Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105, № 10, стр. 1271-1282

Влияние блокатора Са²⁺-каналов L-типа нитрендипина на секрецию АХ в синапсах лягушки и мыши при сниженном уровне Са²⁺ в среде

При сниженной до 0.3 мМ концентрации Са²⁺ средний квантовый состав ТКП составил 0.49 ± 0.07 в синапсах лягушки (n = 12) и 0.11 ± 0.02 (n = 7) в синапсах мыши. Длительность секреторного процесса (параметр P₉₀) составила соответственно 1.43 ± 0.09 и 3.6 ± 0.6 мс. На рис. 1 представлены типичные токи нервного окончания и одноквантовые ТКП, зарегистрированные в синапсах лягушки и мыши в интактных препаратах.

Рис. 1.

Суперпозиция токов действия нервного окончания и одноквантовых токов концевой пластинки (ТКП) в ответ на стимуляцию двигательного нерва с частотой 0.5 имп/с, зарегистрированных экстраклеточно в одном из типичных экспериментов на нервно-мышечном препарате лягушки (А) и мыши (Б) в условиях сниженной до 0.3 мМ концентрации Са²⁺.

Как и в предыдущих наших работах [4, 7, 8], блокада Са²⁺-каналов L-типа нитрендипином (5 мкМ) в синапсах лягушки вызывала достоверное обратимое снижение интенсивности секреции АХ: на 24.5 ± 3.4% (p < 0.05, n = 12) и синхронизировала секреторный процесс, о чем свидетельствует уменьшение параметра P₉₀ до 84.5 ± 5.3% (p < 0.05, n = 12) от контрольных значений. То есть вход Са²⁺ через каналы L-типа способствует освобождению квантов АХ с длительными синаптическими задержками.

В синапсах мыши аппликация нитрендипина даже в большей концентрации (10 мкМ) не вызывала достоверных изменений квантового состава ТКП, но приводила к небольшой синхронизации секреции на 12.1 ± 4.0% (p < 0.05, n = 7, рис. 2А), что согласуется с ранее полученными данными [7]. Аналогичные результаты об отсутствии эффектов блокады каналов L-типа на квантовый состав постсинаптических ответов в интактных препаратах теплокровных были получены и другими исследователями [6, 14, 26].

Рис. 2.

А–Б. Относительное изменение квантового состава ТКП (светло-серые столбцы) и параметра P₉₀ (темно-серые столбцы) под действием нитрендипина в препаратах с интактными K⁺-каналами (А) и после их предварительной инактивации 4-АП (Б). n = 8–11 для каждой экспериментальной серии. * p < 0.05. За 100% приняты значения квантового состава ТКП и параметра P₉₀ до аппликации нитрендипина. В–Г. Нормированные кумулятивные кривые истинных синаптических задержек ТКП, зарегистрированных в типичных экспериментах в синапсах лягушки (В) и мыши (Г). Показаны изменения распределений синаптических задержек в контроле (сплошные линии), в присутствии 4-АП (штриховые линии) и в присутствии 4-АП и нитрендипина (пунктирные линии). n = 200–300 ТКП, зарегистрированных в одной концевой пластинке.

Блокатор потенциал-активируемых K⁺-каналов 4-АП (1 мкМ) в условиях сниженного уровня Са²⁺ вызывал увеличение квантового состава ТКП в синапсах лягушки (на 173 ± 34%), а также синхронизировал секрецию АХ – параметр P₉₀ снижался в среднем на 24 ± 9% (n = 8, p < 0.05, рис. 2В). Аналогичные результаты были получены и для синапсов мыши (4-АП, 5 мкМ): квантовый состав ТКП увеличивался на 238 ± 66%, а параметр P₉₀ снижался в среднем на 40 ± 19% (n = 7, p < 0.05, рис. 2Г). Увеличение квантового освобождения АХ связано, по-видимому, с повышенной вероятностью активации Са²⁺-каналов при продолжительной деполяризации нервного окончания в условиях блокады калиевых каналов [27]. Известно, что 4-АП может напрямую активировать высокопороговые Са²⁺-каналы [28], однако этот эффект проявляется явно лишь при высоких (0.1 мМ и выше) концентрациях этого соединения. Изменение синхронности секреции АХ в присутствии 4-АП можно объяснить увеличением входа в нервное окончание Са²⁺, что, как было показано ранее [29], синхронизирует процесс секреции нейромедиатора.

Блокада Са²⁺-каналов L-типа нитрендипином в присутствии 4-АП приводила к различным изменениям параметров секреции АХ в синапсах лягушки и мыши. Так, в синапсах мыши под воздействием нитрендипина наблюдалось существенное снижение квантовой секреции ацетилхолина (на 37 ± 12%, n = 8, p < 0.05), которого не было в препаратах с активными K⁺-каналами (рис. 2Б). То есть можно предположить, что в нервно-мышечных синапсах мыши увеличение квантового состава ТКП в присутствии 4-АП обусловлено в значительной степени вовлечением в секреторный процесс Са²⁺-каналов L-типа. Интересно отметить, что в нервно-мышечных контактах мыши аппликация нитрендипина после предварительной блокады К⁺-каналов приводила к десинхронизации секреции (увеличение параметра P₉₀ на 84 ± 27% по сравнению с уровнем в 4-АП, n = 8, p < 0.05, рис. 2Г), вероятно обусловленную снижением входа Са²⁺ в нервное окончание через Са²⁺-каналы L-типа.

В синапсах лягушки аппликация нитрендипина в условиях блокады потенциал-чувствительных K⁺-каналов 4-АП также вызывала снижение квантового состава ТКП, однако это снижение было достоверно меньше, чем в препаратах с интактными K⁺-каналами (на 13.0 ± 2.1%, p < 0.05, критерий Манна–Уитни, df = 17). Изменение степени синхронности секреции АХ после блокады Са²⁺-каналов L-типа в синапсах лягушки было одинаковым при активных и инактивированных K⁺-каналах.

Влияние блокатора Са²⁺-каналов L-типа нитрендипина на секрецию АХ в синапсах лягушки при физиологическом уровне Са²⁺ в среде

Чтобы оценить вклад каналов L-типа в вызванную секрецию АХ в условиях физиологического уровня Са²⁺ в синапсах лягушки, были проведены эксперименты по регистрации многоквантовых ТКП и МТКП методом фиксации мембранного потенциала мышечного волокна.

Эксперименты показали, что при физиологическом уровне Ca²⁺ нитрендипин (5 мкМ) не оказывал достоверного влияния на параметры ТКП и МТКП. Так, амплитуда ТКП в контроле составила 354 ± 81 нА, а в присутствии нитрендипина – 353 ± 91 нА (p > 0.05, n = 6). Временные параметры ТКП тоже достоверно не менялись: время роста составило 265 ± 15 и 287 ± 31 мкс соответственно, а постоянная времени спада 1.29 ± 0.19 и 1.34 ± 0.18 мс. Амплитуда миниатюрных ТКП также не претерпевала достоверных изменений в присутствии нитрендипина: амплитуда МТКП составила, соответственно, 4.2 ± 0.3 и 4.4 ± 0.4 нА (p > 0.05, n = 6).

Аппликация 4-АП (1 мкМ) вызывала достоверное увеличение амплитуды ТКП (на 29 ± 9%, p < 0.05, n = 6), что согласуется с данными других авторов [16, 30–32], не оказывая влияния на временные параметры многоквантовых ответов и амплитудно-временные характеристики МТКП. Однако после предварительной блокады потенциал-зависимых K⁺-каналов 4-АП нитрендипин достоверно снижал квантовый состава ТКП (на 20 ± 4%, p < 0,05, n = 5). Временные параметры ТКП и амплитудно-временные характеристики МТКП при этом также достоверно не менялись.

Таким образом, в условиях, близким к физиологическим, участие Са²⁺-каналов L-типа в вызванной секреции квантов АХ в нервно-мышечных контактах лягушки проявлялось только при инактивированных потенциал-зависимых K⁺-каналах, как и в синапсах мыши.

Влияние блокады Са²⁺-каналов L-типа на амплитуду кальциевого транзиента в синапсах лягушки при активных и инактивированных потенциал-зависимых K⁺-каналах.

На рис. 3 представлены кальциевые сигналы, зарегистрированные флуоресцентным методом в одном из характерных экспериментов.

Рис. 3.

Нитрендипин снижает амплитуду кальциевого транзиента при интактных (А) и при инактивированных 4-АП (Б) потенциал-зависимых K⁺-каналах. Представлено усреднение 40 сигналов, зарегистрированных в одном из типичных экспериментов на нервно-мышечном препарате лягушки. За 100% приняты значения амплитуды транзиента в контроле (А) и при блокировании К⁺-каналов (Б).

Измерение амплитуды кальциевого транзиента в нервном окончании лягушки в условиях нормального уровня Са²⁺ и при низкой частоте стимуляции нерва (0.5 имп/с) показало, что инактивация потенциал-чувствительных K⁺-каналов 4-АП (1 мкМ) приводит к увеличению величины кальциевого сигнала на 43 ± 15% (n = 8, p < 0.05) по сравнению с интактными препаратами.

Блокада Са²⁺-каналов L-типа нитрендипином (5 мкМ) после предварительной инкубации препарата с 4-АП приводила к достоверному снижению амплитуды кальциевого транзиента (на 15 ± 4%, p < 0.05, n = 11, рис. 3Б), но различие в действии нитрендипина при активных и инактивированных K⁺-каналах было недостоверным: при активных K⁺-каналах кальциевый транзиент также снижался на 19 ± 7% (p < 0.05, n = 12, рис. 3А), что согласуется с ранее полученными данными [33]. Следовательно, относительный вклад Са²⁺-каналов L-типа в общий кальциевый сигнал не зависит от активности потенциал-зависимых K⁺-каналов.

Различие между результатами электрофизиологических экспериментов и опытов по оптической регистрации кальциевых сигналов можно объяснить тем, что кальциевый транзиент отражает интегральное изменение уровня Са²⁺ во всем объеме нервного окончания в течение длительного периода времени (500–700 мс после стимуляции нерва). То есть Са²⁺-каналы L-типа могут вносить вклад в кальциевый метаболизм нервного окончания и при активных потенциал-зависимых K⁺-каналах, но их роль не ограничивается вкладом в вызванную квантовую секрецию, а может затрагивать и другие клеточные функции, такие как регуляция асинхронной и спонтанной секреции, выхода Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума, экспрессии генов и т.д. [34–36].

Компьютерное моделирование процесса экзоцитоза в нервно-мышечном синапсе лягушки

Особенностью Са²⁺-каналов L-типа является то, что они находятся в открытом состоянии существенно дольше, чем N- или P/Q-каналы, и расположены на удалении от активных зон, где происходит секреция квантов медиатора [37]. Для оценки возможного вклада такого типа каналов в вызванную секрецию медиатора в синапсе лягушки была адаптирована компьютерная модель по методу Монте-Карло, описанная ранее в ряде работ [22–25]. В модели рассматривается одна секреторная единица, состоящая из везикулы, готовой к освобождению медиатора, и двух Са²⁺-каналов, один из которых расположен в непосредственной близости от везикулы (20 нм, N‑тип), а другой – на значительном удалении (200 нм), и к тому же, дольше остается в открытом состоянии после активации (среднее время открытого состояния около 10 мс, L-тип). Потенциал нервного окончания симулировался в соответствии с модифицированной моделью Ходжкина–Хаксли [22]. Остальные параметры модели и геометрия активной зоны соответствуют используемым в работах [24, 25]. С помощью модели исследовали изменение концентрации ионов Са²⁺, поступающих в нервное окончание через оба Са²⁺-канала и их вклад в вероятность экзоцитоза при разной длительности деполяризации мембраны нервного окончания. В модели предусматривалось два варианта перехода везикулы к стадии экзоцитоза: (i) после связывания 4 ионов Са²⁺ с сенсором (со свойствами белка синаптотагмина 1, 2); (ii) при связывании 2 ионов Са²⁺ с дополнительным сенсором, расположенным на удалении (50 нМ) от Са²⁺-канала N-типа. Наличие нескольких Са²⁺-сенсоров с разными характеристиками, предположительно, разных изоформ белка синаптотагмина с разным сродством к Са²⁺, опосредующих разные формы секреции – синхронную и асинхронную, активно обсуждается в последнее десятилетие [38, 39]. В частности, предполагается, что в качестве Са²⁺-сенсора для асинхронного освобождения может выступать синаптотагмин 7 (SYT7), обладающий повышенным сродством к Са²⁺. Модель с двумя Са²⁺-сенсорами с разным количеством сайтов связывания Са²⁺ (соответственно, 5 и 2), описанная в работе [40], хорошо воспроизводила скорость освобождения медиатора в центральных синапсах при варьировании концентрации Ca²⁺.

В наших модельных экспериментах было показано, что при наличии только одного кальциевого сенсора, расположенного около канала N-типа, добавление еще одного Са²⁺-канала (L-типа) увеличивает вероятность секреции в одинаковой степени, независимо от длительности потенциала действия (на 12.7% и 14.8%, соответственно для активных и неактивных K⁺-каналов).

Симуляция процесса экзоцитоза с учетом дополнительного сенсора (рис. 4А, Б) более точно воспроизводит экспериментально полученные данные на синапсах лягушки в условиях сниженного уровня Са²⁺. Так, относительное изменение вероятности секреции при увеличении длительности пресинаптического спайка (симуляция блокады K⁺-каналов 4-АП) при отсутствии в модели Са²⁺-каналов L-типа оказалось меньше, чем при их учете в модели (на 56% по сравнению с 69%, рис. 4Б). То есть, наличие второго сенсора для Са²⁺, расположенного на удалении от основного Са²⁺-канала, наиболее значимо для секреторного процесса при наличии дополнительного источника Са²⁺ (например, вход ионов через Са²⁺-канал L-типа либо выход Са²⁺ из внутриклеточного кальциевого депо) и увеличении длительности деполяризации мембраны (то есть, при увеличении вероятности открывания Са²⁺-каналов).

Рис. 4.

Компьютерное моделирование процесса экзоцитоза в нервно-мышечном синапсе лягушки по методу Монте-Карло. А – Схематическое изображение взаимного расположения везикулы, Са²⁺-каналов разных типов (“N” и “L”) и кальциевых сенсоров (1 и 2) для двух использованных моделей. Б – Относительное изменение вероятности экзоцитоза при симуляции блокады K⁺- и Са²⁺-каналов L-типа. За 100% принята вероятность экзоцитоза для контрольного набора параметров.

Можно предположить, что в условиях сниженного уровня Са²⁺ экзоцитоз в синапсах лягушки может осуществляться с участием нескольких кальциевых сенсоров, расположенных на разных расстояниях от основного Са²⁺-канала (N-типа) и обладающих различной кальциевой чувствительностью.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что пресинаптические потенциал-зависимые Са²⁺-каналы L-типа могут регулировать освобождение АХ из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши, однако существуют особенности их вклада в вызванную нейросекрецию в разных экспериментальных условиях. Так в синапсах мыши участие Са²⁺-каналов L-типа в регуляции вызванной секреции АХ из двигательных нервных окончаний очевидно лишь в специфических условиях, например, при снижении концентрации Ca²⁺ в среде до 0.2 мМ, при использовании быстрых кальциевых буферов, блокаде BK-каналов [5, 7, 14, 15] или, как показано в данном исследовании, при блокаде потенциал-зависимых K⁺-каналов с помощью 4-АП. При этом если квантовый состав ТКП в присутствии нитрендипина снижался, то степень синхронности освобождения квантов АХ либо увеличивалась, либо уменьшалась, в зависимости от активности K⁺-каналов.

Интересно отметить, что ранее для синапсов мыши было показано прямое взаимодействие каналов L-типа с другими K⁺-каналами – Са²⁺-зависимыми K⁺-каналами большой проводимости [5, 15]. Инактивация этого типа K⁺-каналов ибериотоксином растормаживала каналы L-типа, что проявлялось как увеличение квантового состава ПКП. Существует ли подобное взаимодействие с другими типами K⁺-каналов, еще предстоит выяснить.

В синапсах лягушки Са²⁺-каналы L-типа вносят вклад в вызванную секрецию АХ в условиях сниженного уровня Са²⁺ в среде, но при физиологическом уровне Са²⁺ их участие в нейросекреции при низкой частоте раздражения нерва было очевидным лишь при инактивации потенциал-зависимых K⁺-каналов. Возможное объяснение более выраженного эффекта блокады этих каналов в условиях сниженного уровня Са²⁺ в среде может быть связано с тем, что в этих условиях даже небольшие вариации концентрации Ca²⁺ в области активной зоны могут приводить к значительному изменению вероятности освобождения везикул. Интересно отметить, что наблюдаемое в присутствии нитрендипина уменьшение дисперсии истинных синаптических задержек, то есть синхронизация секреторного процесса [7], в полной мере сохранялась и при инактивации потенциал-зависимых K⁺-каналов.

В физиологических условиях, вход Са²⁺ в нервное окончание через каналы L-типа также имеет место, что подтверждается результатами экспериментов по оптической регистрации интегрального кальциевого сигнала в нервном окончании (кальциевого транзиента). Но, по-видимому, наибольшее изменение внутриклеточного Са²⁺ при открывании каналов L-типа происходит уже после завершения синхронной фазы нейросекреции, определяющей параметры многоквантовых постсинаптических ответов.

Возможное различие в эффектах блокады Са²⁺-каналов L-типа в синапсах лягушки и мыши может отчасти быть связано и с разным субъединичным составом каналов L-типа в синапсах животных разных классов (Ca_V1.2, Ca_V1.3 или Ca_V1.4), например, с разной выраженностью их кальциевой инактивации [41].

В наших экспериментах при сниженном уровне Са²⁺ в синапсах лягушки, блокада Са²⁺-каналов L-типа приводила к достоверному снижению квантового состава ТКП и при активных K⁺-каналах, а при их инактивации эффект нитрендипина был, наоборот, менее выражен. Компьютерное моделирование процесса экзоцитоза для одной секреторной единицы показало возможность такого эффекта при увеличении длительности пресинаптического спайка при наличии на везикуле двух кальциевых сенсоров с разной удаленностью от Са²⁺-каналов и различным количеством мест связывания Са²⁺. Известно, что длительность потенциала действия аксона зависит от ряда эндогенных факторов – паттерна активности нейрона, аккумуляции нейромедиаторов в околосинаптической области и т.д. [42, 43]. Можно предположить, что участие Са²⁺-каналов L-типа в секреторном процессе, не столь очевидное при низкочастотном раздражении нерва, будет усиливаться в случае повышенной синаптической активности.