Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105, № 3, стр. 295-302

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на самцах крыс линии Вистар массой 250–350 г, которые содержались на стандартной диете в условиях вивария. Это исследование проводилось в соответствии с принципами Базельской декларации и рекомендациями биоэтического комитета Северо-Осетинского государственного университета. В одном эксперименте использовали одну-две крысы, которых декапитировали, извлекали почки, выделяли сосочковые зоны и измельчали их до кусочков объемом 1–3 мм³. Затем измельченные кусочки помещали в буфер, содержащий (мМ): 135 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1.2 MgSO₄, 2 NaH₂PO₄, 10 глюкозы, 10 трис-HCl (“Serva”, Германия), 10 HEPES (“Serva”, Германия), pH 7.4, и использовали для получения клеток почечного сосочка, ферментативного экстракта ГИАЛ1 межклеточного матрикса или для выделения клеток собирательных трубок.

Получение клеток почечного сосочка. Измельченные кусочки почечных сосочков, находящиеся в охлажденном буфере объемом 2 мл, помещали в устройство, состоящее из двух шприцов объемом 5 мл, соединенных друг с другом через иглу с внутренним диаметром 0.5 мм, и дезинтегрировали, прогоняя буфер с кусочками ткани из одного шприца в другой. Обычно 8–10 раз было достаточно для образования однородной суспензии. Затем суспензию фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мм и центрифугировали 5 мин при 50 g и 4°С. Супернатант отбирали и использовали для получения ферментативного экстракта ГИАЛ1, а полученный осадок переосаждали 3 раза в 1 мл буфера. Осадок, состоящий из клеточных конгломератов и канальцевых фрагментов, ресуспендировали в буфере до концентрации 3–5 мг/мл и использовали для выявления активности ГИАЛ1.

Получение ферментативного экстракта ГИАЛ1 межклеточного матрикса. Отобранный после первого центрифугирования супернатант еще раз центрифугировали 10 мин при 10 000 g и 4°С. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость считали ферментативным экстрактом ГИАЛ1 межклеточного матрикса и использовали для выявления гиалуронидазной активности.

Получение клеток собирательных трубок. Суспензию клеток собирательных трубок осуществляли по методу Стокса с некоторыми модификациями [11]. Измельченные кусочки ткани инкубировали при 37°С в буфере, содержащем 2 мг/мл коллагеназы (“Serva”, Германия) и 2 мг/мл гиалуронидазы. Для предотвращения агрегации частиц ткани в буфер через 30–45 мин инкубации добавляли ДНКазу (“Serva”, Германия) до конечной концентрации 0.001% и инкубировали еще 20–30 мин с периодическим аспирированием до исчезновения видимых кусочков ткани. Затем суспензию центрифугировали 3 мин при 50 g, супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 1 мл буфера, не содержащего ферментов, и снова центрифугировали. Процедуру повторяли трижды. Промытый осадок ресуспендировали в этом же буфере до концентрации 3–5 мг/мл и использовали для определения гиалуронидазной активности.

Зимография. Выявление белков с гиалуронидазной активностью осуществляли методом зимографии с импрегнированной в гель ГК. 50 мкл суспензии клеток собирательных трубок обрабатывали при частоте 40 кГц на ультразвуковом дезинтеграторе UD-11 (“Techpan”, Польша) 3 раза по 10 с с промежуточным охлаждением образцов во льду, после чего смешивали с эквивалентным объемом буфера, содержащего 4%-ный раствор додецилсульфата натрия без редуцирующего агента, и оставляли при комнатной температуре на один час. Бесклеточные ферментативные экстракты подвергали такой же процедуре, за исключением озвучивания. После инкубации к образцам добавляли бромфеноловый синий и глицерин до финальной концентрации 0.01 и 10% соответственно. Разделение белков проводили за счет диск-электрофореза в системе Лэммли, но без редуцирующего агента [12]. Аликвоты по 20–40 мкл, содержащих 30–50 мкг белка, наносили в карманы верхнего 4%-ного ПААГ и проводили электрофорез при 50 В, пока образцы не вошли в гель. Затем напряжение доводили до 110 В (20–25 мА) и разделяли белки в нижнем 7.5%-ном ПААГ с импрегнированной ГК (0.17 мг/мл) в течение 70 мин при температуре 4°С. После электрофореза гель отмывался 2.5%-ным раствором Тритона Х-100 в течение 80 мин при комнатной температуре и инкубировался в 0.1 М натрий-ацетатном буфере (рН 3.5) в течение 18 ч при температуре 37°С. Затем гель инкубировался в 20 мМ Трис-HCl буфере, содержащем 0.1 мг/мл проназы Е (Merck, Германия) при рН 8.0 в течение 2 ч при температуре 37°С. Для визуализации зон с гидролизованной ГК гель окрашивался 0.5%-ным раствором алцианового синего (“Panreac”, Испания). После обесцвечивания проводилось повторное окрашивание геля 0.1%-ным раствором кумасси бриллиантовый синий R-250 (“Serva”, Германия) c последующим обесцвечиванием. Количественные оценки гиалуронидазной активности полос и определение молекулярной массы делали, сканируя окрашенный гель на денситометре GS -900 с программным обеспечением Image Lab (“Bio-Rad”, США).

Количественное определение белка осуществляли по методу М. Брэдфорд [13].

Статистическую обработку данных проводили методом парных сравнений с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Почечные сосочки состоят из таких клеточных структур как собирательные трубки, тонкие нисходящие и восходящие отделы петель Генле юкстамедуллярных нефронов и кровеносные сосуды vasa recta. Пространство между этими структурами занимает соединительная ткань, образованная интерстициальными клетками [11]. Для того, чтобы провести сравнительную характеристику изоформ ГИАЛ1 в клетках почечного сосочка и интерстициальной ткани, мы использовали механический способ дезинтеграции за счет гидростатического давления жидкости на кусочки ткани при прохождении через иглу из одного шприца в другой. Использование каких-либо гидролитических ферментов, применяемых для получения клеточных суспензий, было недопустимо по причине их возможного влияния на внеклеточную гиалуронидазную активность. Данный способ по сравнению с гомогенизацией позволяет сохранять клетки, в основном, в целостном состоянии в виде отдельных клеток, клеточных конгломератов и фрагментов трубок. Осаждая их при низкоскоростном центрифугировании, мы исходили из того, что в осадке будет содержаться внутриклеточный пул ГИАЛ1, связанный, главным образом, с клеточными конгломератами собирательных трубок, составляющих основу почечного сосочка, а в надосадочной жидкости останется ГИАЛ1 межклеточного матрикса, разрушенных клеток, а также отдельных клеток и небольших клеточных конгломератов, не выпавших в осадок. Дальнейшее высокоскоростное центрифугирование приводило к осаждению всех этих компонентов из надосадочной жидкости.

Как видно из рис. 1, для клеточных конгломератов и ферментативных экстрактов ГИАЛ1 межклеточного матрикса почечного сосочка были характерны две изоформы ГИАЛ1 с молекулярной массой 63 и 73 кДа. Однако соотношения активностей этих двух белков были прямо противоположными. Если в клеточных конгломератах почечного сосочка основной изоформой ГИАЛ1 был 63 кДа-белок, то в ферментативных экстрактах основной изоформой ГИАЛ1 был 73 кДа-белок. Ранее нами было установлено, что в гомогенатах ткани печени, селезенки и кожи крыс линии Вистар, так же, как и в почечной медулле, находятся две изоформы ГИАЛ1 с молекулярной массой 63 и 73 кДа, причем активность 73 кДа-белка в почечной медулле была значительно выше по сравнению с другими органами, и уступала лишь плазме крови, где активность данной изоформы была максимальна [10]. Таким образом, можно предположить, что изоформа ГИАЛ1 с молекулярной массой 63 кДа характерна для дифференцированных клеток тканей, в то время как изоформа ГИАЛ1 с молекулярной массой 73 кДа синтезируется в клетках соединительной ткани и может секретироваться в интерстициальное пространство органов, а также в кровеносное русло. Активность 73 кДа-белка в целом почечном сосочке в несколько раз превышает активность 63 кДа-белка, учитывая то, что при получении клеточных конгломератов почечного сосочка объем почечных сосочков по сравнению с объемом буфера, в котором осуществлялась дезинтеграция ткани, был меньше, как минимум, в 6–8 раз. Поэтому в работах на ферментативных экстрактах из гомогенатов почечных сосочков активность 63 кДа-белка выявляется в виде минорной зоны по сравнению с активностью 73 кДа-белка [9, 10].

Рис. 1.

Зимограмма ГИАЛ1 клеток почечного сосочка (1) и ферментативных экстрактов ГИАЛ1 межклеточного матрикса (2). Справа обозначены молекулярные массы белков, обладающих гиалуронидазной активностью. Представленная на рисунке зимограмма ГИАЛ 1 является результатом одного из 6 отдельных экспериментов.

Почечные сосочки состоят, как было отмечено выше, из разных типов клеток, но в основном из клеток собирательных трубок. Поэтому определяемая активность ГИАЛ1 в клеточных конгломератах, скорее всего, связана именно с клетками собирательных трубок. Чтобы убедиться в этом, был проведен сравнительный анализ гиалуронидазной активности в клетках почечного сосочка и клеток собирательных трубок. Мы использовали известный из литературы метод Стокса для получения клеток собирательных трубок почечного сосочка с использованием гидролитических ферментов, таких как коллагеназа и гиалуронидаза. Данный метод позволяет получать препараты клеток собирательных трубок со степенью чистоты более 90% [11].

На рис. 2 видно, что в клетках собирательных трубок, полученных по методу Стокса, главной изоформой ГИАЛ1 также был 63 кДа-белок, активность которого сопоставима с аналогичным показателем в клеточных конгломератах почечного сосочка.

Рис. 2.

Зимограмма ГИАЛ1 клеток почечного сосочка, полученных механическим способом (1) и клеток собирательных трубок почечного сосочка, полученных по методу Стокса (2). Справа обозначены молекулярные массы белков, обладающих гиалуронидазной активностью. Представленная на рисунке зимограмма ГИАЛ 1 является результатом одного из 5 отдельных экспериментов.

Для того, чтобы выяснить, влияетли коллагеназа на активность ГИАЛ1, нами были проведены эксперименты на ферментативных экстрактах межклеточного матрикса почечного сосочка, которые предварительно инкубировали с коллагеназой.

Присутствие коллагеназы во внеклеточной среде приводило к снижению активности обеих изоформ ГИАЛ1 (рис. 3А). Однако степень подавления гиалуронидазной активности 73 кДа-белка была гораздо больше по сравнению с 63 кДа-белком и составляла около 83%, в то время как для 63 кДа-белка снижение гиалуронидазной активности под действием коллагеназы составляло около 34% (рис. 3Б).

Рис. 3.

А – Зимограмма ферментативных экстрактов ГИАЛ1 межклеточного матрикса почечного сосочка в отсутствие (1) и в присутствии (2) коллагеназы. Перед проведением зимографии ферментативные экстракты инкубировали с коллагеназой (1 мг/мл) при 37°С в течение 30 мин. Справа обозначены молекулярные массы белков, обладающих гиалуронидазной активностью. Представленная на рисунке зимограмма ГИАЛ 1 является результатом одного из 5 отдельных экспериментов. Б – Влияние коллагеназы на гиалуронидазную активность 63 и 73 кДа-белков ферментативных экстрактов межклеточного матрикса почечного сосочка. Относительная оптическая плотность полосы каждого белка в отсутствие коллагеназы принималась за 100% и считалась контролем. Результаты являются средними данными 5 отдельных экспериментов, приведены значения M ± SEM. Звездочкой обозначены достоверные отличия при p < 0.05.

Наши результаты позволяют говорить, что для получения суспензии клеток собирательных трубок использование протеолитических ферментов, таких как коллагеназа, не влияет на активность внутриклеточного пула ГИАЛ1, недоступного для действия экзогенных протеаз. В то же время, в интерстиции почечного сосочка коллагеназы могут выступать в роли ингибиторов ГИАЛ1, подавляя гиалуронидазную активность. Тот факт, что степень снижения активности двух изоформ ГИАЛ1 разная, указывает на то, что 63 кДа-белок является более устойчивой к протеолитическому действию коллагеназы изоформой, по сравнению с 73 кДа-белком, характерным для интерстициальной ткани.

Продемонстрировано, что у человека в крови присутствует изоформа ГИАЛ1 с молекулярной массой 57 кДа, которая в результате эндопротеолиза может превращаться в изоформу с молекулярной массой 45 кДа, выявляемую в моче [5]. Кроме того, известно, что множественные формы ГИАЛ1, выявляемые в условиях нативного электрофореза, могут отличаться друг от друга степенью гликозилирования, в частности, содержанием сиаловых кислот, а обработка сиалазой приводит к снижению количества изоферментов в различных органах и тканях человека [14]. Какие взаимосвязи существуют между 63 и 73 кДа-белками почечного сосочка крыс, еще предстоит выяснить. Очевидно, что для понимания механизма регуляции и роли ГИАЛ1 в обеспечении осморегулирующей функции почек, важно определить, каковы отличия в структуре этих изоформ фермента.

Таким образом, нами обнаружено, что содержащиеся в почечном сосочке две изоформы ГИАЛ1 с молекулярной массой 63 и 73 кДа, могут быть связаны с разными почечными структурами. 63 кДа-белок, очевидно, является внутриклеточным белком, характерным для клеток собирательных трубок, в то время как 73 кДа-белок является основной изоформой межклеточного пространства. В пользу данного утверждения говорит тот факт, что в сыворотке крови крыс главной изоформой ГИАЛ1 является 73 кДа-белок, в то время как 63 кДа-белок отсутствует [10, 15].

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ. Проект № 17-44-150268.