Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105, № 2, стр. 191-197

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось в соответствии с принципами Базельской декларации и рекомендациями межинститутской комиссии по биоэтике при Институте цитологии и генетики СО РАН. В экспериментах использовали почки взрослых самцов крыс линии Вистар и мышей линии C57bl/6 из вивария ИЦиГ СО РАН (RFMEFI61914X0005 и RFMEFI61914X0010). В работе использовали фрагменты CCD почек, полученные методом микродиссекции, как это описано ранее [1].

Изменение внутриклеточной концентрации натрия в главных клетках CCD проводили с помощью непрерывной регистрации флуоресценции Sodium Green при резком изменении содержания натрия в омывающей среде (137 и 14 мМ NaCl), как это нами описано ранее [1, 3]. Гипонатриевый раствор (14 мМ NaCl) готовили на основе PBS (Na⁺ 137 мМ), в котором часть натрия замещали 123 мM n-methyl-D-glucamine (NMDG). Альдостерон добавляли в омывающий раствор в концентрации 10 нM, смена омывающего раствора происходила в течение 100 мс. Изменения содержания внутриклеточного натрия выражали в относительных величинах флуоресценции внутриклеточного красителя Sodium Green. Непрерывную регистрацию флуоресценции Sodium Green производили с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 40 CFL (filter set #09, Zeiss, Германия). Измерения производили с помощью аналого-цифрового преобразователя Актаком АСК-3102 с записью на компьютер. Профили величин относительной флуоресценции (F/F0), отражающие процесс входа/выхода ионов натрия в клетку, аппроксимировали функцией экспоненциального распада первого порядка. Для оценки скорости изменения использовали параметр A1/t1, где A1 – амплитуда, t1 – характерное время. Статистическую обработку результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлена типичная кривая флуоресценции, которая отражает изменение внутриклеточного уровня ионов натрия ([Na⁺]i) в главных клетках CCD почки крысы в ответ на резкое изменение содержания натрия в омывающей среде ([Na⁺]_out). Снижение [Na⁺]_out с 137 до 14 мМ приводило к уменьшению относительного уровня флуоресценции в течение первых секунд, что хорошо совпадает с полученными нами ранее данными и соответствуют снижению уровня внутриклеточного натрия. Увеличение [Na⁺]_out с 14 до 137 мМ вызвало повышение внутриклеточного натрия практически к исходному уровню. В присутствии альдостерона (10 нМ) уровень внутриклеточного натрия падал не столь резко, как в контроле, что также подтверждает раннее полученные результаты [1–3, 6]. Нами было показано, что амилорид (10^–5 М), ингибитор эпителиального натриевого канала (ENaC), а также ингибиторы основных киназных каскадов, принимающих участие в регуляции активности ENaC, нивелируют данный негеномный эффект альдостерона в почках крыс [3, 6]. Эти данные свидетельствуют о важной роли эпителиального натриевого канала в реализации негеномного эффекта альдостерона у крыс. На рис. 2 представлена характерная кривая изменения относительной флуоресценции, отражающей содержание внутриклеточного натрия в главных клетках CCD почки мыши линии C57bl/6 в тех же условиях. Как видно из рисунка, в целом реакция главных клеток мышей похожа на таковую у крыс. Резкое падение уровня внеклеточного натрия в омывающей среде ведет к снижению его содержания в клетке, а повышение – к увеличению его уровня. Из сравнения профилей флуоресценции, отражающих вход натрия в клетку, можно видеть, что главные клетки мышей быстрее отвечают на изменение свойств омывающей жидкости и реакция на альдостерон в той же физиологической дозе 10нМ отличается от таковой у крыс (рис. 1 и 2). Поэтому мы более подробно исследовали сравнительную динамику роста уровня внутриклеточного натрия в главных клетках CCD крыс и мышей при резком изменении [Na⁺]_out в омывающей среде с 14 до 137 мМ. На рис. 3А и 3Б представлены характерные кривые изменения относительной флуоресценции Sodium Green в контроле и в присутствии альдостерона (10 нМ) у исследуемых видов животных. У крыс повышение [Na⁺]i как в контроле, так и в присутствии альдостерона происходит более медленными темпами, чем у мышей. У мышей негеномный эффект на альдостерон требует на свою реализацию гораздо меньше времени и также выражен некоторым снижением скорости роста внутриклеточного натрия при его резком увеличении во внешней среде (с 14 до 137 мМ NaCl).

Рис. 1.

Характерные профили относительной флуоресценции внутриклеточного красителя Sodium Green в главных клетках CCD почек крыс при резком изменении уровня натрия в омывающей среде со 137 до 14 мМ NaCl и со 14 до 137 мМ NaCl. Здесь и далее: по оси ординат – относительная флуоресценция (F/F0); по оси абсцисс – время в секундах.

Рис. 2.

Характерный профиль относительной флуоресценции внутриклеточного красителя Sodium Green в главных клетках CCD почек мышей линии C57bl/6 при резком изменении уровня натрия в омывающей среде со 137 до 14 мМ NaCl и с 14 до 137 мМ NaCl.

Рис. 3.

Характерные кривые изменения уровня [Na⁺]i в главных клетках крыс (А) и мышей (Б) при резком изменении содержания натрия в омывающей среде с 14 до 137 мМ. 1 – контроль; 2 – альдостерон (10 нМ).

В табл. 1 представлены обобщающие средние данные по кинетике входа ионов натрия в главные клетки крыс и мышей при резком его повышении в омывающей среде (14–137 мМ). Из представленных данных видно, что скорость входа натрия у мышей оказалась в 3 раза больше в контроле, а в присутствии альдостерона – почти в 10 раз выше чем у крыс (р < 0.001). Альдостерон (10 нМ) у мышей достоверно снижал скорость изменения внутриклеточного натрия, хотя и не так существенно, как у крыс (на 20 и 50% соответственно, р < 0.05). Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о значительных межвидовых различиях скорости изменения концентрации натрия в главных клетках эпителия собирательных трубок почки крыс и мышей при резком изменении уровня натрия в инкубационной среде как в контрольных условиях, так и при добавлении альдостерона.

Сопоставление полученных результатов с литературными сведениями в настоящее время позволяет высказать лишь некоторые гипотетические предположения о механизмах, лежащих в основе выявленных межвидовых различий. Так, большая скорость изменений внутриклеточного натрия у мышей может быть связана с более быстрым переходом натриевых каналов апикальной мембраны в открытое состояние под влиянием концентрационного градиента натрия или каскада киназ, реализующих негеномный эффект альдостерона. Известно, что для мелких животных характерна повышенная возбудимость и более быстрые реакции нейрогормональных механизмов регуляции клеточных функций по сравнению с крупными особями. Кроме того, установлено, что почки мышей и крыс с разной скоростью выводят органические осмолиты, что свидетельствует о различиях гормональной регуляции почечных транспортеров у этих двух видов [7, 9]. Обнаружены также межвидовые различия почечной кинетики гомологов органического катионного транспортера (OCT1) у мыши, крысы, кролика и человека. Предполагается, что они могут способствовать межвидовым особенностям метаболизма органических катионов, а также служить объяснением особенностей развития нефропатии у различных видов экспериментальных животных и человека [10–13].

Полученные в нашем исследовании данные свидетельствуют о значительных видовых различиях скорости реакции главных клеток CCD почек крыс и мышей в ответ на резкое изменение уровня натрия в омывающей среде. Можно предположить, что более быстрая негеномная реакция на альдостерон у мышей может иметь важное приспособительное значение при резких изменениях состава канальцевой среды и, в частности, может играть важную роль в видовых особенностях формирования почечных патологий.

Таким образом, нами впервые обнаружены видовые различия в кинетике реакции главных клеток CCD почек мышей и крыс на резкое изменение уровня натрия в омывающей среде и более выраженный негеномный эффект альдостерона на уровень внутриклеточного натрия у крыс. Возможно обнаруженная нами разница в реактивности главных клеток СCD у крыс и мышей свидетельствует о видовых различиях молекулярных механизмов реализации негеномных эффектов альдостерона. Полученные данные могут иметь важное значение для понимания видовых особенностей молекулярных механизмов развития почечных патологий при таких системных заболеваниях как гипертония, ожирение, метаболический синдром.