Радиационная биология. Радиоэкология, 2019, T. 59, № 4, стр. 388-393

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Исследование проведено на самках мышей (CBA×C57Bl/6)F1, массой 18–23 г, полученных из питомника Научный центр биомедицинских технологий ФМБА, филиал “Андреевка”. При проведении экспериментальных процедур соблюдали соответствующие правила международных норм работы с животными [3]. Мышей содержали в поликарбонатных клетках на стандартном рационе вивария при свободном доступе к воде и пище. Подбор животных в группы осуществляли методом “случайных чисел”, используя в качестве критерия массу тела. Индивидуальное значение массы тела не отклонялось от среднего значения в группе более чем на 10%. В опытных группах было по 11 мышей, в группе биоконтроля – девять мышей, в группе, подвергшейся воздействию рентгеновского излучения в дозе 1.5 Гр – 5 мышей.

Животных облучали на установке РУСТ-М1 при напряжении 200 кВ, токе на трубке 2.5 мА, с использованием фильтра алюминиевого 1.5 мм. Мощность дозы рентгеновского излучения (R-излучения) составила 1.1 Гр/мин. Три примененные дозы составили 0.5, 1.0 и 1.5 Гр. Эвтаназию проводили методом цервикальной дислокации через 24 ч после воздействия ионизирующей радиации одновременно с контрольной группой.

В качестве противолучевых препаратов использовали беталейкин, индралин и рибоксин. Стандартный фармакопейный препарат “Беталейкин” (производство «ФГУП ГНИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА, Россия) представляет собой лиофилизированный рекомбинантный интерлейкин-1β человека с добавлением в качестве стабилизатора человеческого сывороточного альбумина, расфасован в ампулы. Препарат разводили в 0.9%-ном растворе хлорида натрия и вводили мышам однократно за 2 ч до облучения в таком количестве, чтобы доза составила 50 мкг/кг. Индралин (препарат Б-190, производство НПЦ “Фармзащита”, Россия) по рекомендации разработчика разводили в количестве 20 мг в 2 мл 0.43%-ного раствора винной кислоты и вводили мышам массой 20 г по 0.2 мл за 10 мин до облучения, при этом доза составила 100 мг/кг. Рибоксин (производство ОАО “Борисовский завод медицинских препаратов”, Республика Беларусь), 2%-ный раствор в ампулах разводили 0.9%-ным раствором хлорида натрия и вводили мышам за 30 мин до облучения в таком количестве, чтобы доза составила 300 мг/кг. Контрольным животным вводили 0.9%-ный раствор хлорида натрия. Все препараты вводили внутрибрюшинно.

Цитогенетический эффект оценивали микроядерным методом в полихроматофильных эритроцитах (МЯ-ПХЭ) костного мозга мышей. Через сутки после окончания воздействия животных подвергали цервикальной дислокации и выделяли бедренные кости. Препараты готовили по общепринятой методике [4, 5]. В костном мозге учитывали частоту ПХЭ с микроядрами при подсчете 1000 ПХЭ от каждого животного и долю ПХЭ к общему числу ПХЭ и нормохромных эритроцитов при анализе 500 эритроцитов.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной статистической программы STATISTICA for Windows 10. Сравнение долей клеток с нарушениями между опытными и контрольной группами проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни. Для анализа дозовой зависимости проводили регрессионный анализ.

Величину ФИД для каждого противолучевого препарата рассчитывали исходя из уравнения зависимости “доза–мутагенный эффект” при действии рентгеновского излучения без противолучевого препарата и на фоне действия этого препарата [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты анализа частоты МЯ-ПХЭ в костном мозге самок мышей СВА×C56Bl/6 представлены на рисунке 1 и в табл. 1.

Рис. 1.

Зависимость частоты МЯ-ПХЭ от дозы облучения (1) и уровень МЯ-ПХЭ в группах мышей, подвергавшихся облучению в дозе 1 Гр на фоне беталейкина (2), индралина (3) и рибоксина (4).

Fig. 1. The dependence of the frequency of MN-PCE on the dose of radiation (1) and the level of MN-PCE in groups of mice exposed to a dose of 1 Gy on the background of betaleukine (2), indralin (3) and riboxin (4).

Спонтанная частота МЯ-ПХЭ у контрольных животных составила 1.22‰, что соответствует накопленному лабораторному контролю и уровню, отмеченному в литературе – 1–2‰ [5].

Излучение в дозе 0.5, 1.0 и 1.5 Гр статистически достоверно повышало частоту МЯ-ПХЭ по отношению к биоконтролю. У животных, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозе 1.5 Гр, частота МЯ-ПХЭ выходила на плато (р > 0.05).

Аналитическое выражение зависимости эффекта от дозы излучения в интервале 0–1 Гр имело вид y = 1.07 + 14.69х (N = 28, R = 0.93, p < < 0.0000), где х – поглощенная доза ионизирующей радиации в Гр, y – частота ПХЭ с микроядрами (в промилле), R – коэффициент корреляции, p – значимость коэффициента β, определяющего нарастание эффекта на единицу дозы, N – число животных [7]. Зависимость частоты МЯ-ПХЭ от дозы была линейной (p < 0.05; рисунок 1), а соответствующее ей аналитическое выражение позволило рассчитать значения ФИД (отношение равноэффективных доз в защищенной группе и контроле) для каждого из использованных препаратов.

Результаты статистического анализа и значения ФИД для использованных противолучевых препаратов представлены в табл. 1.

Как следует из данных, представленных в табл. 1, наиболее выраженный защитный эффект оказал беталейкин, тогда как защитный эффект рибоксина оказался незначимым. Однако следует отметить довольно высокое значение ФИД для этого препарата. Сравнение эффективности беталейкина и рибоксина показало, что отличия между ними статистически недостоверны.

Влияние R-излучения в диапазоне изученных доз при изолированном или сочетанном с противолучевыми препаратами действии не оказало влияния на эритропоэз: соотношение нормохромных и полихроматофильных эритроцитов статистически не отличалось в сравниваемых группах. Это соотношение составило в среднем 0.47 в группе R-излучения в дозе 1 Гр без защиты и 0.43, 0.42 и 0.49 на фоне защиты беталейкином, индралином и рибоксином соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Представленные данные свидетельствуют о том, что все три препарата, испытанные на модели воздействия R-излучения на мышей F1(CBA×C57Bl) c использованием микроядерного теста на ПХЭ костного мозга, проявляют радиозащитное действие. Значимый эффект получен для беталейкина и индралина, немного более высокий для первого из них. Для рибоксина отмечена лишь тенденция к проявлению позитивного эффекта.

Испытанные препараты согласно бинарной классификации противолучевых средств, разработанной одним из соавторов [2], относятся к разным группам: беталейкин (рекомбинантный человеческий интерлейкин-1β) – к группе цитомодуляторов (подгруппа иммуномодуляторов/цитокинов), рибоксин (нуклеозид) к той же группе (подгруппа нуклеотидов), а индралин – к группе оксидомодуляторов (подгруппа радиопротекторов/α-адреномиметиков).

Следует отметить, что защитные свойства этих препаратов в отношении ДНК мало исследованы в опытах in vivo. Возможность протекторного действия интерлейкина-1β в отношении ДНК показана на культуре клеток HeLa. При действии этого препарата частота хромосомных аберраций в культуре клеток снижалась с 9 до 5% [8]. В опыте на мышах показано радиопротекторное действие интерлейкина-1β в отношении ДНК в половых клетках с использованием метода ДНК-комет [9]. У мышей, защищенных беталейкином, установлено снижение частоты двунитевых разрывов ДНК в клетках селезенки приблизительно до контрольного уровня через 4 мес. после низкоинтенсивного воздействия γ-излучения в дозе 12.6 Гр и мощности дозы 10 мГр/мин, тогда как в группе облученных мышей без защиты эффект оставался в 2 раза выше контроля [10].

Защитное действие индралина в отношении ДНК показано в опытах на мышах, морских свинках и собаках с использованием метода учета частоты хромосомных аберраций у облученных животных при введении препарата до облучения [11].

Радиопротекторное действие рибоксина (инозина) ранее выявлено при действии γ-излучения [12], в том числе в отношении образования модифицированных оснований ДНК 8-оксогуанина и урацила [13]. С помощью микроядерного теста обнаружено, что рибоксин при внутрибрюшинном введении за 15 мин до тотального облучения мышей SHK в дозе 1.5 Гр снижает долю ПХЭ с микроядрами на 32% [13]. Мы исследовали протекторный эффект рибоксина при действии рентгеновского облучения в дозе 1 Гр, введении препарата в дозе 300 мг/кг за 30 мин до облучения и получили приблизительно такое же снижение доли ПХЭ с микроядрами (на 36%).

Таким образом, наши данные по антимутагенному действию трех противолучевых препаратов в конкретных дозо-временных условиях получены впервые, но в целом дополняют и хорошо согласуются с имеющимися немногочисленными исследованиями.

Учитывая короткие сроки введения препаратов до облучения и ранний срок оценки эффекта после облучения (24 ч), их защитный эффект в отношении ДНК может быть связан с вмешательством препаратов в первичную, радиационно-химическую стадию радиационного поражения. В случае беталейкина это опосредованная через рецептор ИЛ-1β реакция клетки с увеличением концентрации супероксиддисмутазы, глутатиона, и других эндогенных антиоксидантов, а также, по-видимому, ферментов репарации ДНК [14, 15]. В случае индралина защитный механизм, по-видимому, связан с его гипоксическим эффектом в костном мозге, реализуемом через воздействие на α-адренорецепторы и вазоконстрикцию [16, 17], что способствует снижению выхода активных форм кислорода. Защитный эффект рибоксина в отношении ДНК может определяться его участием в перехвате радикалов воды [13]. Другим объяснением антимутагенного действия рибоксина может быть его способность повышать уровень фермента репарации ДНК 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы, что показано для альвеолоцитов типа II [18]. Предполагаемые механизмы действия рибоксина оказываются, по-видимому, менее эффективными, чем при действии беталейкина или индралина.

Для оценки информативности предлагаемого подхода при прогнозировании эффективности испытываемых препаратов в отношении тяжести лучевого поражения и его исхода для всего организма оказалось возможным сравнить ФИД для МЯ-ПХЭ с ФИД по 30-суточной выживаемости (данные литературы; табл. 2).

Значения ФИД по клеточному показателю оказались существенно выше, чем по интегральному показателю выживаемости. Это может быть связано с отличием доз облучения, при которых оценивали эффективность противолучевых препаратов. Так, при проведении микроядерного теста доза облучения для защищенных групп составила 1 Гр, а при оценке 30-суточной выживаемости применяется доза 7–8 Гр. Тем не менее антимутагенная эффективность по МЯ-ПХЭ, как и противолучевая эффективность по 30-суточной выживаемости мышей, у беталейкина и индралина оказались приблизительно одинаковы и выше, чем у рибоксина. Коэффициент корреляции Спирмена между средними значениями ФИД по частоте клеток с микроядрами и по 30-суточной выживаемости для трех препаратов – высокий и значимый (R = 0.67 при p < 0.05). Метод имеет и другие преимущества: снижение количества животных в эксперименте; возможность параллельно на одних и тех же животных оценивать другие биомаркеры, в том числе молекулярные; сокращение длительности эксперимента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в работе с использованием микроядерного метода на ПХЭ костного мозга мышей показано антимутагенное действие трех противолучевых препаратов с ФИД для беталейкина, индралина и рибоксина 2.5, 1.9 и 1.4 соответственно. Примененный подход оказался эффективным для сравнительной оценки противолучевых препаратов.