Растительные ресурсы, 2020, T. 56, № 4, стр. 351-362
Фитохимическое исследование различных фракций семян Salvia hispanica (Lamiaceae)
А. С. Панова 1, Д. С. Дергачёв 2, М. А. Суботялов 1, 3, *
1 Новосибирский государственный педагогический университет
г. Новосибирск, Россия
2 ООО “Медицинские Системы”
г. Санкт-Петербург, Россия
3 Новосибирский государственный университет
г. Новосибирск, Россия
* E-mail: subotyalov@yandex.ru
Поступила в редакцию 26.02.2020
После доработки 10.05.2020
Принята к публикации 10.06.2020
Аннотация
Salvia hispanica (шалфей испанский, или чиа) – однолетнее травянистое растение, принадлежащее к сем. Яснотковые (Lamiaceae). Исследования по всему миру изучают преимущества использования семян чиа в медицинской, фармацевтической и пищевой промышленности. Цель настоящей работы – изучение компонентного состава различных фракций семян S. hispanica и профилей входящих в них основных классов биологически активных веществ. Объектами исследования являлись образцы, полученные в результате холодного отжима семян шалфея испанского (масло, отжим, шрот). Проведенное исследование показало, что масло S. hispanica и сопутствующие продукты содержат набор биологически значимых веществ, который включает белки, аминокислоты, липиды и полифенольные соединения. Масло и отжим состоят, в основном, из чистых или смешанных триглицеридов линоленовой и линолевой кислот. Белки, аминокислоты и глицерофосфолипиды локализованы преимущественно в отжиме и шроте. Представители класса полифенольных соединений распределены в исследованных образцах достаточно равномерно.
Шалфей испанский Salvia hispanica L., также известный как чиа, является однолетним травянистым растением, родом из Южной Мексики и Северной Гватемалы. Принадлежит к сем. Яснотковые (Lamiaceae), или Губоцветные (Labiatae), роду Шалфей (Salvia). Род Salvia состоит из приблизительно 900 видов, которые в течение тысячелетий широко распространялись в нескольких регионах мира, включая Южную Африку, Центральную Америку, Северную и Южную Америку и Юго-Восточную Азию. Чиа культивировалась месопотамскими культурами, была одним из важнейших компонентов рациона майя и ацтеков [1], но затем исчезла на столетия до середины XX в., когда она была вновь открыта. Сегодня S. hispanica культивируется не только в Мексике и Гватемале, но и в Австралии, Боливии, Колумбии, Перу, Аргентине, Америке и Европе. В настоящее время Мексика признана крупнейшим в мире производителем чиа [2 ] .
Семена шалфея испанского характеризуются высоким содержанием пищевых волокон и белков, богатых многими экзогенными аминокислотами. Кроме того, семена чиа характеризуются высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, относящихся к группе ω-3 жирных кислот, в основном α-линоленовой кислоты. Эти семена также являются хорошим источником многих минералов и витаминов (А, В1, В2 и В3), а также биоактивных соединений с высокой антиоксидантной активностью, особенно полифенолов, токоферолов и флавоноидов, таких как хлорогеновая и кофейная кислоты, кверцетин, кемпферол и т.д. [3, 4 ] .
В последние годы семена чиа стали одним из самых узнаваемых продуктов питания в мире благодаря своим питательным и лекарственным свойствам [2 ] . Пищевые и терапевтические свойства семян S. hispanica в настоящее время исследуются многими научными центрами.
Метаболизм глюкозы и липидный профиль
Многочисленные исследования показали, что чиа и его производные восстанавливают сниженную чувствительность клеток к инсулину, вызванную ожирением [5 ] , способствуют снижению уровня глюкозы в крови и дискретному снижению веса [6 ] , а также увеличению выносливости у бегунов на длинные дистанции [7 ] .
Исследование, проведенное на инсулинорезистентных (IR) крысах с дислепидемией, получавших рацион, богатый сахарозой (SRD), показывают, что сердца крыс, получавших SRD, проявляют липотоксичность, что свидетельствует о нарушении утилизации липидов миокарда; по сравнению с группой SRD, чиа нормализует артериальное давление, а также улучшает, либо полностью устраняет липотоксичность сердца [8–10 ] . Показано снижение гипертрофии адипоцитов, улучшение активности липогенных ферментов, липолиза и антилиполитического действия инсулина, нормализация фосфорилирования и окисления глюкозы в хранилище липидов скелетных мышц [11 ] , изменение профиля фосфолипидов жирных кислот, уменьшение отложений коллагена в левом желудочке [12 ] .
Результаты исследования влияния шалфея испанского на массу тела, висцеральное ожирение и факторы риска, связанные с ожирением, у людей с избыточным весом и ожирением с диабетом II типа подтверждают полезную роль семян чиа в содействии снижению веса и уменьшению факторов риска, связанных с ожирением, при сохранении хорошего гликемического контроля. Чиа может быть полезным диетическим дополнением к традиционной терапии ожирения при диабете [13–15 ] .
Показано, что включение чиа в рационы пациентов с ожирением, страдающих дислипидемией и/или неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), а также неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ), может улучшить состояние их здоровья и предотвратить развитие цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) печени [16 ] .
Противовоспалительное и антиоксидантное действие
Такие экстрактивные компоненты в S. hispanica, как фенольные кислоты (розмариновая кислота, кофейная кислота, даншенсу, хлорогеновая кислота, кверцетин, мирицетин и кемпферол) и липофильные соединения (каротиноиды, токоферолы, фосфолипиды и α-липоевая кислота) связаны с антиоксидантными эффектами [5 ] . Потребление чиа взрослыми самками крыс, получавших рацион с высоким содержанием жиров, улучшало антиоксидантную активность за счет увеличения экспрессии супероксиддисмутазы и каталазы. Кроме того, потребление чиа снижало концентрации маркеров воспаления IL-1β, IL-6 и TNF-α и холестерола [17, 18 ] . Хотя антиоксидантная активность и количество фенольных соединений семян и масла чиа различны, исследования выявили сходные эффекты как семян, так и масла в модуляции окислительного стресса. Благоприятный эффект, продемонстрированный для обеих фракций, может быть обусловлен взаимодействием между химическими компонентами в семени и синергетической активностью между липофильными соединениями в масле чиа [5, 19 ] .
Результаты рандомизированного двойного слепого клинического исследования 30 детей с ожирением показывают, что семена чиа могут оказывать противовоспалительное действие [20 ] .
Разные фракции семян шалфея испанского приводят к различным эффектам. Так гидролизованные экстракты чиа обладают большим антиоксидантным действием. Также показано, что масло чиа действует быстрее, чем семена чиа, однако при этом следует соблюдать методы экстракции, чтобы избежать потерь в отношении антиоксидантных соединений. Показано, что масло чиа, полученное из жареных семян, имеет более низкое содержание α-, β-, γ-, δ-токоферолов, β и γ-токотриенолов. Последние данные показали, что тепло действует отрицательно на физико-химические и биоактивные свойства масла чиа [5 ] .
Кардиозащитные эффекты
Α-линоленовая кислота играет важную роль в образовании некоторых жизненно важных биохимических соединений, таких как лейкотриены и тромбоксаны, которые связаны с многочисленными физиологическими функциями в организме человека. Кроме того, ω-3 жирные кислоты обладают способностью блокировать дисфункции кальциевых и натриевых каналов, которые в противном случае могут привести к гипертонии, улучшать парасимпатический тонус и имеют антиаритмическое действие. Потребление муки чиа способно снизить артериальное давление у людей с гипертонической болезнью, причем, как у пациентов, ранее получавших лекарства, так и у тех, кто лекарства не принимал [22, 23 ] . Кроме того, употребление семян чиа во время беременности способствует развитию сетчатки и мозга плода [2, 21 ] .
Результаты исследований, проведенных на самцах крыс линии Wistar, показали, что кормление семенами чиа повышало полезный уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Кроме того, кормление семенами чиа приводило к снижению содержания ω-6 в плазме, что в результате приводило к снижению отношения ω-6 : ω-3 и оказывало последующее кардиозащитное действие [2 ] .
Прочие эффекты S. hispanica
Считается, что полифенолы и ω-3 жирные кислоты имеют терапевтический потенциал при болезни Альцгеймера. Однако известно, что добавление чиа, богатого данными соединениями, во время прогрессирования болезни Альцгеймера может усугубить течение данного заболевания [24 ] . Более поздние исследования показывают, что S. hispanica способствует улучшению памяти, а также проявляет антидепрессантную активность при хроническом введении [25 ] .
Показано увеличение концентрации IgE вследствие применения чиа в форме семян или масла в качестве источника ω-3 жирных кислот. Также известно, что местное применение 4% масла чиа улучшает гидратацию кожных покровов [21 ] . Известно, что шалфей испанский ингибирует рост и метастазирование аденокарциномы молочной железы мыши [26]. Однако на модели Walker 256 добавление муки чиа не предотвращало эффекты опухоли [27].
Таким образом, S. hispanica обладает биологически активным потенциалом, и его ежедневное употребление может снизить риск развития хронического заболевания, главным образом из-за антиоксидантного, противовоспалительного, гипогликемического и гиполипидемического эффектов семян. Потребление семян чиа может улучшить липидный профиль, толерантность к инсулину и глюкозе и снизить риск сердечно-сосудистых заболеваний.
Учитывая широкое распространение и применение шалфея испанского в научной и народной медицине, представляет интерес исследование компонентного состава различных производных данного растительного ресурса.
Цель работы – изучение компонентного состава различных фракций семян S. hispanica и профилей входящих в них основных классов биологически активных веществ.
МАТЕРИАЛ И АНАЛИТИЧЕСКОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
Объекты исследования
Исследованы три образца, обозначенные номерами “1”, “2” и “3”. Первый образец – прозрачная маслянистая жидкость желтого цвета – масло, полученное в результате холодного отжима из семян шалфея испанского. Второй образец – отжим, состоящий из двух несмешивающихся жидких фаз. При этом верхний слой по внешнему виду похож на образец 1. Третий образец – аморфное вещество черного цвета – является осадком, выделенным из отжима, шрот.
Страна-производитель: Аргентина. Физико-химические исследования образцов выполнены на базе ФГБУН “Институт токсикологии ФМБА России” в 2016 г.
Средства измерений
– Ультраэффективный жидкостный хроматограф Acquity UPLC H-class с тандемным масс-спектрометром Xevo TQD (Waters, США).
– Масс-спектрометр MALDI-TOF/TOF Ultraflex (Brucker, Германия).
– Хроматограф газовый GCMS-QP2010 Plus (Япония).
– Весы лабораторные электронные Adventurer AR 2140 (Ohaus, США) с погрешностью взвешивания 0.0001 г.
– Колбы мерные вместимостью 50, 100 и 1000 мл.
– Пипетки автоматические Proline (Biohit, Финляндия).
Вспомогательные устройства
– Комбинированная мембранная установка серии УВОИ-“М-Ф” для получения деионизированной воды (Медиана-Фильтр, Россия).
– Аппарат для встряхивания образцов (Chirana, Чехия).
– Центрифуга лабораторная, мод. ОПН-8УХЛ4.2 (Россия).
– Пробирки Vacuette, 9 мл.
Реактивы и материалы
– Ацетонитрил для хроматографии, сорт 0, ос. ч., (Криохром, Россия).
– Вода деионизированная, аналитической степени чистоты (не более 5 мкСим/см).
– Кислота трифторуксусная (Fluka, Швейцария).
– Метиленхлорид, х. ч., ТУ 2631-019-444931179-98.
– Метанол (Sigma-Aldrich, США).
– Гексан, ТУ 6-09-06-657-84.
– Нингидрин, х. ч., (Chemapol, Чехия).
– Фосфорно-молибденовая кислота ГОСТ Р 51018-97.
– Стандартный образец БСА (Sigma-Aldrich, США).
– Натрия гидроксид, х. ч., (Sigma-Aldrich, США).
– Фенилизотиоцианат (Fluka, Швейцария).
МЕТОДЫ АНАЛИЗА, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение суммарного содержания липидов
К навескам по 1 г образцов 1–3 прибавляли по 5 мл воды и хлористого метилена. Пробы встряхивали на аппарате в течение 20 мин, центрифугировали и отделяли органические слои. Экстракты хлористого метилена упаривали и остатки сушили в течение 3 ч при температуре 90 °С. Общее содержание липидов в образцах определяли с помощью гравиметрического анализа (табл. 1).
Таблица 1.
Суммарное содержание липидов в семенах Salvia hispanica Table 1. The total lipid content in seeds of Salvia hispanica
| № | Образец Sample |
Содержание липидов, % Lipid content, % |
|---|---|---|
| 1 | 1 | 97.5 |
| 2 | 2 (верх) 2 (top) |
98.7 |
| 3 | 2 (низ) 2 (bottom) |
66.5 |
| 4 | 3 | 2.3 |
Определение общего белка
Для определения содержания белка в образцах 1 и 2 (верх) отбирали по 1 мл водных экстрактов, полученных аналогично методике определения суммарного содержания липидов, и проводили анализ по методу Лоури [2811].
При анализе образцов 2 (низ) и 3 использовали другую процедуру подготовки проб в связи с их быстрым набуханием в воде. К навескам по 1 г прибавляли по 5 мл гексана, встряхивали на аппарате в течение 10 мин и центрифугировали. Удаляли количественно гексан и к остаткам прибавляли по 5 мл ацетонитрила и воды. Пробы встряхивали на аппарате в течение 1 ч, центрифугировали и отбирали по 100 мкл супернатантов для анализа по методу Лоури.
Количественный спектрофотометрический анализ производили методом внешнего стандарта, используя в качестве стандартного образца бычий сывороточный альбумин (табл. 2).
Таблица 2.
Определение общего белка в семенах Salvia hispanica по методу Лоури Table 2. Determination of total protein in seeds of Salvia hispanica by the Lowry assay
| № | Образец Sample |
Содержание белка, мг/г Protein content, mg/g |
|---|---|---|
| 1 | 1 | 0.04 |
| 2 | 2 (верх) 2 (top) |
0.105 |
| 3 | 2 (низ) 2 (bottom) |
33.90 |
| 4 | 3 | 41.30 |
Согласно литературным данным, содержание белка в семенах S. hispanica достигает 25% [29]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в процессе переработки белковые вещества локализуются преимущественно во 2-й и 3-й фракциях.
Определение свободных аминокислот методом ВЭЖХ-СФ
Качественные реакции с нингидрином показали, что аминокислоты присутствуют в нижнем слое образца 2 и в образце 3. Поэтому испытание проведено только для двух объектов исследования – отжима и шрота (табл. 3).
Таблица 3.
Содержание аминокислот в отжиме и шроте семян Salvia hispanica Table 3. Amino acid content in Salvia hispanica seed pulp and oil cake
| № | Аминокислота Amino acid |
Содержание, мг/г Content, mg/g |
|
|---|---|---|---|
| образец 2 (низ) sample 2 (bottom) |
образец 3 sample 3 |
||
| 1 | Серин + Аспарагин Serine + Asparagine |
– | 0.18 |
| 1 | Аргинин + Треонин Arginine + Threonine |
– | 2.41 |
| 2 | Тирозин Tyrosine |
0.57 | 0.91 |
| 3 | Валин Valine |
1.37 | 0.90 |
| 4 | Метионин Methionine |
– | 1.27 |
| 5 | Цистеин Cysteine |
0.23 | 0.52 |
| 6 | Изолейцин Isoleucine |
8.76 | 6.86 |
| 7 | Лейцин Leucine |
4.03 | 4.90 |
| 8 | Фенилаланин Phenylalanine |
0.52 | 0.37 |
| 9 | Триптофан Tryptophan |
0.26 | 0.32 |
| Итого: Total: |
15.74 | 18.64 | |
Подготовка проб: к навескам образцов (около 1.0 г) прибавляли по 5 мл гексана и встряхивали на аппарате в течение 15 мин. После центрифугирования гексановые экстракты, содержащие липофильные соединения, удалили, а к остаткам прибавили по 10 мл смеси ацетонитрила и 0.1 М раствора соляной кислоты в соотношении 50 : 50. Пробы встряхивали на аппарате в течение 1 ч и центрифугировали при 4000 об./мин в течение 10 мин. К аликвотам супернатантов по 10 мкл прибавляли по 15 мкл 0.1 М гидроксида натрия, 15 мкл ацетонитрила и 2 мкл фенилизотиоцианата. Пробы выдерживали при комнатной температуре в темном месте в течение 20 мин и упаривали досуха в высоком вакууме. Сухие остатки растворяли в 100 мкл водно-ацетонитрильной смеси в соотношении 19 : 1 и вводили в хроматограф.
Условия хроматографирования:
Колонка: Hypersil Gold aQ, заполненная октадецилсиликагелем (150 × 2.1) мм, 5 мкм;
Подвижная фаза: смесь 0.05% раствора трифторуксусной кислоты и ацетонитрила;
Градиент: увеличение доли ацетонитрила от 0 до 55% за 20 мин;
Скорость потока: 0.2 мл/мин;
Температура колонки: 40 °С;
Длина волны УФ-детектора: 254 нм;
Объем пробы: 10 мкл.
Данные таблицы показывают, что суммарное содержание аминокислот в отжиме и шроте примерно одинаковое и составляет 1.5–2.0%. Тем не менее, по разнообразию перечень идентифицированных соединений в образце 3 оказался более полным.
Количественный анализ, выполненный методом внешнего стандарта, свидетельствует о высокой степени совпадения концентраций отдельных аминокислот в двух образцах. Наиболее наглядно это проявляется в случае главных компонентов – лейцина и изолейцина.
Изучение образцов 1 и 2
Подготовка проб для анализа: навески испытуемых образцов по 0.05 г выдерживали в герметично закрытых сосудах с 2 мл метанола, насыщенного хлористым водородом, при температуре 80 °С в течение 1 ч. К реакционным массам прибавляли по 2 мл воды и по 2 мл гексана. Полученный гексановый экстракт сушили безводным сульфатом натрия, упаривали в токе азота до объема 50 мкл и использовали для анализа.
При изучении образца 2 исследовали по отдельности верхний и нижний слои.
Условия хроматографирования:
Капиллярная колонка: Ultra-2 (25 м × 0.2 мм);
Температура инжектора и детектора: 280 °С;
Начальная температура колонки: 160 °С (3 мин);
Скорость нагрева колонки: 4 °С/мин;
Конечная температура колонки: 280 °С (10 мин);
Газ-носитель: гелий, 0.9 мл/мин;
Деление потока: 1 : 50;
Объем пробы: 1 мкл.
Хроматограммы образцов регистрировали по полному ионному току в диапазоне масс от 35 до 450.
Обработка экспериментальных данных и идентификация компонентов пробы произведены с помощью программного обеспечения GCMSsolution, библиотеки масс-спектров NIST08 и на основании анализа спектральной информации.
Результаты количественной оценки содержания жирных кислот или их производных объединены в табл. 4.
Таблица 4.
Определение жирных кислот в масле и отжиме семян Salvia hispanica Table 4. Fatty acid composition of Salvia hispanica seed oil and pulp
| № | Время удерживания, мин Retention time, min |
Компонент Compound |
Содержание жирных кислот Fatty acid content, % |
||
|---|---|---|---|---|---|
| образец 1 sample 1 |
образец 2 (верх) sample 2 (top) |
образец 2 (низ) sample 2 (bottom) |
|||
| 1 | 12.497 | Гексадекановая кислота,
метиловый эфир Hexadecanoic acid, methyl ester |
9.82 | 9.97 | 9.09 |
| 2 | 16.023 | 9,12-октадекадиеновая кислота (Z,Z)-, метиловый эфир 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, methyl ester |
21.33 | 21.21 | 18.89 |
| 3 | 16.114 | 9,12,15-окстадекатриеновая кислота, метиловый эфир, (Z,Z,Z)- 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- |
53.22 | 55.34 | 58.24 |
| 4 | 16.210 | 9-октадеценовая кислота (Z)-, метиловый эфир 9-Octadecenoic acid (Z)-, methyl ester |
9.29 | 8.09 | 8.50 |
| 5 | 16.329 | Октадеценовая кислота,
метиловый эфир Octadecenoic acid, methyl ester |
1.44 | 0.99 | 0.96 |
| 6 | 16.843 | Октадеценовая кислота,
метиловый эфир Octadecanoic acid, methyl ester |
4.91 | 4.41 | 4.32 |
| Итого: Total: |
100.00 | 100.00 | 100.00 | ||
Полученные данные показывают, что в исследованных образцах присутствует один и тот же ограниченный набор из 6 жирных кислот с похожим распределением. Основным компонентом является α-линоленовая кислота (53–58%). Кроме того, обнаружены линолевая, пальмитиновая, олеиновая и стеариновая кислоты, а также изомер олеиновой кислоты. Перечень дан в порядке уменьшения относительного содержания компонентов.
Изучение образца 3
Подготовка пробы для анализа: к навеске 1 г образца 3 прибавляли 5 мл хлористого метилена и встряхивали на аппарате в течение 20 мин. Экстракт декантировали и упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в 100 мкл хлористого метилена.
Условия хроматографирования:
Капиллярная колонка: Ultra-2 (25 м × 0.2 мм);
Температура инжектора и детектора: 280 °С;
Начальная температура колонки: 50 °С (3 мин);
Скорость нагрева колонки: 10 °С/мин;
Конечная температура колонки: 280 °С (20 мин);
Газ-носитель: гелий, 1 мл/мин;
Деление потока: 1 : 20;
Объем пробы: 1 мкл.
Регистрация хроматограммы и обработка данных производились аналогично таковым при изучении образцов 1 и 2 (табл. 5).
Таблица 5.
Идентификация летучих компонентов в шроте семян Salvia hispanica Table 5. Identification of volatile components in the meal of seeds of Salvia hispanica
| № | Время удерживания, мин Retention time, min |
Компонент Compound |
% |
|---|---|---|---|
| 1 | 20.493 | н-гексадекановая кислота n-Hexadecanoic acid |
5.37 |
| 2 | 22.197 | 9,12,15-октадекатриеновая кислота 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (Z,Z,Z)- |
56.75 |
| 3 | 22.393 | Октадекановая кислота Octadecanoic acid |
1.53 |
| 4 | 26.490 | 9,12-октадекадиеновая кислота, 2,3-дигидроксипропиловый эфир 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, 2,3-dihydroxypropyl ester |
2.38 |
| 5 | 26.762 | Октадекановая кислота, 2,3-дигидроксипропиловый эфир Octadecanoic acid, 2,3-dihydroxypropyl ester |
0.32 |
| 6 | 30.834 | Гамма-токоферол Gamma-Tocopherol |
2.93 |
| 7 | 31.977 | Str MW = 396 | 1.07 |
| 8 | 34.206 | Эргоста-5-ен-3-ол, (3.бета)- Ergost-5-en-3-ol, (3.beta.)- |
3.07 |
| 9 | 34.913 | Стигмастерол Stigmasterol |
2.72 |
| 10 | 36.375 | Гамма-ситостерол Gamma-Sitosterol |
20.36 |
| 11 | 36.644 | Стигмаста-5,24(28)-диен-3-ол, (3.бета)- Stigmasta-5,24(28)-dien-3-ol, (3.beta.)- |
1.45 |
| 12 | 38.033 | 4,22-стигмастадиен-3-он 4,22-Stigmastadiene-3-one |
0.35 |
| 13 | 39.826 | Стигмаст-4-ен-3-он Stigmast-4-en-3-one |
1.23 |
| 14 | 40.023 | 9,19-циклоланостан-3-ол, 24-метилен-, (3.бета)- 9,19-Cyclolanostan-3-ol, 24-methylene-, (3.beta.)- |
0.47 |
| Итого: Total: |
100.00 |
Подобно образцам 1 и 2 в экстракте образца 3 также обнаружены предельные и непредельные жирные кислоты с числом атомов углерода 16 и 18 и преобладанием α-линоленовой кислоты. Кроме того, в пробе идентифицированы стероидные соединения: ситостерол (19.5%) и стигмастерол (2.6%) и ряд их производных, а также γ-токоферол (2.8%).
Масс-спектрометрическое исследование испытуемых образцов
В предыдущем разделе идентифицированы жирные кислоты, являющиеся структурными элементами липидов разных классов. Химическое строение их представителей в составе образцов 1–3 установлено с помощью метода МАЛДИ.
Подготовка проб: для испытаний готовили 0.4% растворы анализируемых веществ в ацетонитриле. При исследовании образца 2 состав каждой фракции изучали по отдельности.
Условия регистрации масс-спектров:
Матрица: диоксибензойная кислота;
Диапазон массовых чисел: 200–1500 Да;
Мощность лазера: 30%;
Число импульсов: 1500.
Идентификация соединений производилась по положительным ионам на основании результатов Milman et al. [30] и применения электронной базы LIPID MAPS [31]. При этом использованы данные высокого разрешения, полученные при внутренней калибровке прибора по массе с добавлением в анализируемые образцы смеси пептидов известного состава. В указанных условиях точность определения массы составляет 5–15 ppm (табл. 6, 7).
Таблица 6.
Идентификация жиров в масле и отжиме семян Salvia hispanica Table 6. Identification of fats in Salvia hispanica seed oil and pulp
| № | Масса иона Ion mass, m/z |
Брутто-формула Molecular formula |
Идентификация Identification |
|---|---|---|---|
| 1 | 895.7 | [C57H92O6 + Na]+ | Триглицерид, эфир линоленовой кислоты (18:3) Triglyceride, linolenic acid ester (18:3) |
| 2 | 897.7 | [C57H94O6 + Na]+ | Триглицерид, смешанный эфир линоленовой (два остатка) и линолевой кислот (18:2) Triglyceride, mixed ester of linolenic (two residues) and linoleic acids (18:2) |
| 3 | 911.7 | [C57H92O6 + K]+ | Триглицерид, эфир линоленовой кислоты Triglyceride, linolenic acid ester |
| 4 | 913.7 | [C57H94O6 + K]+ | Триглицерид, смешанный эфир линоленовой (два остатка) и линолевой кислот Triglyceride, mixed ester of linolenic (two residues) and linoleic acids |
| 5 | 915.7 | [C57H96O6 + K]+ | Триглицерид, смешанный эфир линоленовой (один остаток) и линолевой кислот Triglyceride, mixed ester of linolenic (one residue) and linoleic acids |
| 6 | 917.7 | [C57H98O6 + K]+ | Триглицерид, эфир линолевой кислоты Triglyceride, linoleic acid ester |
Таблица 7.
Идентификация глицерофосфолипидов в семенах Salvia hispanica Table 7. Identification of glycerophospholipids in Salvia hispanica seeds
| № | Масса иона Ion mass, m/z |
Брутто-формула Molecular formula |
Идентификация Identification |
|---|---|---|---|
| 1 | 496.5 | [С24H50NO7P + H]+ | Лизофосфатидилхолин, производное пальмитиновой кислоты (ЛФХ 16:0) Lysophosphatidylcholine, palmitic acid derivative (LPC 16:0) |
| 2 | 518.5 | [С26H48NO7P + H]+ | Лизофосфатидилхолин, производное линоленовой кислоты (ЛФХ 18:3) Lysophosphatidylcholine, linolenic acid derivative (LPC 18:3) |
| 3 | 520.5 | [С26H50NO7P + H]+ | Лизофосфатидилхолин, производное линолевой кислоты (ЛФХ 18:2) Lysophosphatidylcholine, linoleic acid derivative (LPC 18:2) |
| 4 | 522.5 | [С26H52NO7P + H]+ | Лизофосфатидилхолин, производное олеиновой кислоты (ЛФХ 18:1) Lysophosphatidylcholine, oleic acid derivative (LPC 18:1) |
| 5 | 556.3 | [С26H48NO7P + K]+ | Лизофосфатидилхолин, производное линоленовой кислоты (ЛФХ 18:3) Lysophosphatidylcholine, linolenic acid derivative (LPC 18:3) |
| 6 | 558.3 | [С26H50NO7P + K]+ | Лизофосфатидилхолин, производное линолевой кислоты (ЛФХ 18:2) Lysophosphatidylcholine, linoleic acid derivative (LPC 18:2) |
| 7 | 756.5 | [С42H78NO8P + H]+ | Фосфатидилхолин, производное пальмитиновой и линоленовой кислот (ФХ 16:0/18:3) Phosphatidylcholine, palmitic and linolenic acids derivative (PC 16:0/18:3) |
| 8 | 758.5 | [С42H80NO8P + H]+ | Фосфатидилхолин, производное пальмитиновой и линолевой кислот
(ФХ 16:0/18:2) Phosphatidylcholine, palmitic and linoleic acids derivative (PC 16:0/18:2) |
| 9 | 778.5 | [С44H76NO8P + H]+ | Фосфатидилхолин, производное линоленовой кислоты (ФХ 18:3/18:3) Phosphatidylcholine, linolenic acid derivative (PC 18:3/18:3) |
| 10 | 780.5 | [С44H78NO8P + H]+ | Фосфатидилхолин, производное линолевой и линоленовой кислот
(ФХ 18:2/18:3, ФХ 18:3/18:2) Phosphatidylcholine, linoleic and linolenic acids derivative (PC 18:2/18:3, PC 18:3/18:2) |
| 11 | 782.5 | [С44H80NO8P + H]+ | Фосфатидилхолин, производное олеиновой и линоленовой кислот
(ФХ 18:1/18:3, ФХ 18:3/18:1) и линолевой кислоты (ФХ 18:2/18:2) Phosphatidylcholine, oleic and linolenic (PC 18:1/18:3, PC 18:3/18:1) and linoleic acids derivative (PC 18:2/18:2) |
| 12 | 816.5 | [С44H76NO8P + K]+ | Фосфатидилхолин, производное линоленовой кислоты (ФХ 18:3/18:3) Phosphatidylcholine, linolenic acid derivative (PC 18:3/18:3) |
| 13 | 818.5 | [С44H78NO8P + K]+ | Фосфатидилхолин, производное линолевой и линоленовой кислот
(ФХ 18:2/18:3, ФХ 18:3/18:2) Phosphatidylcholine, linoleic and linolenic acids derivative (PC 18:2/18:3, PC 18:3/18:2) |
| 14 | 820.5 | [С44H80NO8P + K]+ | Фосфатидилхолин, производное олеиновой и линоленовой кислот
(ФХ 18:1/18:3, ФХ 18:3/18:1) и линолевой кислоты (ФХ 18:2/18:2) Phosphatidylcholine, oleic and linolenic (PC 18:1/18:3, PC 18:3/18:1) and linoleic acids derivative (PC 18:2/18:2) |
Экспериментальные данные позволяют отметить следующее:
1. Триглицериды детектируются в образце 1 и в обеих фракциях образца 2 в виде комплексов с ионами Na+ и K+. Во всех случаях идентифицирован один и тот же набор из 6 производных, состоящий из чистых или смешанных триглицеридов линоленовой и линолевой кислот. Постоянным источником ионов щелочных металлов могут быть минорные примеси соответствующих солей в растворителях и в самом масле, а также стеклянная посуда.
2. Другие липиды в процессе переработки попадают исключительно в отжим (фосфатидилхолины) или шрот (лизо- и фосфатидилхолины), что, вероятно, объясняется их цвиттер-ионной природой. Всего в пробах идентифицировано 14 глицерофосфолипидов, представляющих всевозможные комбинации четырех главных жирных кислот, обнаруженных при анализе методом ГЖХ-МС. Количественную оценку распределения жиров по классам можно сделать, используя данные таблицы 1. Они показывают, что основная масса на 97–98% состоит из триглицеридов, а совокупное содержание глицерофосфолипидов составляет около 2%.
Следует отметить хорошее совпадение результатов исследования, по составу жирнокислотных остатков в испытуемых образцах, полученных методами ГЖХ и масс-спектрометрии.
Определение полифенольных соединений
Все испытуемые образцы дают положительную качественную реакцию на фенолы c фосфорномолибденовой кислотой [3222]. Идентификация соединений этого класса произведена с помощью прямого масс-спектрометрического анализа метанольных экстрактов образцов в нижеуказанных условиях:
– температура ионного источника: 125 °С;
– температура десольватации: 550 °С;
– расход газа (азот): 500 л/час;
– напряжение на источнике: 1 kV.
Подготовка проб из образцов 1 и 2 (верх): к навескам по 1 г прибавляли по 1 мл гексана и 10 мл метанола, встряхивали на аппарате в течение 3 ч и центрифугировали. Метанольный экстракт отделяли и вспрыскивали непосредственно в масс-детектор.
Подготовка проб из образцов 2 (низ) и 3: к навескам по 1 г прибавляли по 5 мл гексана, экстрагировали на аппарате в течение 15 мин и центрифугировали. Гексановые слои количественно отделяли и отбрасывали. К остаткам прибавляли по 10 мл метанола и пробы встряхивали на аппарате в течение 3 ч. Полученные супернатанты вводили в масс-детектор. Идентификация фенольных производных произведена по массам молекулярных ионов и с помощью литературных данных [29]. Результаты анализа приведены в табл. 8.
Таблица 8.
Определение полифенольных соединений в семенах Salvia hispanica Table 8. Determination of polyphenolic compounds in Salvia hispanica seeds
| № | Соединение Compound |
Брутто-формула Molecular formula |
m/z [M-H]– |
Результаты идентификации Identified |
|||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| обр. 1 sample 1 |
обр. 2 (верх) sample 2 (top) |
обр. 2 (низ) sample 2 (bottom) |
обр. 3 sample 3 |
||||
| 1 | Кемпферол Kaempferol |
С15Н10О6 | 285 | + | |||
| 2 | Кверцетин Quercetin |
С15Н10О7 | 301 | + | + | + | |
| 3 | Мирицетин Myricetin |
С15Н10О8 | 317 | + | + | ||
| 4 | Хлорогеновая кислота Chlorogenic acid |
С16Н18О9 | 353 | + | + | + | |
| 5 | Олеуропеин агликон Oleuropeinaglycon |
С19Н22О8 | 377 | + | + | + | |
Для количественной оценки содержания отдельных производных фенола в испытуемых образцах необходимо располагать аналитическими стандартами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование показало, что масло Salvia hispanica и сопутствующие продукты содержат набор биологически значимых веществ, который включает белки, аминокислоты, липиды и полифенольные соединения. Распределение указанных классов характеризуется следующими тенденциями:
1. Масло и отжим семян S. hispanica состоят, в основном, из чистых или смешанных триглицеридов линоленовой и линолевой кислот.
2. Ионогенные биологически активные компоненты (белки, аминокислоты и глицерофосфолипиды) локализованы преимущественно в отжиме и шроте.
3. Представители класса полифенольных соединений распределены в исследованных образцах достаточно равномерно.
Биологическая роль производных фенола, вероятно, связана с их антиоксидантной активностью, способствующей снижению уровня продуктов автоокисления липидов.
Список литературы
Cм. REFERENCES
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Растительные ресурсы
Пн.-пт.: 10.00-19.00