Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105, № 10, стр. 1262-1270

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты на изолированном препарате кожно-грудинной мышцы озерной лягушки Rana ridibunda проводили в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. В каждой серии экспериментов использовали 3–5 животных, у которых анализировали 1–3 синапса. Выделение препарата и процесс очистки мышцы от соединительной ткани производили в растворе Рингера следующего состава (мМ): NaCl – 113.0, KCl – 2.5, NaHCO₃ – 3.0, CaCl₂ – 1.8; pH раствора поддерживали на уровне 7.2–7.4.

Выделенный препарат кожно-грудинной мышцы с фрагментом нерва помещали в чашку Петри для загрузки флуоресцентного кальциевого красителя. На короткий отрезок нерва длиной 2–3 мм помещали каплю краски Oregon Green 488 BAPTA-1 Hexapotassium Salt, cell impermeant в концентрации 50 мМ объемом 0.1–0.3 мкл, после чего производили инкубацию препарата в два этапа. На первом этапе выдерживали препарат в растворе Рингера в условиях комнатной температуры в течение 4–6 ч во влажной камере. На втором – 15–20 ч в холодильнике при температуре 8 ± 2°C. На этом этапе отмывался краситель, попадающий на препарат снаружи, и загрузка кальциевого красителя происходила за счет диффузии и антероградного аксонного транспорта [20–22]. При таком способе загрузки непроникающий сквозь клеточную мембрану краситель загружается только в цитозоль нервного окончания, что позволяет регистрировать кальциевые сигналы только от пресинаптической нервной клетки. После загрузки флуоресцентного красителя в нервные терминали, препарат помещали в ванночку объемом 5 мл, через которую протекал перфузионный раствор Рингера с пониженным содержанием Са²⁺ и повышенным Mg²⁺ (мМ): NaCl – 113.0, KCl – 2.5, NaHCO₃ – 3.0, MgCl₂ – 6.0, CaCl₂ – 0.9 (pH 7.2–7.4, температура 20.0 ± 0.5°C). При освещении препарата монохроматическим светом с длиной волны 488 нм, возбуждающей краситель, производили регистрацию увеличения свечения в ответ на стимуляцию двигательного нерва прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой амплитуды и длительностью 0.2 мс. Выбирали терминали длиной не менее 100 мкм, проксимальным считали участок на расстоянии 30% длины всей терминали от окончания миелиновой оболочки нерва, дистальным – 30% от кончика терминали.

Для регистрации изменения флуоресцентного свечения красителя в терминали использовали высокоскоростную камеру Neuro CCD (Redshirt Imaging), которая позволяет локально оценивать низкоамплитудные быстрые кальциевые сигналы в различных участках нервной терминали. Амплитуду Са²⁺-транзиента оценивали как 100% × ΔF/F₀, где ΔF изменение интенсивности флуоресценции в ответ на стимуляцию относительно базовой флуоресценции F₀ без стимула [23].

Для оценки среднего квантового состава постсинаптических ответов осуществляли регистрацию внеклеточных токов нервного окончания и токов концевой пластинки при помощи стандартной микроэлектродной техники. Экстраклеточные микроэлектроды с диаметром кончика 2.5–3.5 мкМ, заполненные раствором Рингера или NaCl (0.5 мМ), имели сопротивление 1.0–1.5 МОм. Отведенные сигналы после фильтрации до 10 кГц усиливали и подавали на вход 16-ти разрядного АЦП, квантуя с интервалом 10 мкс. Регистрацию токов проводили с использованием раствора Рингера с пониженным содержанием Ca²⁺ (мМ): NaCl – 113.0, KCl – 2.5, NaHCO₃ – 3.0, MgCl₂ – 4.0, CaCl₂ – 0.3. Средний квантовый состав токов концевой пластинки оценивали методом “выпадений” [24].

В экспериментах были использованы следующие вещества (все фирмы Sigma): конотоксин GVIA, нитрендипин, ибериотоксин, д-тубокурарин. Поскольку некоторые реактивы растворялись в ДМСО (диметилсульфоксид), конечная концентрация которого в растворе не превышала 0.1%, то предварительно были проведены эксперименты по анализу эффектов растворителя на исследуемые процессы. Было показано, что на протяжении более 2-х ч регистрации ДMСO не оказывал достоверно значимого влияния на амплитуду Ca²⁺-транзиента.

Для статистической обработки экспериментально полученных сигналов Ca²⁺-транзиента использовали стандартные методы определения средних величин, стандартных ошибок, параметрический t-критерий Стьюдента для попарно связанных вариант и критерий Манна–Уитни. Достоверность различия средних значений определяли при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В контрольных условиях амплитуда Ca²⁺-транзиента снижалась по мере удаления от проксимального к дистальному участку на 39.9 ± 5.6% (n = 22, p < 0.05). Величина квантового состава в контроле составила 0.45 ± 0.06 (n = 10) в проксимальной части и 0.31 ± 0.09 (n = 7) – в дистальной.

При деполяризации нервного окончания происходит увеличение вероятности открытия кальциевых каналов [1]. Можно ожидать, что в различных участках терминали деполяризация приведет к изменению транзиента в разной степени вследствие особенностей разных участков – различные диаметры поперечного сечения терминали, количество активных зон секреции в каждом участке, разная плотность и проводимость потенциал-зависимых ионных каналов, участие кальциевых каналов разных типов, различия в функционировании активных зон секреции. Повышение внеклеточной концентрации калия вызывало уменьшение мембранного потенциала клетки [25]. При увеличении концентрации ионов калия в омывающем препарат растворе от 2.5 до 10 мМ, амплитуда Ca²⁺-транзиента увеличивалась в равной мере в проксимальной части – на 16.7 ± 3.5% (n = 7, p < 0.05), и в дистальной – на 16.6 ± 2.2% (n = 6, p < 0.05) (рис. 1А, Б, рис. 2), что указывает на одинаковый прирост концентрации Са²⁺ и, равное количество дополнительно открывшихся кальциевых каналов в проксимальном и дистальном участках терминали.

Рис. 1.

Ca²⁺-транзиент в проксимальной и дистальной частях нервного окончания в контроле и в присутствии повышенной до 10 мМ концентрации ионов K⁺ (А и Б), конотоксина (В и Г), нитрендипина (Д и Е), ибериотоксина (Ж и З).

Рис. 2.

Изменения амплитуды Ca²⁺-транзиента по отношению к контролю (принят за 1), измеренные в проксимальной и дистальной частях нервного окончания под действием блокаторов N-типа кальциевых каналов (конотоксин), L-типа кальциевых каналов (нитрендипин), при увеличенной до 10 мМ концентрации ионов K⁺ и под действием ибериотоксина.

Основным типом кальциевых каналов, обеспечивающих вход кальция в нервное окончание лягушки после развития пресинаптического потенциала действия, являются потенциал-зависимые каналы N-типа [26]. Обработка нервно-мышечного препарата специфическим антагонистом кальциевых каналов N-типа конотоксином GVIA в концентрации 300 нМ приводила к снижению амплитуды Ca²⁺-транзиента в проксимальной части на 45.6 ± 7.2% (n = 7, p < 0.05), а в дистальной на 55.5 ± 3.9% (n = 6, p < 0.05) (рис. 1А, рис. 2А, Б), при этом достоверного различия в степени снижения кальциевого ответа в разных участках не наблюдалось. Под действием конотоксина GVIA квантовый состав достоверно снизился на 57.4 ± 5.2% (n = 11, p < 0.05) в проксимальной части и на 46.4 ± 8.8% (n = 7, p < 0.05) – в дистальной (рис. 1В, Г, рис. 2). Уменьшение среднего квантового состава под действием блокатора N-типа кальциевых каналов в проксимальном и дистальном участках синапса также не различалось достоверно.

Ранее нами установлено, что помимо основного N-типа кальциевых каналов, на нервных окончаниях лягушки находятся каналы L-типа [27]. Специфический блокатор кальциевых каналов L-типа нитрендипин в концентрации 5 мкМ снижал Ca²⁺-транзиент в проксимальной части на 16.2 ± 5.1% (n = 13, p < 0.05) и в дистальной на 11.7 ± 5.5% (n = 11, p < 0.05) по отношению к контролю, без достоверного отличия в разных участках (рис. 1Д, Е, рис. 2). В присутствии нитрендипина квантовый состав уменьшился относительно контрольной величины на 28.3 ± 4.9% (n = 13, p < 0.05) в проксимальной части и на 34.1 ± 3.2% (n = 12, p < 0.05) – в дистальной. Достоверного различия в эффектах нитрендипина на квантовый состав в разных частях нервной терминали также не наблюдалось.

Кальций-активируемые калиевые каналы нервного окончания участвуют в формировании амплитуды и длительности пресинаптического потенциала действия, и, вследствие этого, определяют уровень деполяризации пресинаптической мембраны [28]. Блокатор кальций-активируемых калиевых каналов ибериотоксин в концентрации 100 нМ мкМ не изменял Ca²⁺-транзиент в проксимальной части (–1.5 ± 1.2%, n = 17, p > 0.05) и достоверно увеличивал Ca²⁺-транзиент в дистальной части нервного окончания на 12.2 ± 4.1% (n = 17, p < 0.05) по отношению к контролю (рис. 1Ж, З, рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

По мере удлинения немиелинизированной части аксона наблюдается изменение параметров вызванного нервным импульсом освобождения квантов ацетилхолина в протяженных нервно-мышечных синапсах лягушки. Описано уменьшение интенсивности вызванной секреции квантов, оцениваемой по величине квантового состава [11, 13, 14], повышение степени синхронности секреции квантов [29], разная выраженность влияния физиологически активных соединений [29]. Поскольку ведущим звеном, запускающим процесс секреции квантов, является вход Ca²⁺ после развития потенциала действия [1, 30], естественно предположить, что именно этот фактор является основным в определении проксимо-дистального декремента параметров квантовой секреции. Действительно, при регистрации интенсивности свечения специфического кальций-чувствительного флуоресцентного красителя нами установлено, что по мере удаления от проксимальной части к дистальной вход кальция в нервное окончание в ответ на нервный импульс уменьшается [17, 18]. Это может быть связано с изменением плотности кальциевых каналов вдоль протяженной нервной терминали. Однако наши исследования иммунофлуоресцентным методом с использованием специфических антител к кальциевым каналам N- и L-типов [19], а также работа R. Robitaille с соавт. [31], показали, что кальциевые каналы равномерно распределены вдоль нервного окончания. Представленные в данном исследовании эксперименты показали, что величина кальциевого ответа уменьшается при блокировании кальциевых каналов N-типа конотоксином GVIA и нитрендипином – блокатором дигидропиридин-чувствительных каналов L-типа. Причем, эти эффекты в равной степени проявлялись и в проксимальной и в дистальной частях синапса. Дополнительная деполяризация нервного окончания при повышении внеклеточной концентрации калия приводила к увеличению амплитуды кальциевого ответа также в равной степени в разных участках. Блокада кальций-активируемых калиевых каналов ибериотоксином вызывала увеличение входа Ca²⁺ только в дистальной части терминали. Это указывает на то, что проксимо-дистальный декремент Ca²⁺-транзиента обусловлен неравномерным распределением потенциал-чувствительных и кальций-зависимых калиевых каналов. Изменение Ca²⁺-транзиента при блокировании каналов сопровождалось уменьшением числа освободившихся квантов в ответ на нервный импульс, одинаково проявляющимся в разных участках синапса. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что потенциал-зависимые кальциевые каналы N- и L-типов участвуют в реализации входа Ca²⁺ в двигательное нервное окончание лягушки, их активация приводит к повышению интенсивности вызванного нервным стимулом освобождения квантов ацетилхолина. Эти каналы в равной степени представлены в разных участках протяженной терминали, а их “прореживание” с помощью специфических каналоблокаторов приводит к снижению как входа Ca²⁺ в терминаль, так и уменьшению числа выделяющихся квантов медиатора в одинаковой мере в проксимальной и дистальной частях протяженного синаптического контакта. И только блокирование кальций-активируемых калиевых каналов выявило разницу в изменении входа кальция в нервное окончание. Возникает вопрос, в чем же причина наличия проксимо-дистального декремента амплитуды Ca²⁺-транзиента?

Как показали J.M. Pattillo с соавт. [32] и Dittrich с соавт. [33], существует зависимость между формой потенциала действия и пресинаптическим кальциевым током. Хорошо известно, что по мере удаления от проксимального отдела нервного окончания к дистальному изменяется форма потенциала действия [7]. Изменение формы электрических ответов вдоль нервного окончания на разных расстояниях от конца миелинизированной части нерва объясняется различным вкладом разных типов потенциал-зависимых каналов, распределенных по поверхности мембраны [7]. Установлено, что натриевые каналы присутствуют с наибольшей плотностью в проксимальной части каждой терминальной ветви и почти не детектируемы в дистальной части. Kалиевые каналы с более высокой плотностью расположены в средних частях нервного окончания [7]. Таким образом, по-видимому, разная степень активности или разное число натриевых и калиевых каналов обеспечивает разный уровень деполяризации в разных участках и определяет наличие проксимо-дистального декремента Ca²⁺-транзиента. Нельзя также исключить вклада изменения размера и архитектуры активных зон секреции вдоль уменьшающегося по диаметру нервного окончания [7].

Таким образом, проведенное исследование показало, что при равномерной плотности распределения потенциал-зависимых кальциевых каналов вдоль протяженного нервного окончания в синапсе лягушки проксимо-дистальный декремент Ca²⁺-транзиента и интенсивности квантовой секреции сохраняется при дополнительном открывании кальциевых каналов путем калиевой деполяризации, при прореживании этих каналов специфическими блокаторами, но изменяется при блокировании кальций-активируемых калиевых каналов, участвующих в формировании пресинаптического потенциала действия. Это указывает на важную роль параметров пресинаптического потенциала действия в обеспечении проксимо-дистального декремента входа кальция и квантовой секреции в нервно-мышечном синапсе лягушки.