Радиационная биология. Радиоэкология, 2020, T. 60, № 5, стр. 481-506

Экспериментальные исследования in vitro

Изменения тотального уровня метилирования ДНК. Еще в 70–80-е годы прошлого столетия были получены первые экспериментальные данные, свидетельствующие о реальности индукции радиацией изменений метилирования генома, зарегистрированных при оценке тотального уровня 5-метилцитозина. Так, показано, что воздействие на Escherichia coli 15T⁻ (555-7) УФ-света и рентгеновского излучения приводит к увеличению метилирования вновь синтезируемой ДНК (метод основан на включении L-methyl-³H methionine в новосинтезированную ДНК) на 25 и 15% соответственно, при этом дополнительное включение метильных групп или деметилирование родительской ДНК отсутствует [27]. Воздействие γ-излучения ⁶⁰Сo в дозах 0.5–10 Гр на клетки четырех линий (Сhinese Hamster Ovary – CHO, Сhinese hamster lung fibroblasts – V79A03, human HeLa – S-3, клетки мышиной нейробластомы – С-1300N1E-115) приводило к глобальному гипометилированию ДНК, выявляемому через 24, 48 и 72 ч после облучения (метод высокоэффективной жидкостной хроматографии – HPLC). Выявленная эпигенетическая модификация сопровождалась снижением активности ДНК-метилтрансфераз [28]. Однако изменения метилирования не выявлены в эксперименте других исследователей, а именно, при воздействии рентгеновского излучения (10 Гр) на мышиные эмбриональные клетки линии m5S/1M и на клетки китайского хомячка CHO/K1 [29].

Проведено изучение изменений паттерна метилирования после воздействия X-лучей (2 Гр) на лимфобластоидные клетки человека радиочувствительной TK6 (нормальный генотип по гену р53) и радиорезистентной WTK1 (мутантный генотип по гену р53, высокая эффективность рекомбинационной репарации) линий. Исходный уровень 5-метилцитозина был выше в WTK1 клетках по сравнению с ТК6 клетками. В обеих клеточных линиях выявлено радиационно-индуцированное гипометилирование генома в первые 2–8 ч после облучения (иммуноферментный метод ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). В целом в радиорезистентных клетках эффекты гипометилирования и снижения экспрессии генов метилтрансфераз DNMT1, DNMT3А, DNMT13В, индуцированные облучением, были более выражены. Транскрипция ТЕТ1 гена, кодирующего фермент, конвертирующий 5-метилцитозин геномной ДНК в 5-гидроксиметилцитозин (стадия деметилирования ДНК), была существенно повышена через 24 ч после радиационного воздействия в обеих клеточных линиях, однако наибольший эффект наблюдался для ТК6 клеток [30].

Еще ранее было показано, что р53 участвует в эпигенетической регуляции генома. В частности, выявлено, что р53, формируя комплекс с Sp1 и модификаторами хроматина в области промотора гена DNMT1, приводит к репрессии этого локуса [31]. Выявлено, что делеция р53 приводит к увеличению транскрипции мРНК DNMT1 локуса [32]. Кроме того, показано, что р53 приводит к супрессии гена гистоновой метилтрансферазы EZH2 [33]. Считается, что р53 контролирует экспрессию DNMT1 через прямое связывание с ДНК. Воздействие ионизирующей радиации ослабляет это связывание, приводя к увеличению уровня DNMT1 [32].

Показано, что облучение нормальных фибробластов человека в дозах 2 и 4 Гр (Х-лучи) приводит к статистически незначимому снижению общего уровня метилированных цитозинов (метод ELISA) через 6 ч после воздействия. Существенные различия (р = 0.04) обнаруживались только через 24 ч после воздействия облучения на клетки в дозе 2 Гр [34].

Изменения метилирования повторяющихся элементов ДНК. Так как диспергированные и тандемные повторы составляют, по крайней мере, половину генома человека, их эпигенетический статус часто рассматривают как показатель тотального метилирования генома. Так, в уже упомянутой работе [34] не выявлено (бисульфитное пиросеквенирование) значимых различий между уровнями метилирования LINE-1, а также центромерной α-сателлитной ДНК, в облученных (Х-лучи, 2 и 4 Гр) и необлученных нормальных фибробластах человека. Только уровень метилирования ALU повторов возрастал (р = 0.01) через 6 ч после радиационного воздействия в дозе 4 Гр. Кроме того, поклеточный анализ эпигенома не выявил повышенной вариабельности метилирования повторов в облученных клетках по сравнению с интактными.

При фракционированном воздействии γ-излучения ¹³⁷Cs в суммарной дозе 10 и 20 Гр (1–2 нед, 5 фракций в неделю по 2 Гр) на клетки рака молочной железы (линия MCF7) не выявлено (масс-спектрометрия) статистически значимых различий в уровне метилирования повторов (LINE-1, Alu, LTR, сателлитная ДНК) в облученных и необлученных клетках, а восстановление способности клеток к делению (14 дней после облучения) не сопровождалось снижением общего уровня метилирования ДНК [35].

Локус-специфические изменения метилирования ДНК. Выявлено (комбинация методов MIRA – methylated-CpG island recovery assay и microarray) незначительное количество изменений в метилировании генома нормальных клеток человека (фибробластов HFBs и клеток бронхиального эпителия NHBEC) через 7 дней после острого воздействия γ-излучения ¹³⁷Cs в дозах 0.1–4 Гр. Однако наиболее выраженные радиационно-индуцированные модификации генов CLEC18A, SDHALP1, ZCCHC16 в фибробластах, а также локусов MBP, CLEC18C и Y-хромосомного региона в клетках бронхиального эпителия не были подтверждены методами COBRA и бисульфитным секвенированием. Авторы отмечают, что рассматриваемые изменения, вероятно, имеют место на уровне отдельных CpG-динуклеотидов анализируемого участка генома и/или затрагивают только малую фракцию клеточной популяции. Одназначно, в данной работе не показана индукция механизмов (например, инициация сигнальных каскадов), которые приводят к генерализованным изменениям ДНК-метилирования, представляющим собой ответ клетки на облучение [36].

Кроме того, широкогеномное изучение паттерна метилирования (ДНК-микрочип, Illumina 450 К) не выявило значимых изменений изучаемых эпигенетических показателей в облученных фибробластах (Х-лучи, 2 и 4 Гр) по сравнению с необлученными клетками, причем результат не зависел от области расположения CpG-сайта (промотор, 5'UTR, 3'UTR, экзоны, интроны, межгенные участки ДНК). Таким образом, показано, что, по крайней мере в ранней фазе (в пределах первого клеточного цикла после облучения), ответ нормальных клеток на облучение не ассоциирован с изменением паттерна метилирования [34].

В другом широкогеномном исследовании метилома (ДНК-микрочип, Illumina 450 К) клеток бронхиального эпителия человека показано, что воздействие на них такой радиации, как тяжелые ионы ⁵⁶Fe (170 keV/µm, 0.1–1.0 Гр) и ²⁸Si (70 keV/µm, 0.3–1.0 Гр), рентгеновское излучение (2 keV/µm, 1.0 Гр) приводит к индукции изменений метилирования генома, регистрируемых не только через 2 дня после воздействия, но и спустя 50 сут. Отмечено, что сайты, характеризующиеся дозозависимым изменением эпигенетического статуса, преимущественно гиперметилируются при воздействии ⁵⁶Fe и ассоциированы с открытым хроматином (энхансеры, промоторы, берега СрG-островков), ²⁸Si в равной степени вызывает как гипер-, так и гипометилирование сайтов в более репрессированном хроматине, а Х-лучи в большей степени приводят к гипометилированию, затрагивая транскрибируемую область гена и межгенные промежутки. Причем эффекты, индуцируемые при воздействии ⁵⁶Fe, ²⁸Si и рентгеновских лучей наблюдались соответственно в сайтах, изначально характеризующихся низким, промежуточным и высоким уровнями метилирования. Отмечено, что спектр СрG-динуклеотидов, модифицированных в результате воздействия ⁵⁶Fe, совпадает с таковым в клетках аденокарциномы и плоскоклеточного рака легких человека [37].

Частота гидроксиметилирования цитозинов, которое имело место преимущественно в облученных (Х-лучи, 0.5 и 2 Гр) фибробластах легких (IMR90) по сравнению с необлученными клетками (метод иммунопреципитации + последующее секвенирование), возрастала с течением времени, прошедшего после облучения (от 1 до 120 ч), причем выраженность эффекта зависела от дозы облучения. Противоположная динамика отмечена для СрG-сайтов, расположенных в межгенных промежутках [38].

Таким образом, число исследований индуцированных облучением изменений метилирования нормальных (неопухолевых) клеток ограничено. Однако имеется гораздо большее количество экспериментальных работ, выполненных на опухолевых клетках, в том числе, посвященных изучению связи их радиочувствительности с эпигенетическим статусом, а также оценке эффективности воздействия ингибиторов метилирования ДНК в повышении чувствительности раковых клеток к облучению [39–41].

В широкогеномном исследовании (ДНК-микрочип, Illumina 450 K) на раковых клетках молочной железы (линия MDA-MB-231), подвергшихся воздействию Х-лучей в дозах 4 и 6 Гр и проанализированных через 1–72 ч после облучения, выявлены сотни дифференциально-метилированных генов, которые ассоциированы с клеточным циклом, ДНК репарацией, апоптозом. Измененный эпигенетический статус на протяжении всего эксперимента при облучении в дозах 2  и 6 Гр выявлен для 15 и 23 локусов соответственно. Выраженность рассматриваемых эпигенетических изменений зависела от дозы облучения и времени, прошедшем после воздействия радиации. Авторы отмечают, что в целом динамика метилирования согласуется с биологическим ответом клеток на повреждающее действие радиации и имеет не беспорядочный характер [42].

Другое широкогеномное исследование метилома (метил-ЦГ-иммунопреципитация + ДНК-микрочип методы) показало, что после фракционированного воздействия γ-излучения ¹³⁷Cs в суммарной дозе 10 и 20 Гр (1–2 нед, 5 фракций в неделю по 2 Гр) на клетки рака молочной железы (линия MCF7), 15 генов характеризовались измененным эпигенетическим статусом (сравнение с необлученными клетками этой линии). Однако только для четырех генов (ADAMTS9, FOXC1, TRAPPC9, AMIGO3) дифференциальный статус метилирования CpG-островков верифицировался масс-спектрометрическим анализом. В целом уровень рассматриваемой модификации первых трех генов возрастал на 15–18% после облучения, а для AMIGO3 локуса выявлено его снижение на 18%. Спустя 14 дней после воздействия, т.е. время, за которое происходило восстановление клоногенной активности клеток при дозе 10 Гр, но не 20 Гр, уровни метилирования генов FOXC1 и TRAPPC9 были значительно снижены по сравнению с таковыми, имевшими место сразу после экспонирования, но существенно превышали рассматриваемые показатели в необлученных клетках. По мнению авторов, возобновление роста клеток после фракционированного облучения в дозе 10 Гр ассоциировано с локус-специфическими изменениями ДНК-метилирования, связанными с апоптотическим сигналингом [35].

Показано, что воздействие радиации в дозе 5 Гр на клетки колоректальной карциномы линий HCT116 и SW620 приводит к ослаблению связывания DNMT1 с промоторами генов Fas и 4-1BBL, снижая их метилирование. Аналогичный эффект наблюдался при обработке клеток 5-азацитидином (5-Aza). Таким образом, модулируется экспрессия этих генов, делая опухолевые клетки более чувствительными к иммунной атаке, опосредованной Т-лимфоцитами [43].

Показана сопряженность радиочувствительности опухолевых клеток с уровнем метилирования тех или иных генов [44]. Например, показано, что радиочувствительность U87 клеток глиомы c низким уровнем экспрессии АТМ – ключевого сигнального компонента клетки, индуцирующегося в ответ на повреждение ДНК, в 2 раза превышает аналогичный показатель в T98G клетках глиомы, экспрессирующих АТМ белок в нормальном количестве. При этом отмечено, что причиной такой низкой индукции АТМ в этих радиочувствительных клетках является метилирование промотора, а снятие этого метилирования приводит к увеличению уровня АТМ протеина в клетках и уменьшению их радиочувствительности [45]. Гиперметилирование других генов, например, гена SOCS1 супрессора цитокинового сигналлинга-1 в клетках глиобластомы или гена смерть-ассоциированной протеинкиназы DAPK в клетках рака шейки матки было ассоциировано с повышенной радиорезистентностью опухолей [46, 47].

Широкогеномное изучение паттерна метилирования (ДНК-микрочип, Illumina 450 K) в клетках опухолей головы и шеи (HNSCC) показало, что по сравнению с радиочувствительными клетками линии SCC-61, радиорезистентные клетки rSCC-61 имеют сотни дифференциально метилированных сайтов, которые являются, в основном, гиперметилированными. Причем показано, что в радиорезистентных клетках гиперметилированных сайтов в 10 раз больше, чем гипометилированных. Повышенный уровень фермента DNM3B, но не DNMТ1 и DNM3А, обнаружен также в радиорезистентных клетках. После объединения этих результатов с таковыми по экспрессии генов выявлено 84 дифференциально метилированных и экспрессируемых локусов в этих двух клеточных линиях (гены сигналинга, ассоциированного с интегрин-связанными киназами ILK, глюкокортикоидными рецепторами, гены, связанные с окислением жирных кислот и регуляцией клеточного цикла). Например, ген белка CCND2, участвующего в регуляции клеточного цикла, был репрессирован в rSCC-61 клетках (в отличие от клеток SCC-61), что ассоциировано с его гиперметилированием в промоторном регионе. Кроме того, данные по гиперметилированию генома рассматриваемой радиорезистентной линии опухолевых клеток были подтверждены результатами анализа эпигенетического статуса (Cancer Genome Atlas) клеток опухолей, резецированных у HNSCC пациентов [48].

В другой работе, посвященной изучению эпигенетического контроля радиочувствительности клеток немелкоклеточного рака легких (NSCLC), выявлен 1091 дифференциально-метилированный локус (гены, вовлеченные в клеточную адгезию и коммуникации, сигнальную трансдукцию, регуляцию транскрипции) при анализе (ДНК-микрочип, Illumina 27 K) двух клеточных линий: радиочувствительной H460 и радиорезистентной H1299. Показано, что число гиперметилированных генов (n = 747) в H1299 клетках в 2 раза превышает таковой показатель в клетках H460 линии. Выявлено, что эпигенетический статус четырех генов, который существенно различался между клетками этих двух линий, что было подтверждено методом метил-специфической ПЦР, сопряжен с экспрессией локусов и чувствительностью клеток к радиационному воздействию. Так, гипометилированные гены SERPINB5 и S100A6 (ингибиторы клеточной инвазии), активно экспрессирующиеся в радиочувствительной клеточной линии H460, были гиперметилированы и не транскрибировались в радиорезистентных H1299 клетках. При этом снижение экспрессии этих генов в экспериментах с малой интерферирующей РНК (siРНК, small interfering RNA) приводило к радиорезистентности, т.е. возрастанию выживаемости клеток H460 после γ-воздействия в дозах 5–8 Гр. Напротив, гены CAT (антиоксидантный фермент – каталаза) и BNC1 (регулятор транскрипции) были гипометилированы в радиорезистентных клетках, а РНК-интерференция приводит к увеличению радиочувствительности [49].

При исследовании клеток плоскоклеточной карциномы гортани (бисульфитное пиросеквенирование) показано, что радиорезистентная линия RR-Hep-2 характеризуется повышенным (по сравнению с радиочувствительными клетками Hep-2) уровенем метилирования пяти генов (TOPO2A, PLXDC2, ETNK2, GFI1 и IL12B), которые были предварительно идентифицированы как сопряженные с данным фенотипом по базе маркерных экспрессирующихся последовательностей (EST, expressed sequence tag). Уровни ДНК-метилтрансфераз DNM3А и DNM3В были также выше в RR-Hep-2 клетках по сравнению с таковыми в Hep-2 клетках [50].

Показано, что общий уровень метилирования ДНК (radiolabeled [3H] dCTP extension assay) в доксорубицин-резистентных клетках аденокарциномы молочной железы (линия MCF-7/DOX) существенно ниже, чем таковой в клетках MCF-7, чувствительных к этому цитостатику. Различный эпигенетический статус клеток этих линий был сопряжен с дифференциальной клеточной чувствительностью к воздействию рентгеновского излучения в дозе 5 Гр. Так, облучение не приводило к индукции апоптоза клеток MCF-7/DOX, и, напротив, MCF-7 клетки были чувствительны к радиационно-индуцированному апоптозу. Значительное увеличение уровня метилирования в клетках (обе линии) являлось результатом их обработки (в течение 6 дней) S-аденозилметионином (SAM), являющимся донором метильных групп. Последующее облучение не приводило к изменению количества метилированных цитозинов в клетках, но при этом отмечены существенное возрастание радиочувствительности MCF-7/DOX клеток и ее снижение в изначально радиочувствительной MCF-7 линии. Авторы предполагают, что последнее связано с метилированием и последующим репрессированием некоторых апоптотических генов [51].

Показано, что резистентность к цитостатикам ассоциирована с повышенным уровнем детоксификации свободных радикалов системой глютатиона, которая использует SAM как источник метильных групп для глютатион-S-трансфераз. Это приводит к истощению SAM в клетках, вызывая гипометилирование. Кроме того, известно, что “отдав” метильную группу, SAM превращается в SAH (S-аденозил-гомоцистеин), который обладает ингибирующим действием на активность ДНК-метилтрансфераз [52, 53].

Следует отметить, что гиперметилирование некоторых генов сопряжено не только с чувствительностью опухолевых клеток к облучению in vitro, но и имеет прогностическую значимость при радио-/химиотерапии опухолей. Например, гиперметилирование гена MGMT в клетках резецированной глиобластомы сопряжено с эффективностью последующей радиотерапии и выживаемостью пациентов [54]. Эта эпигенетическая модификация ассоциирована с высокой чувствительностью рассматриваемой опухоли к алкилирующему агенту кармустину, что ассоциировано с ее регрессией и длительной ремиссией болезни [55]. Аналогичный результат получен и в другом исследовании при анализе последствий лечения глиобластомы облучением в сочетании с темозоломидом с последующим адьювантным курсом этого препарата [56]. И напротив, гипометилирование LINE-1 в клетках злокачественных опухолей ассоциировано, в большинстве случаев, с плохим прогнозом заболевания, неэффективностью радио- и химиотерапии, низкими показателями выживаемости пациентов [57].

В экспериментальных исследованиях in vitro показано, что воздействие (в течение 18–48 ч перед облучением) таких ингибиторов метилирования ДНК как зебуларин, псаммаплин, 5-аза-2'-дезоксицитидин (5-aza-dC) на раковые клетки различных линий (панкреатическая карцинома, MiaPaCa; глиобластома, U251; карцинома простаты, DU145; глиобластома, U373MG; карцинома легких, A549; карцинома головы и шеи, HNSCC) приводит к возрастанию их радиочувствительности за счет накопления нерепарированных повреждений ДНК [58–60]. Наблюдаемый эффект подобен действию ингибиторов гистоновых деацетилаз (MS-275, вальпроевая кислота, LBH589, битурат), который наблюдался в экспериментах по оценки чувствительности к облучению in vitro опухолевых клеток различных линий и нормальных лимфоцитов человека при их предварительной обработке этими соединениями, приводящей к гиперацетилированию гистонов и релаксации хроматина [61–64].

В другой работе продемонстрировано, что вызванное 5-aza-dC повышение радиочувствительности клеток рака желудка (OCUM-2M, OCUM-12, MKN-45 линии) связано с G2-M арестом, а также апоптотической гибелью клеток, что сопровождалось повышенной экспрессией p53, RASSF1 и DAPK семейства генов. Отсутствие рассматриваемого эффекта для клеток линий KATO-III и MKN-74 было ассоциировано с наличием мутации гена р53 [65]. Показано, что псаммаплин А оказывает цитотаксическое действие на клетки карциномы эндометрия через селективную индукцию апоптоз-связанных генов [66]. Продемонстрировано, что 5-aza-dC может индуцировать G2-M арест и апоптоз в клетках остеосаркомы некоторых линий (SaOS2, HOS и U2OS) р53-независимым способом [67], что наблюдалось и в другом исследовании с децитабином [68]. Показано, что предобработка клеток назофарингеальной карциномы линий CNE2 и SUNE1 5-Aza за 24 ч до облучения (X-лучи, 2 Гр) приводит к существенному возрастанию их радиочувствительности за счет повышения уровня апоптотической гибели клеток, но не влияет на течение клеточного цикла и репарацию двунитевых разрывов ДНК [69].

В то же время предобработка радиорезистентных клеток карциномы головы и шеи rSCC-61 5-Aza не приводила к повышению радиационно-индуцированной клеточной гибели и количеству повреждений ДНК (фосфорилированные γ-H2AX фокусы). Ранее эти же авторы показали повышенную пролиферативную активность rSCC-61 клеток по сравнению с SCC-61 клетками и G2/M – арест SCC-61 клеток в ответ на радиационное воздействие [70, 71].

Таким образом, наличие эффекта повышения радиочувствительности опухолевых клеток в эксперименте in vitro путем предварительной их обработки ингибиторами ДНК-метилтрансфераз, а также механизм реализации этого феномена зависят от типа клеток, использованного деметилирующего соединения, его концентрации, схемы эксперимента [69]. Хотя установлено, что, как правило, радиорезистентный фенотип опухолевых клеток ассоциирован с гиперметилированием промоторов множества генов (клеточного цикла и апоптоза, ингибиторов клеточной инвации и др.), механизм этого феномена очень сложный и требуется таргетное воздействие на метилирование, чтобы увеличить повреждаемость опухолевых клеток, приводящую их к гибели.

Радиационно-индуцированные изменения метилирования ДНК в потомках облученных клеток. Имеются работы, свидетельствующие об изменении профиля метилирования в отдаленных потомках облученных клеток. Так, воздействие Х-лучей (2 Гр) и ионов ⁵⁶Fe (1 Гр) на гибридные GM10115 клетки приводило к индукции гипометилирования LINE-1 и Alu повторов (метод COBRA, Cоmbined Bisulfite Restriction Analysis) в их отдаленных потомках (16–20-клеточная генерация). Что касается более низких доз облучения (Х-лучи 0.5 Гр и ⁵⁶Fe 0.1 Гр), только воздействие рентгеновского излучения в дозе 0.5 Гр приводило к значимому эффекту гиперметилирования. Существенное увеличение тотального уровня 5-метилцитозина (метод MSAP, methylation sensitive amplified polymorphisms) выявлено только для Х-лучей в дозе 0.5 Гр, а его уменьшение – для ⁵⁶Fe (1 Гр). При всех вариантах эксперимента не выявлено изменений в метилировании промоторов изученных генов (NFkB, TSLC1, CDH1) (метод метилспецифической ПЦР, бисульфитное пиросеквенирование) [72, 73]. В целом с этими данными согласуются результаты, полученные в других исследованиях с использованием других клеточных линий. Так, показана индукция гипометилирования LINE-1 в отдаленных потомках клеток колоректальной карциномы человека RKO, подвергшихся воздействию Х-лучей в дозе 1 Гр. Однако такое же воздействие приводило к гиперметилированию этих элементов генома в первичных диплоидных фибробластах кожи человека AGO1522D. Рассматриваемых эпигенетических изменений Alu повторов не выявлено. Однако воздействие протонов и ионов ⁵⁶Fe приводило к гипометилированию LINE-1 и Alu в обеих клеточных линиях. Для последних показано тотальное гиперметилирование при действии протонов и ионов, и гипометилирование при действии Х-лучей [74]. Таким образом, показана зависимость рассматриваемых эпигенетических эффектов от типа радиации, ЛПЭ излучения, типа клеток, тканей, времени, прошедшем после облучения.

Показаны дисрегуляции в метилировании ДНК в потомках 20-й клеточной генерации НРV-G кератиноцитов человека, подвергшихся воздействию γ-излучения в дозах 0.1–1.0 Гр. Аналогичные нарушения выявлены в потомках клеток, обработанных средой от облученных клеток (5 Гр) и проявляющих “эффект свидетеля”. В основном преобладало гиперметилирование, в том числе в последовательностях ретротранспозона и сателлитной ДНК (MLT1A и SAT2). Эти эпигенетические нарушения сопровождались проявлениями нестабильности генома: повышенные частоты аберрации хромосом, апоптотическая и репродуктивная гибель клеток [75].

Как известно, метилирование ДНК является необходимым условием нормального роста и функционирования соматических клеток, a эмбриональные стволовые (ЭС) клетки являются удобной моделью для изучения роли этого эпигенетического процесса в механизмах таких эффектов радиации как геномная нестабильность и эффект свидетеля. DNMT1(–/–) или DNMT3A(–/–)DNMT3B(–/–) ЭС клетки, накаутированные по генам метилтрансфераз, не изменяли способность пролиферировать, сохранять постоянный набор хромосом, перицентромерные гетерохроматиновые домены (метилирование лизина 9 гистона H3) и свойства недифференцированных клеток [76].

Проведена серия экспериментов, доказывающая роль метилирования ДНК и метилтрансфераз DNMT1, DNMT3А (но не DNMT3В) в сохранении “памяти” в потомках облученных ЭС клеток о перенесенном воздействии γ-излучения (⁶⁰Со, 3 Гр, 73 сГр/мин) и в индукции нестабильности генома в клетках-соседях, культивированных в одной среде с этими клетками. Так, не выявлено отличий в частотах сестринских хроматидных обменов (СХО) в клетках, культивированных совместно с потомками облученных и необлученных “накаутированных” DNMT1–/– (или DNM3A–/–) ЭС клеток. При этом отмечено, что в отличие от необлученных нормальных ЭС клеток (WT-клетки), клетки DNMT1–/– и DNM3A–/– индуцировали СХО в их WT-клетках соседях, что указывает на нестабильный фенотип клеток с “накаут” генами метилтрансфераз и свидетельствует об определенном пороге, выше которого не происходит индукции нестабильности генома под действием радиации. Эксперименты с добавлением доксициклина, вызывающего временную супрессию гена DNMT1, подтверждают роль метилтрансфераз-опосредованных механизмов в сохранении и передаче сигнала о нестабильности генома клеткам, соседствующем в культуре с потомками облученных клеток [77].

Экспериментальные исследования ЭС клеток, характеризующихся различным уровнем метилирования ДНК (результат наличия или отсутствия ДНК-метилтрансфераз), показали, что их радиочувствительность (радиационно-индуцированная отсроченная геномная нестабильность) не определяется только сниженным уровнем метилирования генома, а зависит от присутствия в клетке в активном состоянии определенных ДНК-метилтрансфераз. Так, отсутствие DNMT1 (но не DNMT3А и DNMT3В) приводило к 10-кратному увеличению de novo HPRT мутаций, но этот уровень не изменялся при воздействии радиации; напротив, в ЭС клетках дикого типа радиационно-индуцированная нестабильность генома в отдаленных потомках облученных клеток имела место. Такая парадоксальность результатов, по-видимому, объясняется тем, что требуется специфический паттерн метилирования и/или присутствия метилтрансфераз, чтобы рассматриваемый феномен имел место. Предполагается, что изменения в активности DNMTs или паттерне метилирования ДНК потенциально может изменять секреторный профиль клетки (такие факторы как TNFα, NO и TGFβ), что влияет на стабильность генома [78]. Эта проблема является очень важной, так как лежит в основе механизмов радиорезистентности особой популяции опухолевых клеток, имеющих характеристики, аналогичные таковым стволовых клеток (потенциал к самообновлению, способность формировать опухоли, генетический и эпигенетический код) [79, 80].

Экспериментальные исследования in vivo

Изменения тотального уровня метилирования ДНК. Эксперименты, проведенные на клетках тимуса и ККМ аутбредных мышей Wister свидетельствуют о динамическом характере гипо-/гиперметилирования синтезируемой ДНК в течение первых 9 дней после облучения животных, и относятся к концу 70-х годов прошлого века [81]. Позже было выявлено снижение уровня 5-метилцитозина (метод HPLC) в печени мышей С57BL/6NJcI через 8 ч после воздействия (Х-лучи, 4–7 Гр), а не сразу после экспозиции. Эффект гипометилирования сохранялся в течение всего эксперимента (8–72 ч) и не зависел от дозы. Аналогичные эффекты в клетках мозга и селезенки отсутствовали [29].

Показано, что облучение мышей CBA/H (Х-лучи, 3 Гр) приводило к снижению тотального уровня 5-метилцитозина (на 8%, HPLC-метод) в клетках ККМ животных, но не селезенки, через 4–14 дней после воздействия. Причем рассматриваемый эффект не наблюдался у мышей линии C57BL/6, являющихся резистентными к радиационно-индуцированной индукции острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и хромосомной нестабильности. При этом степень гибели клеток в гипометилированном костном мозге (больше 80%) превышает таковую в селезенке (50%) и не различается у животных с рассматриваемыми генотипами. Полученные данные свидетельствуют о связи гипометилирования с повышенной радиочувствительностью генома клеток. Учитывая то, что у животных обеих линий общая радиочувствительность и кинетика восстановления ККМ одинаковы, различия в индукции эпигенетических модификаций в зависимости от генотипа особи не могут объясняться исключительно особенностями пролиферативной активности клеток [82].

У потомков облученных мышей-самцов С57В1/6 и обоих облученных родителей (острое воздействие, X-лучи, 2.5 Гр), наряду с повышенной частотой разрывов ДНК в тимусе, наблюдались существенные отклонения в эпигенетической регуляции: снижение глобального метилирования, сопровождающееся пониженной экспрессией ДНК-метилтрансфераз DNMT1 (восстановление метилирования в дочерней нити ДНК после репликации), DNMT3A и DNMT3В (метилирование de novo), а также метил-CpG-связывающего белка MeCP2 – фактора, регулирующего экспрессию генов и ремоделирование хроматина [83]. Аналогичные изменения выявлены в тимусе мышей, подвергшихся фракционированному воздействию Х-лучей в дозе 0.5 Гр [84].

В клетках молочной железы крыс после острого воздействия Х-лучей в дозе 5 Гр также наблюдались существенные изменения эпигенетического статуса (глобальное гипометилирование, сопровождающееся снижением экспрессии ДНК-метилтрансфераз DNMT1, DNMT3A, DNMT3B и белка MeCP2) наряду с повышением уровня белков внутриклеточных сигнальных систем (фосфорилированные киназы p-ERK1/2 и p-AKT), белков репарации (RAD51, KU70, POLB-фермент) и контроля клеточного цикла (циклины D1, D3 и PCNA). Через 6 ч после облучения отмечался повышенный уровень апоптоза, что сопровождалось незначительным повышением клеточной пролиферации [85]. Авторы рассматривают полученные данные в контексте связи этих изменений с механизмами канцерогенеза. Следует отметить, что аналогичные эпигенетические нарушения выявлены и в раковых клетках молочной железы человека [86].

Острое и фракционированное воздействие радиации (50 сГр за 10 дней, т.е. 5 сГр за день, 0.2 сГр/с) на мышей линии C57/B16 приводило к значительному снижению метилирования ДНК в клетках селезенки и печени у самок. Напротив, у самцов выявлено глобальное гиперметилирование ДНК клеток селезенки и отсутствие каких-либо эпигенетических изменений в клетках печени. Выявленное глобальное гипо- и гиперметилирование было сопряжено соответственно со сниженной и повышенной экспрессией ДНК-метилтрансфераз DNMT3А и DNMT3В. Изменение активности DNMT1 наблюдалось только у самок в клетках печени после хронического облучения. Выявлена роль половых гормонов, в частности эстрогенов, в индукции изменений в метилировании ДНК [87]. Тканеспецифичный и зависящий от пола облученной особи характер изменений метилирования ДНК отмечен и в других публикациях этих авторов [88, 89]. При этом показано, что хроническое облучение в высоких дозах (5 Гр) не приводит к изменению паттерна метилирования ДНК [89].

Выявлено существенное снижение уровня глобального метилирования (метод HPLC) в клетках крови мышей BALB/c через 2 ч после их фракционированного облучения (0.5 Гр, 10 дней, Х-лучи) и отсутствие эффекта спустя 1 мес. после радиационного воздействия [90].

Показано, что через 22 нед после перенесенного мышами C57BL/6 воздействия ионов ⁵⁶Fe в дозе 40 сГр уровень тотального метилирования ДНК (метод ELISA) в клетках легкого существенно превышал аналогичный показатель в контроле. При этом значимый эффект отсутствовал при облучении в дозе 10 и 20 сГр [91].

В отдаленные периоды (1 нед, 1 мес.) после воздействия на мышей CBA/CaJ ионов ⁴⁸Ti (0.1–0.5 Гр, 0.01 Гр/мин, 1 GeV/n) выявлено зависимое от дозы увеличение общего уровня метилированных цитозинов (ELISA метод) в клетках печени животных. Через 6 мес. после радиационного воздействия значимое повышение рассматриваемого эпигенетического показателя наблюдалось только при облучении в дозе 0.5 Гр. Напротив, уровень 5-гидроксиметилцитозина был снижен во всех вариантах эксперимента и зависел от дозы облучения. Выявленные изменения паттерна метилирования сопровождались выраженным хроническим оксидативным стрессом (повышение уровня малонового диальдегида) и воспалительным ответом (возрастание уровней активированного NF-kB, TNF-α, IL-1β, Il-6) [92].

Выявлен разнонаправленный характер изменений общего уровня метилирования ДНК (метод ELISA) в гонадах самок и самцов крыс Sprague-dawley, получавших от рождения до 9-месячного возраста питьевую воду, содержащую природный уран UO₂ (40 мг/л): гипометилирование ДНК клеток яичников (на 18% меньше, чем в контроле) и гиперметилирование ДНК (на 17% больше) клеток семенников. Аналогичные изменения, но в большей степени, наблюдались в этих же тканях в F1 и F2 поколениях животных, что указывает на трансгенерационный характер эпигенетических нарушений. Выявлены также изменения в экспрессии ДНК-метилтрансфераз (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), что не всегда коррелировало с уровнем метилирования ДНК и указывает, по мнению авторов, на посттранскрипционные эффекты регуляции активности энзимов [93].

В костномозговых гемопоэтических клетках (стволовых и клетках-предшественниках, HРSCs) мышей C57BL/6J выявлен разнонаправленный характер изменений паттерна метилирования в ближайшие (4 нед) и отдаленные (22 нед) сроки после воздействия на животных ⁵⁶Fe (0.1, 0.2 и 0.4 Гр). Так, эпигенетический статус этих клеток после облучения характеризовался отчетливой тенденцией к повышенному тотальному уровню 5-метилцитозина (иммунофлюоресцентный метод). По прошествии 22 нед наблюдалось дозозависимое уменьшение тотального уровня метилирования генома, значимое при дозе 0.4 Гр [94].

Изменения метилирования повторяющихся элементов ДНК. Не вывлено изменений уровней метилирования повторов (методы высокочувствительного плавления и пиросеквенирования) LINE-1, SINE B1 и IAP в клетках периферической крови мышей C57BL/6 спустя 85–420 дней после воздействия на них Х-лучей в дозе 10 мГр по сравнению с таковыми показателями, зарегистрированными за 3 дня до облучения животных. Аналогичные результаты получены для клеток селезенки и печени спустя 420 дней после воздействия радиации, хотя, как известно, клетки этих органов обладают высокой радиочувствительностью и выраженными возрастными изменениями соответственно [95].

В то же время облучение мышей радиочувствительных (BALB/c и CBA) и радиорезистентной (C57BL/6) линий в дозе 1 Гр (X-лучи) приводило к изменениям метилирования, зависящих от генотипа организма, пола, исследованной ткани, времени после облучения и типа изученного повтора (LINE-1, SINE B1 и IAP). Наиболее выраженный ответ наблюдался у самцов BALB/c и CBA. Показано, что животные всех линий проявляли ранний ответ на облучение (через 1 день после воздействия), характеризующийся возрастанием уровня метилирования LINE-1 элемента. Причем у мышей BALB/c эти эпигенетические изменения сохранялись и через 6 дней после воздействия, а у радиорезистентных животных C57BL/6 наблюдалась потеря метилирования через 14 дней после экспозиции [96].

Не выявлены изменения метилирования LINE 1 повторов (TF и A1 мономеры, бисульфитное пиросеквенирование) в легких и печени мышей C3H/HeN через 1–120 сут после воздействия на них ⁵⁶Fe в дозах 10, 30 и 100 сГр по сравнению с таковыми показателями у необлученных животных [96]. В то же время в уже упомянутой работе [91] уровень метилирования LINE1 повтора (метилчувствительная McrBC-qPCR) в клетках легкого у мышей через 22 нед после перенесенного животными воздействия ионов ⁵⁶Fe в дозе 40 сГр существенно превышал аналогичный показатель в контроле. При этом значимый эффект отсутствовал при облучении в дозе 10 и 20 сГр. Заслуживает внимания факт, что при этом наблюдалась существенная потеря экспрессии LINE 1 и SINE1 транспозонов, а также других повторов (Charlie, минорные сателлиты), проявивших тенденцию к гиперметилированию.

Через 2 мес. после воздействия γ-радиации в дозах 0.1 и 1 Гр на мышей C57BL/6J и CBA/J наиболее выраженный эффект индукции гипометилирования 5'-нетранслируемых регионов (5'-UTRs) LINE-1 элементов наблюдался в гемопоэтических стволовых клетках (HSCs) у радиочувствительных CBA/J животных, склонных к канцерогенезу системы кроветворения. Эффект был более выражен при облучении в большей дозе. В предшественниках зрелых клеток крови (HРCs) наблюдались разнонаправленные эффекты при воздействии излучения в дозе 0.1 и 1 Гр: гиперметилирование и гипометилирование соответственно. В мононуклеарных клетках (MNCs) у этих же мышей выявлено радиационно-индуцированное гиперметилирование с наиболее выраженным эффектом при воздействии в дозе 1 Гр. Таким образом, направленность и выраженность радиационно-индуцированных изменений метилирования 5'-UTRs LINE-1 элементов зависела от генотипа особи, вида анализируемых клеток, дозы облучения [97].

Выявлена индукция гипометилирования LINE-1 ORF1 (кодирует шаперон ORF1р) в клетках сердца мышей C57BL/6J через неделю после воздействия на животных излучений с высокой ЛПЭ: протонов (0.1 Гр, 150 MeV, 0.53 ± 0.08 Гр/мин), тяжелых ионов ⁵⁶Fe (0.5 Гр, 600 MeV, 0.38 ± 0.06 Гр/мин). Радиационно-индуцированные изменения метилирования других исследованных повторов (ERV1, ERV2, SINE B1, SINE B1, транспозоны Charlie and Mariner, центромер-ассоциированная сателлитная ДНК) не наблюдались. В то же время на 90-й день после облучения выявлено гиперметилирование нескольких изученных повторяющихся последовательностей ДНК, индуцированное в результате воздействия этих плотноионизироующих излучений: LINE-1 ORF1, ERV2, а для SINE B1 и основных сателлитов этот эффект наблюдался только при воздействии тяжелых ионов ⁵⁶Fe, но не протонов [98].

В костномозговых гемопоэтических клетках (стволовых и клетках-предшественниках, HРSCs) мышей C57BL/6J выявлен разнонаправленный характер изменений паттерна метилирования LINE1 и SINE B1 повторов (метилчувствительная Real-time PCR) в ближайшие (4 нед) и отдаленные (22 нед) сроки после воздействия на животных ⁵⁶Fe (0.1, 0.2 и 0.4 Гр): статистически значимая зависимая от дозы индукция гиперметилирования и тенденция к их гипометилированию соответственно. В то же время в более дифференцированных мононуклеарных клетках (MNCs) через 4 нед после облучения наблюдалось зависимое от дозы гипометилирование LINE1 и SINE B1 (при облучении в дозе 0.4 Гр изменения были статистически значимые) [94]. Полученные результаты демонстрируют разный ответ клеток гемопоэтической системы на облучение, что связано со степенью их дифференцировки, сопряженной с разным эпигенетическим статусом. Показано, что менее дифференцированные HРSCs клетки имеют более высокие уровни тотального метилирования генома (на 19% выше), метилирования LINE1 и SINE B1 повторов (в 5–10 раз выше) и экспрессии ДНК-метилтрансфераз (в 2.0–4.6 раза выше) по сравнению с дифференцированными MNCs клетками. Эти результаты согласуются с выводами, сделанными другими исследователями [99], в том числе о том, что ответ клеток организма на метил-дефицитную диету будет определяться паттерном метилирования [100].

Выявлена (бисульфитное пиросеквенирование) существенная индукция гипометилирования LINE-1 ORF1 в ткани легкого после воздействия протонов и последовательного действия протонов (1-й день) + ⁵⁶Fe (2-й день). В этой же работе показано, что воздействие протонов (0.1 Гр, 150 MeV/n), ⁵⁶Fe (0.5 Гр, 600 MeV/n) или протонов (1-й день) + ⁵⁶Fe (2-й день) приводило преимущественно к гиперметилированию 5'-UTRs области LINE-1, имеющих больший эволюционный возраст, а паттерн метилирования “более молодых” повторов оставался неизменным спустя 4 нед после облучения [101]. Следует отметить, что показана обратная связь между уровнем метилирования и эволюционным возрастом LINE-1. При этом в эксперименте in vitro с RAW264 мышиными макрофагами воздействие деметилирующего агента 5-aza-dC приводило к значимому снижению метилирования “более молодых” повторов, способных к реактивации и ретранспозиции. Кроме того, эксперименты in vivo с мышами, находящимися на метионин-дефицитной диете, свидетельствуют о существенной потере метилирования в пределах 5'-UTRs области только двух А-типов LINE-1: L1MdA_I (0.21 Myr) и L1MdA_VI (4.7 Myr) [101].

Локус-специфические изменения метилирования ДНК. Показана реальность индукции гиперметилирования генов при воздействии на животных как ионизирующих излучений с высокой ЛПЭ (⁵⁶Fe, 10–100 сГр), так и низкой ЛПЭ (Х-лучи, 50 сГр). Так, показано радиационно-индуцированное гиперметилирование 811 регионов генома (иммунопреципитация+ДНК-микрочип: MeDIP-on-chip), определяющих все основные биологические процессы, в клетках крови мышей BALB/c через 2 ч после перенесенного хронического радиационного воздействия (0.5 Гр, 10 дней, Х-лучи). Для двух генов репарации и клеточного цикла (Rad23b и Ddit3) проведено изучение (бисульфитное секвенирование) и выявлено сохранение аберрантного эпигенетического маркирования через 1 мес. после облучения, что сопряжено со сниженной экспрессией этих генов [90].

Выявлены изменения метилирования промоторов генов (бисульфитное пиросеквенирование) в легких, но не в печени, у мышей C3H/HeN, подвергшихся воздействию ⁵⁶Fe в дозах 10, 30 и 100 сГр. Показана зависимость наблюдаемых эффектов от дозы облучения, причем в целом воздействие в более низких дозах ассоциировалось с наибольшими эффектами. Так, в ближайшие сроки после облучения (1-й день) выраженное гиперметилирование наблюдалось для всех изученных генов (DAPK1, EVL, 14.3.3, p16, MGMT, IGFBP3) только при воздействии в дозе 10 сГр. Выраженность и направленность отдаленных эпигенетических эффектов определялись временем, прошедшим после облучения, дозой радиации, анализируемым локусом и имели циклический характер. Так, на 7-й день после радиационного воздействия наблюдалось существенное гипометилирование DAPK1 и 14.3.3 при облучении только в дозе 10 сГр, а для других генов аналогичный эффект наблюдался при всех дозах. Через 30 и 120 дней после облучения для пяти изученных генов (DAPK1, EVL, 14.3.3, p16, MGMT) отмечалась разнонаправленность в изменении метилирования при облучении в дозах 10 и 30 сГр: гиперметилирование через 30 дней после воздействия и гипометилирование через 4 мес. после облучения. Эти эффекты не наблюдались при воздействии в дозе 100 сГр [96].

Результаты изучения локус-специфических изменений метилирования (Mouse Lung Cancer DNA Methylation PCR Array) в клетках легкого мышей через 22 нед после перенесенного животными воздействия ионов ⁵⁶Fe в дозе 10–40 сГр свидетельствуют о наличии значимых эффектов облучения преимущественно при самой низкой дозе – 10 сГр: пять (Cadm1, Cdh13, Cdkn1c, Mthfr and Sfrp1) из 22 исследованных генов, потенциально ассоциированных с развитием рака легкого, были гиперметилированы, при том, что воздействие в более высоких дозах приводило к аберрантному метилированию только одного гена – Cdkn1c [91].

Выявлены устойчивые изменения уровней (иммунопреципитация + секвенирование: MeDIP-Seq) метилирования и гидроксиметилирования СрG-сайтов в клетках левого желудочка сердца, а также гиппокампа через 5 мес. после воздействия на мышей протонов (1 Гр, 150 МeV). Выявленный спектр СрG-динуклеотидов, характеризующихся эпигенетическим ремоделированием, индуцированным в результате облучения, имел тканеспецифичный характер и затрагивал гены, ответственные за развитие и дифференцировку клеток сердца и сосудов (SRF, Nkx2-5, Miocardin и др.), а также рост аксонов, дифференцировку нейронов, нейрогенез, синаптическую передачу, G-протеиновый сигналинг [102]. В другом исследовании этих же авторов выявлены изменения уровней метилирования и гидроксиметилирования СрG-сайтов генома в клетках гиппокампа мышей, подвергшихся воздействию ⁵⁶Fe (600 МeV) в дозах 0.1 и 0.4 Гр (но не 0.2 Гр), регистрируемые через 2 нед после облучения, что коррелировало с когнитивными изменениями. При этом сохранность эпигенетического ремоделирования генома по прошествии 20 нед после воздействия отмечалась только в отношении уровней 5-гидроксиметилцитозина и коррелировала с экспрессией генов [103, 104].

Показано выраженное аномальное метилирование промотора гена опухолевого супрессора p16/INKa при хроническом низкодозовом воздействии (50 сГр за 10 дней, 0.2 сГр/с, Х-лучи). Отмечены тканеспецифичные и зависящие от пола различия в метилировании. У самцов облученных мышей метилирование промотора гена p16/INKa в клетках печени было более выражено, чем у самок. Напротив, для клеток мышечной ткани не выявлено различий по этому показателю у особей разного пола. Не выявлено существенных изменений после радиационного воздействия в метилировании промотора гена MGMT. Авторы также заключают, что хроническое воздействие радиации в малых дозах является более сильным индуктором эпигенетических эффектов, а значит и дестабилизации генома, чем острое облучение в той же дозе [88].

У мышей BALB/c уровень метилирования восьми из 23 проанализированных сайтов СрG-островка гена р16 (бисульфитное секвенирование) был существенно выше в радиационно-индуцированных тимических лимфомах, индуцированных облучением в дозе 1.75 Гр (4-MV линейный ускоритель), чем в необлученных образцах тимуса, что сопровождалось транскрипционной инактивацией этого гена [105].

Показано, что внутриутробное облучение (MicroCT scanner) мышей-самцов A^vy агути (но не самок) приводило к гиперметилированию IAP промотора (часть инсерции IAP элемента в псевдоэкзоне PS1A, расположенном перед промотором дикого типа) в клетках хвоста и печени при воздействии в дозах 0.7–3 сГр, но не 0.4 и 7.6 сГр, что коррелировало с окраской шерсти – псевдо-агути, характерной для животных, имеющих пониженный риск развития ожирения, рака, инсулиновой резистентности. Таким образом, в данном случае радиационное воздействие приводило к положительному адаптивному эффекту, индукция которого зависела от дозы и пола особи [106].

Гиперметилирование промоторов генов p16/INK4A и RASSF1, повышенная активность ДНК-метилтрансфераз и модификации гистонов наблюдались также в клетках кожи мышей, подвергшихся воздействию УФ-В, а также в опухолях кожи, индуцированных этим излучением [107].

Выявлены нарушения импринтинга гена Н19 в сперме мышей, подвергшихся хроническому воздействию рентгеновского излучения (1.3 Гр) на постмейотической стадии сперматогенеза, и аналогичные изменения паттерна метилирования контрольного региона импринтинга в печени потомков [108].

В целом отмечены тканеспецифичные, зависящие от пола, анализируемого локуса, дозы и мощности дозы, типа воздействующей радиации, времени, прошедшем после облучения, различия в выраженности индуцированного аберрантного эпигенетического маркирования.

Радиационно-индуцированные изменения метилирования ДНК как проявления “эффекта свидетеля”. Имеются данные, свидетельствующие о сопряженности эпигенетических нарушений с индукцией “эффекта свидетеля” на уровне организма in vivo. Так, показано, что после локального воздействия рентгеновского излучения на область черепа крыс в дозе 20 Гр (терапевтическая доза при лечении опухолей головного мозга) индуцируется “эффект свидетеля” в необлученной селезенке (свинцовая защита) этих же животных, сопряженный с существенной дисрегуляцией эпигенетических механизмов, о чем свидетельствуют изменения ряда показателей, выявляемые даже через 7 мес. после облучения: глобальное ДНК гипометилирование, изменения в метилировании LINE-1 повторов и области ретротранспозонов, снижение экспрессии ДНК-метилтрансфераз и метил-CpG-связывающего протеина MeCP2. Кроме того, выявлены значительные изменения в экспрессии miR-194, мишенью которых являются как ДНК-метилтрансфераза DNMT3А, так и MeCP2. Этими же авторами показана значимость пола особи в индукции “байстендер эффектов” (повреждения ДНК, изменения клеточной пролиферации и апоптоза, глобального метилирования ДНК) в необлученной селезенке у мышей, подвергшихся радиационному воздействию на область головы [109, 110].

Проведено моделирование “эффекта свидетеля” на лабораторных животных (мыши C57BL/6), которые подверглись острому (0, 5 Гр) или фракционированному (0, 1 Гр/день, 5 дней) воздействию рентгеновских лучей, при этом рассматривались два варианта эксперимента: облучение всего тела и локальное облучение черепа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что как фракционированное, так и острое облучение вызывают “эффект свидетеля” в необлученных селезенке и коже, однако его эпигенетические проявления (гипометилирование ДНК, снижение экспрессии метил-CpG-связывающего протеина MeCP2, изменение спектра микроРНК) в коже и селезенке были различными. Так, только в селезенке они наблюдались даже через 14 дней после облучения [111].

Показано, что хотя через 4 дня после облучения у мышей только одной половины тела (Х-лучи, 1 Гр, 2 сГр/с) в клетках облученной и необлученной кожи (свинцовая защита) уровень разрывов ДНК достиг контрольного уровня, в “байстэндер” клетках сохраняются изменения, характеризующиеся дисрегуляторными процессами в метилировании ДНК, а именно сверхэкспрессирована ДНК-метилтрансфераза DNMT1, а уровни метил-CpG-связывающих протеинов MeCP2 и MBD2 значительно повышены, что не отмечено для облученных клеток [112] .

В целом эпигенетические изменения, характерные для “эффекта свидетеля”, зависят от анализируемого органа, мощности дозы, области тела, подвергшейся облучению. Эта проблема является крайне важной и должна учитываться при разработке стратегии и тактики радиотерапии злокачественных опухолей и последующих лечебно-диагностических мероприятий с целью минимизации риска развития побочных эффектов в здоровых тканях организма.