же принципы взаимодействия облученных и необлученных клеток будут рассмотрены в данной работе in vivo в организме человека. Достаточно сложно выявить ситуации, при которых радиационное воздействие на организм человека осуществлялось бы в высоких дозах при локальном влиянии. Однако удалось определить и исследовать достаточно показательный случай, с определенными оговорками демонстрирующий проявления “немишенных эффектов”, формируемых по преимущественно дистанционному типу: современный метод радиотерапии – брахитерапия. Адаптивный ответ был показан на многих объектах, а вот сравнительный анализ адаптивной способности лимфоцитов у людей, подвергшихся преимущественно внешнему γ- и внутреннему β-излучению, проводился впервые и представляет определенный научный интерес. Именно анализ данных из области практики брахитерапии и хронического облучения жителей Челябинской области был использован в данном исследовании для изучения и демонстрации принципов действия “эффекта свидетеля” и “адаптивного ответа” in vivo в клетках человека. Механизмы этих процессов обсуждаются в зарубежных и отечественных работах и коротко отражены в соответствующих разделах настоящей статьи.

РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫЙ “ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ”

Радиационно-индуцируемый “эффект свидетеля” (ЭС) может быть вызван разными типами излучений: α, β, γ, рентгеновским, УФ. ЭС может быть индуцирован не только радиационным воздействием, но и химическими соединениями, гипертермией (тепловой шок) и другими агентами, вызывающими стресс. Взаимодействие облученных клеток (клеток-мишеней) с необлученными происходит двумя путями: а) при контакте с облученными или б) при воздействии среды от ранее облученных [27, 28].

Облученные клетки при кокультивировании с необлученными передают сигналы, вызывая образование микроядер (МЯ) и повышение оксидативного статуса в течение 5–6 ч. Но для передачи сигналов они должны осуществлять взаимодействия gap’ов. Далекое потомство клеток свидетелей (ЭС) также обладают теми же изменениями. Взаимодействие gap’ов происходит при посредстве белка коннексин 26 (Cx26) или Сx43, в то время как при помощи Сx32 происходит защитный эффект. Предполагается, что ЭС-клетки, первоначально получившие сигнал от клеток, экспрессировавших коннексины 26(Cx26) или Сx43 погибают, а выживают только клетки, экспрессировавшие Сx32, содержащие повреждения ДНК в течение нескольких пассажей [29].

При этом среда от облученных клеток содержит экзосомы, липиды, mРНК, микроРНК и др. В необлученных клетках определяются повреждения ДНК, потеря выживаемости, репродуктивная гибель, происходит мобилизация внутриклеточного кальция, потеря потенциала митохондриальной мембраны, повышается уровень оксидативного стресса, индуцируются двунитиевые разрывы ДНК (образование фокусов γ-Н2АХ), метилирование, апоптоз. Дальнейшее изучение ЭС предполагает, что свободно-радикальные продукты, белки репарации, цитокины, внеклеточная ДНК (вк ДНК), микроРНК, мембранные молекулы – основные факторы, выделяемые из облученных клеток, переносятся в необлученные при непосредственной коммуникации через gap’ы и рецепторы, или через циркулирующую систему сред.

По-видимому, ЭС сопряжен с молекулами типа аминокислот, серотонина, L-DOPA, глицина, никотина, цитохрома, ионами кальция. Все эти факторы приводят к образованию микроядер, СХО, разрывов ДНК, окислению ДНК, апоптозу, активации генов, мутациям, злокачественной трансформации, изменению экспрессии белков, длительной гибели. Несомненно, большая роль отводится свободно-радикальным продуктам (ROS). Образование митохондриальных ROS является основным триггером для инициации апоптоза. Активируется каспаза 9, затем каскад протеолитических ферментов, разрушение митохондриальной мембраны и фагоцитоз клетки. Генерация ROS зависит от специфической формы CYP, вступления вторичного электрона в Р450-цикл, наличия и природы субстрата. ROS, метаболические белки СОХ2, разные пути сигналинга, включая NFkB-1, TNF-α, COX2, – это другой стресс путь сигналов через Nrf2 [30].

Повреждение ДНК индуцирует активацию генов АТМ – ТP53; АТМ приводит к активации NF-кB сигналинга, за которым следует NFkB – зависимая экспрессия генов, включая IL-8, TNf-α, COX2, iNOS, а также образование простагландинов E (PGE), ROS и NO. Взаимодействия с использованием цитокина и фактора роста стимулируют ЭС в клетках с соответствующими рецепторами путем паракринного механизма, что приводит к индукции клеточного сигнала. Важная группа белков, называемых “коннексины”, формирует взаимодействие gap’ов. Следует отметить, что только клетки, содержащие протеинкиназы и АТМ, генерируют сигналы для индукции ЭС; это же относится к белку р53. Также необходимы для индукции сигнала интерлейкины (6.8), а также лиганды TGF-β1 , TNF-α, лиганд апоптоза TRAIL и Fas.

Одной из наиболее актуальных в настоящее время проблем является обсуждение роли ROS. Радиация является триггером изменений в мРHK и индуцирует повышенное образование ROS [31], из чего можно сделать вывод о том, что повреждения, вызываемые облучением в малых дозах, являются результатом, в основном, действия ROS. Большое значение в проявлении ЭС имеет концентрация ROS. Они образуются в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. Повышение содержания ROS в облученных клетках может являться индуцирующим сигналом для ЭС-клеток, возникают повреждения ДНК, отмечается “выход” интерлекина-6. Сигналинг осуществляется путем TgF-β и NO [32]. Свободная от клеток ДНК (СС ДНК) в среде и сыворотке (in vivo) может вызывать образование ROS в ЭС клетках, а затем полимеризацию, транспозицию гомологичных локусов в ядре, образование актиновых стресс-волокон, активацию экспрессии рибосомальных генов. Радиация изменяет экспрессию некоторых микроРНК в облученных клетках и клетках ЭС, но, по-видимому, они не являются первичными молекулами, вызывающими ЭС.

Ранее нами было показано, что у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, подвергшихся воздействию радиации в малых и средних дозах, повышены уровни токсичных продуктов ROS – липоперекисей и ряда альдегидов (например, малонового), образующихся по свободно-радикальному механизму [33]. При этом облученные женщины-ликвидаторы через ряд лет имели потомство с повышенными уровнями ROS и сниженными уровнями незаменимых биоантиоксидантов (ВАО, витамины Е и А), кореллирующими с радионагрузками матерей [34]. У детей, родившихся от матерей в отдаленный период после их облучения, наряду с радиогенным ROS-стрессом и дефицитом ВАО, выявлены нарушения хромосом лимфоцитов периферической крови, свидетельствующие о соматическом гипермутагенезе [35].

Некоторые клетки не способны генерировать ЭС; может наблюдаться отсутствие gap-взаимодействия, насыщение рецепторов сигналами, имеет значение статус теломераз, генетическая конституция, окружающие условия, тип агента и клеток, величина дозы, выбор критериев, выбранное время наблюдения [36]. Эффект свидетеля индуцируется факторами, выделяемыми из клеток, подвергшихся воздействию агентов, вызывающих стресс. Реакция на эти агенты может носить повреждающий и благоприятный характер [36]. Дело в том, что необлученные клетки, т.е. “клетки-свидетели”, могут также выделять соединения, которые влияют на клетки-мишени, индуцируя защитный эффект.

Данные о радиационно-индуцированном “эффекте свидетеля” in vivo были показаны в совместных наших исследованиях с сотрудниками МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал НМИЦ радиологии Минздрава России применительно к клинической практике использования брахитерапии. Изучался пример формирования дистанционно-индуцированного “эффекта свидетеля” в организме человека, который связан с современным типом лечения РПЖ – брахитерапии, заключающийся в том, что в ткани предстательной железы имплантируются многочисленные иcточники, подводящие к пораженному органу очень высокую для организма, до 140 Гр и выше по суммарной лучевой нагрузке, дозу облучения. Основными видами брахитерапии при раке предстательной железы являются низкомощностная и высокомощностная. При низкомощностной выполняется имплантация на постоянной основе микроисточников низкой мощности дозы, содержащих изотопы ¹²⁵I, ¹⁰³Pd, ¹³¹Cs. Высокомощностная брахитерапия представляет собой технику лечения, при которой облучение опухоли происходит за счет временного контакта с тканью предстательной железы источников высокой мощности дозы от 12 Гр/ч и выше, содержащих изотопы ¹⁹² Ir, ⁶⁰Co,¹³⁷Cs. При обоих способах происходит только местное облучение опухоли, именно этот принцип лежит в основе метода лечения, предполагающего, что другие ткани и органы затронуты лучевыми событиями не будут [37]. Изменения в организме больного регистрируются при этом по уровню ПСА, являющемуся главным показателем эффективности лечения.

Практика данного типа лечения в России начиналась с низкомощностной брахитерапии. С 2000 по 2016 г. силами трех филиалов “НМИЦ радиологии” было выполнено 1187 имплантаций микроисточников ¹²⁵I как под УЗ-контролем, так и под контролем спиральной компьютерной томографии (СКТ). Возраст пациентов, которым была проведена низкомощностная брахитерапия, составлял от 47 до 77 лет, в среднем – 60.5 лет. Сумма баллов по Глисону варьировала от 6 до 8. Среднее значение уровня ПСА до лечения составило 8.3 нг/мл. Объем предстательной железы перед имплантацией зарегистрирован в пределах от 13.0 см³ до 91.4 см³, в среднем 35.8 см³. Пациенты с благоприятным прогнозом по D’Amico составили 67.9% (806 больных). Пациенты промежуточной группы риска составили 23.2% (275 больных). Доля больных с неблагоприятным прогнозом заболевания составила 8.9% (106 больных). При проведении брахитерапии использовали микроисточники ¹²⁵I с активностями от 0.2 до 0.65 мКи.

Общая безрецидивная выживаемость, по данным ПСА, на срок наблюдения 60 мес. составила 96%. При этом в группе благоприятного прогноза больные без рецидива по ПСА составили 98.5%, в группе промежуточного прогноза – 90% и доля пациентов в группе с неблагоприятным прогнозом без признаков рецидива на срок наблюдения 5 лет составила 98.1%. Следует отметить, что больные в группах с промежуточным и неблагоприятным прогнозами получали гормональное лечение в адъювантном режиме на срок от 6 до 24 мес. Из осложнений, имеющих отношение к теме данного исследования, следует отметить постлучевой уретрит 3-й степени (RTOG) зарегистрирован у четырех пациентов (0.34%). У трех больных (0.25%) выявлена стриктура уретры. Явления лучевого ректита 2-й степени (RTOG) отмечены в 0.1% случаев (1 пациент), 3-й степени – также у одного больного (0.1%) [37].

Высокомощностная брахитерапия применяется в России с 2016 г. В МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России – проводилось лечение больных локализованным и местнораспространенным раком предстательной железы с использованием высокомощностной брахитерапии (¹⁹²Ir) в моно- и сочетанном с дистанционной лучевой терапией режимах. На данный момент максимальный срок наблюдения за больными, которым выполнялась высокомощностная брахитерапия, составляет 31 мес. У всех пациентов низкого уровня онкологического риска, в монорежиме, отмечено снижение уровня ПСА, в среднем ниже 1.2 нг/мл. Большинство пациентов с умеренным и высоким уровнями онкологического риска в настоящее время завершили курс 3-D конформной ДЛТ в комбинации с гормональной терапией. Уровень ПСА в данной группе наблюдения составляет в среднем ниже 1.0 нг/мл. Из клинически значимых осложнений, отмеченных при проведении лечения 325 больных РПЖ, следует отметить дизурические явления выше 2-й степени тяжести (RTOG), которые зарегистрированы в 1.0% случаев. Реакции со стороны прямой кишки отмечены среди пациентов, получающих сочетанное лучевое лечение, и не превысили токсичности 1-й степени тяжести (RTOG) [38].

Воздействие на опухоль ионизирующей радиации в клинических дозах вызывает повреждения ДНК, ведущие к активации гена АТМ и белков репарации, вслед за чем происходит изменение путей сигналинга, ответственного за выживаемость клеток и апоптоз. Радиация вызывает активацию семейства ERBB и других тирозинкиназ, ведущую к активации ROS и многочисленным защитным путям сигналинга (например, AKT и ERK1/2), которые меняют функции факторов транскрипции и апоптотический порог клеток. Начальная радиоиндуцированная активация ERK1/2 может стимулировать расщепление и выход паракринных лигандов, что вызывает отсроченную реакцию межклеточного сигналинга в облученных и в необлученных клетках-свидетелях [39].

Таким образом, сигналы на клеточном уровне могут способствовать активации мембранных рецепторов, которые дают обратный сигнал в цитоплазму. Цитозольный сигналинг может также вызвать выход мембранных паракринных факторов, при котором паракринные исходящие сигналы меняются на входящие, направленные внутрь клетки. Конечным следствием этих сигнальных событий после многочисленных экспозиций может быть репрограммирование облученных и необлученных затронутых клеток в аспекте выживаемости, приводящее к изменению скорости митогенетических процессов, при которых генотоксический стресс вызывает гибель клеток. Ингибирование в одном или нескольких путях сигналинга, ответственного за выживаемость клеток, приводит к повышению радиочувствительности [39].

Одним из проявлений дистанционно-индуцированного “эффекта свидетеля” в данном случае можно считать появление у больных абскопальных (от англ. слова abscopal – “не в месте облучения”) эффектов, т.е. радиационно-индуцированных изменений в тех органах и тканях, которые не подвергались облучению. Ими затрагиваются, прежде всего, близлежащие органы и ткани, но изменения, исходя из теории “немишенных эффектов”, могут быть выявлены в клетках любых отдаленно расположенных органов. В недавние годы за рубежом проводился ряд исследований, выявивших особенности формирования изменений в необлученных органах и тканях млекопитающих при локальном радиационном воздействии на клетки их организма. Так, при облучении головного мозга, сердца, тазовой области крыс и мышей радиационно-индуцированные изменения обнаруживаются в образцах легких животных [40, 41]. Подобные явления встречались и в нашей практике изучения радиационно-индуцированных “эффектов свидетеля” у человека. Как показали новые исследования, моделирующие радиотерапию и проведенные на млекопитающих, перспективы поиска методов сокращения числа и степени тяжести побочных эффектов локального радиационного воздействия в медицинских целях связаны именно с изучением возникающих изменений как проявлений радиационно-индуцированного “эффекта свидетеля”, в том числе формируемого по дистанционному типу [42–44].

В случае с новой практикой терапии ¹⁹²Ir, в нашем исследовании имеются некоторые данные, показывающие изменения в лимфоцитах периферической крови больных, которые приводятся в табл. 1. Как следует из таблицы, у больных возрастает число аберраций хромосомного типа и нет возрастания частоты аберраций хроматидного типа (табл. 1).

Применительно к проведенному исследованию лимфоциты периферической крови также выступают в роли маркеров, биологических детекторов реакции организма на радиационное воздействие. Возможное наличие лимфоцитов с аберрациями у больных РПЖ до лечения следует связывать с генотоксическим воздействием опухоли. Возрастание числа аберраций хромосомного типа говорит о наличии радиационно-индуцированных изменений в организме человека, формируемых по принципу “эффекта свидетеля”. Конечно, следует учесть, что лимфоциты протекают через предстательную железу, соприкасаясь с поврежденными клетками. Имеет место два типа “эффекта свидетеля”. Один – при контакте с поврежденными клетками, второй – на расстоянии и через среду. Исследование показывает важность учета “немишенных эффектов” для оценки эффективности, возможных побочных эффектов и долгосрочных результатов применения брахитерапии.

РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫЙ АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ

Радиационно-индуцированный адаптивный ответ (АО) заключается в уменьшении радиочувствительности клеток и организмов в целом после воздействия вначале малой дозой радиации, а затем – повреждающей дозой. Механизмы феномена характеризуются множественностью и отличны от способов формирования “эффекта свидетеля”. Удивительной и трудно объяснимой чертой является свойство изменчивости механизмов: “Даже для одного биологического объекта существует большое число возможностей и путей формирования АО, причем невозможно предсказать, какой путь будет реализован в условиях конкретного эксперимента” [45, 46]. О сложности явления говорит и тот факт, что нередко вместо АО наблюдается обратный эффект – повышение радиочувствительности.

В радиационной биологии не одно десятилетие ведутся споры и обсуждения относительно возможности признания главенствующей роли того или иного процесса в формировании адаптивного ответа. Трудно высказать мнение о том, есть ли единый механизм формирования АО. Скорее можно полагать, что существует множество механизмов, которые зависят от дозы облучения, типа облучения, облучаемого объекта и т.д. В разное время предлагались и стимуляция репарации при воздействии в малых дозах, и активация антиоксидантной защиты, ликвидация повреждений до репарации и другие гипотезы, однако не все они подтверждаются на молекулярном уровне. К настоящему времени опубликованы бесчисленные работы, посвященные механизмам формирования АО, однако большинство авторов отмечают, что в целом эти механизмы остаются неизвестными, несмотря на выяснение многих аспектов. АО показан на множестве биологических объектов, но предметом значительной части исследований в области изучения механизмов АО у человека стали лимфоциты периферической крови, которые можно считать моделью многих значимых процессов в организме.

Сложную совокупность механизмов адаптивного ответа можно было бы объяснить, приняв во внимание упоминавшуюся теорию, согласно которой главной особенностью действия радиации в малых дозах, как и других повреждающих химических и физических воздействий, является генерация “сигнала опасности”, переводящего клетку в иное физиологическое состояние. В этом состоянии клетка мобилизует все защитные механизмы и способы поддержания гомеостаза, что и приводит к формированию повышенной ее устойчивости к последующим радиационным воздействиям. Такое “иное” состояние клетки авторы гипотезы именуют также “стрессом”, что можно принять все же скорее как образное сравнение, так как аналогии с состоянием стресса на уровне организма, в котором непременно участвуют гормональные реакции, оно не имеет.

На материалах последних исследований, проведенных нашей группой в 2018 г., осуществлен сравнительный анализ адаптивной способности лимфоцитов крови у людей, подвергшихся преимущественно внешнему γ- и внутреннему β-излучению в зоне радиационного загрязнения Челябинской области. Первую группу исследуемых составили 33 жителя прибрежных сел р. Теча, расположенных в верховьях реки, у которых преобладающий вклад вносило внешнее γ-излучение. В группу сравнения вошли лица, проживавшие на незагрязненных территориях Челябинской области в близких социально-экономических условиях и имеющих одинаковый характер медицинского обслуживания. Средний возраст обследованных лиц в группе составил 69.1 года (63–76). Группу людей с преимущественным воздействием внутреннего β-излучения (изучаемая группа № 2), составили 28 человек, проживавших в прибрежных селах среднего течения р. Теча, в возрасте 51–87 лет (в среднем 64.0 года).

Изучалось влияние двух видов излучений (γ и β), обладающих близкой относительной биологической эффективностью в отношении индукции АО в лимфоцитах периферической крови человека (ЛПКЧ) в режиме хронического воздействия. В данной работе проводилось исследование частоты лимфоцитов периферической крови с микроядрами у жителей, которые были облучены вследствие проживания на берегах р. Теча. Р. Теча была загрязнена жидкими радиоактивными отходами Производственного объединения “Маяк” (ПО “Маяк”).

Наибольшие значения мощностей доз γ-излучения отмечались в период массированных сбросов 1950–1951 гг. и достигали в августе 1951 г. от 50 000 мкР/с (180 Р/ч) у места сброса до 1500 мкР/с на берегу Метлинского пруда и до 100 мкР/с на берегу Течи вблизи населенного пункта Теча-Брод (18 км от места сброса) [47].

Население прибрежных сел р. Теча подверглось внешнему и внутреннему облучению. Доза внешнего облучения сформировалась за счет γ-излучающих радионуклидов (главным образом, ¹³⁷Cs, ⁸⁵Zr, ⁸⁵Nb, ^103,106Ru). Основными источниками внешнего воздействия γ-излучения являлись донные отложения и пойменные почвы, а также некоторые участки территории населенных пунктов, загрязненные в результате хозяйственной деятельности (полив огородов, перенос радионуклидов с экскрементами сельскохозяйственных животных и т.п.).

Основными источниками внутреннего облучения населения в первые годы отмечены ⁹⁰Sr, ⁸⁹Sr, ¹³⁷Cs и другие изотопы, поступившие в организм с речной водой и продуктами местного производства (молоко, рыба, овощи с поливных огородов и т.п.). Основным дозообразующим радионуклидом после проведения защитных мероприятий являлся ⁹⁰Sr из-за его способности накапливаться и длительное время удерживаться в костной ткани. Для оценки дозовых нагрузок от инкорпорированных радионуклидов использовали данные по индивидуальному содержанию ⁹⁰Sr, измеренному на специализированном спектрометре излучений человека (СИЧ-9.1), и специально разработанную дозиметрическую модель, пригодную для любого ритма поступления стронция в организм [47, 48].

Для оценки влияния ионизирующего излучения на индукцию лимфоцитов с микроядрами использовалась доза облучения красного костного мозга (ККМ), которая в значительной степени сформировалась или за счет инкорпорированного в костную ткань ⁹⁰Sr, или за счет ¹³⁷Cs и внешнего γ-излучения. Для всех обследованных людей, включенных в исследование, были учтены индивидуальные дозы облучения на красный костный мозг. Дозы были рассчитаны на основе дозиметрической системы TRDS 2009.

Средняя накопленная доза на красный костный мозг у людей первой группы составила 1.23 Гр, при этом диапазон доз составил от 0.08 Гр до 2.6 Гр. Большая часть облученных людей (54%) подвергалась радиационному воздействию на ККМ в дозовом диапазоне от 0.6 до 1.49 Гр. У 13% обследованных людей доза на ККМ была ниже 0.59 Гр и у 13% – выше 2 Гр. Индивидуальные оценки доз облучения ККМ у обследуемых лиц второй группы составили 0.02–2.05 Гр (в среднем 1.15 Гр).

Использовали микроядерный тест с цитокинетическим блоком с помощью цитохалазина В, стандартные методы облучения и анализа проб. Препараты анализировали с помощью световой микроскопии; подсчет клеток проводили с использованием протокола анализа лимфоцитов с микроядрами разработанного “International Collaborative Project on Micronucleus Frequency in Human Populations (HUMN)”. Статистический анализ осуществляли в программных пакетах SPSS Statistic 17.0, Excel 2010.

Адаптивный ответ лимфоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся радиационному воздействию, был исследован ранее. В работе А.В. Аклеев и др., 2004 [49] было обнаружено статистически значимое снижение числа облученных лиц с адаптивным ответом в лимфоцитах периферической крови по сравнению с контрольной группой. Настоящее исследование позволило оценить влияние внешнего γ-излучения и внутреннего β-излучения на индукцию АО.

В первой группе жителей прибрежных сел р. Теча средний спонтанный уровень частоты лимфоцитов с микроядрами составил 14.2 ± 8.2‰ при диапазоне индивидуальных значений 2–38‰. Далее нами было проведено сравнение частоты лимфоцитов периферической крови с микроядрами после дополнительного острого γ-облучения в дозе 1 Гр и после облучения в адаптирующей дозе (0.05 Гр) и последующего облучения в повреждающей дозе (1 Гр) в сравниваемых группах облученных людей. После дополнительного облучения in vitro в дозе 1 Гр произошло 9–13-кратное увеличение частоты ЛПК с МЯ в группах облученных лиц по сравнению со спонтанным уровнем. Частоты лимфоцитов с МЯ после радиационного воздействия in vitro в дозе 1 Гр составили 122.1 ± 39.4‰ (58–216‰) и 130.0 ± 41.0‰ (40–250‰) в первой и во второй группах облученных людей соответственно. Таким образом, различий в радиочувствительности лимфоцитов между группами людей, подвергшихся воздействию преимущественно внешнего γ-излучения и внутреннего β-излучения, отмечено не было.

Не выявлено и изменений радиочувствительности лимфоцитов ПК, предварительно облученных в адаптирующей дозе 0.05 Гр. После двукратного облучения (0.05 + 1.0 Гр) средняя частота лимфоцитов с микроядрами во всех исследуемых группах осталась на таком же уровне, как и при однократном облучении в дозе 1 Гр (р > 0.05). Средняя частота лимфоцитов с микроядрами в исследуемых группах также не различалась. В сравниваемых группах наблюдался большой разброс значений спонтанной и индуцированной частоты лимфоцитов с МЯ. Поэтому был проведен анализ группы людей, у которых значения выходят за пределы референтных величин по частоте клеток с микроядрами.

В результате этого сравнения было обнаружено, что в первой группе несколько чаще отмечалось превышение референтного значения по спонтанному уровню клеток с МЯ по сравнению со второй группой. В то же время количество облученных людей с частотой ЛПК с МЯ, превышающей референтное значение после дополнительного облучения в дозе 1 Гр, не отличалось в сравниваемых группах.

Корреляционный анализ зависимости спонтанной частоты клеток с микроядрами и частоты клеток с МЯ после дополнительного облучения (табл. 2) показал наличие статистически значимой корреляционной связи для первой изучаемой группы облученных людей.

В первой группе облученных у 12% индивидуумов наблюдалась способность к адаптивному ответу, а у 18% индивидуумов – повышение радиочувствительности, что не отличается от второй группы облученных (табл. 3).

Эти данные подтверждают факт, что адаптивный ответ, индуцируемый при малых дозах облучения, наряду с феноменом повышения радиочувствительности, является разновидностью общебиологического явления индивидуальной стресс-реакции клетки, вызванной воздействием радиации.

В нашем исследовании сопоставление спонтанного уровня ЛПК с МЯ между мужчинами и женщинами внутри каждой из обследуемых групп статистически значимых различий не выявило. При сравнении исходного уровня ЛПК с МЯ в сравниваемых группах, сформированных с учетом половой принадлежности, статистически значимых различий также найдено не было, т.е. половая принадлежность испытуемых не влияла на характер и уровень различий. При этом дополнительное облучение в дозе 1 Гр приводило к статистически значимому понижению частоты ЛПК с МЯ относительно контрольной группы как у мужчин (р = 0.04), так и у женщин (р = 0.01).

При сравнении групп была обнаружена лишь тенденция к слабой отрицательной корреляции частоты микроядер в лимфоцитах после in vitro облучения в дозе 1 Гр с возрастом обследуемых. Таким образом, в нашем исследовании не было отмечено увеличения спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами с увеличением возраста. Результаты многочисленных подобных исследований остаются противоречивыми. Так, одни исследования выявили, что частота клеток с МЯ с возрастом увеличивается (C. Bolognesi et al., 1999; C. Bolognesi et al.,1997; H. Nefic et al., 2013) [50]. Другие авторы (S. Bonassi et al., 1999; M. Fenech et al., 2001) [51] не показывают четкой зависимости между частотой микроядер и возрастом обследуемых лиц. Статистически значимая отрицательная корреляционная связь частоты лимфоцитов с МЯ после облучения в дозе 1 Гр с возрастом облученных людей была обнаружена только в первой группе (r = –0.4; р = 0.03).

Дальнейший анализ показал, что зависимость от пола, этнической принадлежности, употребления алкоголя отсутствует.

Таким образом, результаты исследования не дали доказательств, что пролонгированное воздействие внешнего γ- и внутреннего β-излучения способно по-разному индуцировать АО в условиях хронического радиационного воздействия. В отдаленные сроки после начала хронического радиационного воздействия АО у жителей прибрежных сел р. Теча индуцируется не чаще, чем повышение радиочувствительности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа сочетает цели научного обзора и лабораторных исследований, посвященных роли “немишенных эффектов” в реакции клеток и организмов на радиационное воздействие. В последние годы обсуждаются наименее изученные с точки зрения механизмов и проявлений дистанционно-индуцируемые “немишенные эффекты”, к которым и относится новый цикл наших исследований. В дальнейшем предполагается получить ответ на малоизученные проявления “немишенных эффектов” на уровне организмов разного типа, относящихся к беспозвоночным (ракообразные) и позвоночным (рыбы, млекопитающие). Комплексное исследование “дистанционно-индуцируемого эффекта свидетеля” на перечисленных животных и человеке будет проведено впервые.

Относительно животных дистанционно-индуцируемые изменения будут рассмотрены на уровне популяции, предполагается получить данные о передаче радиационно-индуцированных изменений между организмами. Применительно к Homo Sapiens речь идет об исследовании других проявлений “дистанционно-индуцируемого эффекта свидетеля”, а именно явления, известного в медицине как “абскопальный эффект” (лучевые изменения в одних органах и тканях при радиационном воздействии на другие), изменения в лимфоцитах периферической крови больных при локальном воздействии.

Нами были изучены следующие явления:

1. Радиационно-индуцированные изменения в одних необлученных органах и тканях при радиотерапевтическом воздействии на другие, в частности, при брахитерапии онкологических заболеваний. Приведены данные о радиационно-индуцированных изменениях в лимфоцитах больных, регистрируемых по хромосомным аберрациям, и абскопальных эффектах при локальном воздействии на РПЖ. Было показано, что подобные изменения формируются по принципу радиационного “эффекта свидетеля”.

2. Впервые проведен сравнительный анализ адаптивной способности лимфоцитов крови у людей, подвергшихся преимущественно внешнему γ- и внутреннему β-излучению. Исследование не выявило различий в адаптивной способности лимфоцитов крови у людей двух групп.

Разумеется, план настоящего проекта, являясь обзором достаточно широкого числа проявлений “немишенных эффектов”, не претендует на проведение всестороннего исследования по каждому из упомянутых “немишенных эффектов” с использованием данных о человеке. Полученные результаты позволяют сделать выводы относительно важной роли дистанционно-индуцированных “немишенных эффектов” в реакции клеток человека на облучение. Изучение данных явлений необходимо для определения радиационных рисков, долгосрочных последствий техногенных катастроф, медицинской практики.

Таким образом, в течение последних десятилетий были открыты эффекты, которые противоречат теории мишеней. “Немишенные эффекты” показали, что повреждения ДНК, которые ранее всегда считались в основном летальными, на самом деле передают часть изменений другой, необлученной части популяции клеток. Этот феномен представляется очень важным, так как в корне изменяет представления о дозовой зависимости повреждающего действия радиации на живые объекты, о реакции всей популяции (от клеток до человека) и во многом требует пересмотра нашего отношения к облучаемой или подвергнутой “немишенным эффектам” популяции.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта РФФИ 16-04-00963/18. Часть работы выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России (Тема 0082-2014-0001, № АААА-А17-117040610310-6), за счет субсидии, выделенной ИХФ РАН на выполнение государственного задания, тема 0082-2014-0001 “Изучение принципов структурно-функциональной организации биомолекулярных систем, разработка методов дизайна их физико-химических аналогов и создание на этой основе биологически активных препаратов нового поколения”, № АААА-А17-117040610310-6.