1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова
  4. T. 106, № 10, 2020

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 10, стр. 1238-1250

Влияние диета-индуцированного и меланокортинового ожирения на экспрессию триптофангидроксилазы 2 в нейронах среднего мозга и гипоталамуса мышей

Е. В. Михайлова 1, Д. Л. Свиридова 1, И. В. Романова 1, *, К. В. Деркач 1, А. О. Шпаков 1

1 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук
Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: irinaromanova@mail.ru

Поступила в редакцию 31.03.2020
После доработки 01.05.2020
Принята к публикации 30.05.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Серотониновая система мозга играет ключевую роль не только в регуляции поведения и когнитивных функций, но и в контроле пищевого поведения и энергетического обмена. В это вовлечены серотонинергические нейроны среднего мозга, экспрессирующие фермент триптофангидроксилазу 2-го типа (ТПГ-2), катализирующую синтез серотонина, и гипоталамические нейроны, экспрессируюшие серотониновые рецепторы. В настоящее время изменения экспрессии и распределения ТПГ-2 в нейронах среднего мозга при ожирении остаются мало изученными. Наряду с этим предполагается, что серотонин может синтезироваться и в гипоталамических нейронах, оказывая влияние на серотониновую систему гипоталамуса, но данные об экспрессии и возможной локализации ТПГ-2 в гипоталамических нейронах отсутствуют. Целью работы было изучение экспрессии ТПГ-2 в среднем мозге и ее распределение в нейронах аркуатных, паравентрикулярных и супраоптических ядер гипоталамуса у мышей с диета-индуцированным ожирением (ДИО) и у агути-мышей с генетически-обусловленным ожирением меланокортинового типа. В гипоталамусе мышей С57Bl/6J выявлена экспрессия гена ТПГ-2 и с помощью двойного иммуномечения впервые показана локализация фермента в иммунопозитивных к проопиомеланокортину (ПОМК) нейронах аркуатных ядер и в иммунопозитивных к вазопрессину нейронах паравентрикулярных и супраоптических ядер. При обоих типах ожирения количество ТПГ-2-иммунопозитивных гранул в ПОМК- и вазопрессин-иммунопозитивных нейронах повышалось, хотя экспрессия гена Tph2 повышалась только у агути-мышей. В среднем мозге ДИО-мышей содержание ТПГ-2 снижалось, в то время как у агути-мышей оно не менялось. Эти результаты свидетельствуют о важной роли синтезируемого в гипоталамусе серотонина, который совместно с серотонином, поступающим из среднего мозга, вовлечен в компенсаторные изменения гипоталамического сигналинга при ожирении. Обнаружение ТПГ-2-иммунопозитивных гипоталамических нейронов различной эргичности, способных синтезировать серотонин, указывает на существование новых механизмов аутокринной и паракринной серотониновой регуляции в гипоталамусе, в том числе при ожирении.

Ключевые слова: серотонин, триптофангидроксилаза-2, средний мозг, гипоталамус, диета-индуцированное ожирение, агути-мыши

Нейротрансмиттер серотонин в мозге человека, обезьян и грызунов синтезируется преимущественно в среднем мозге, в том числе в серотонинергических нейронах ядер шва B7 и B8 (dorsal and median raphe nuclei, DRN and MRN), которые посылают проекции в гипоталамус [1–4]. В дальнейшем по отросткам этих серотонинергических нейронов серотонин поступает в соседние области мозга, включая гипоталамические ядра, где специфически связывается с расположенными там серотониновыми рецепторами и осуществляет регуляцию таких процессов, как нейрональная пластичность, память, пищевое поведение, углеводный и липидный обмен, а также контролирует функции сердечно-сосудистой системы [5–8]. Синтез серотонина в ЦНС осуществляется с помощью фермента – триптофангидроксилазы 2-го типа (ТПГ-2), которая катализирует превращение 5-гидрокситриптофана в серотонин (скорость-лимитирующая стадия синтеза серотонина) и потому является основным маркером серотонинергических нейронов мозга [9, 10]. Показана положительная корреляция между интенсивностью синтеза серотонина в нейронах и уровнем в них экспрессии и активности ТПГ-2 [11, 12].

Серотониновая система мозга, а также различные отделы гипоталамуса играют определяющую роль в контроле пищевого поведения и энергетического обмена и претерпевают значительные изменения в условиях метаболических расстройств – ожирения и метаболического синдрома. Вследствие этого значительный интерес представляет сравнительное изучение активности системы синтеза серотонина в среднем мозге и гипоталамусе, а также интегративных взаимосвязей между серотонинергическими нейронами среднего мозга и нейронами аркуатного, паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса в норме и при различных метаболических расстройствах. Несмотря на значительное число работ, посвященных функциональным изменениям серотониновой системы при ожирении и метаболическом синдроме, их влияние на экспрессию гена и белка для ТПГ-2 в среднем мозге мало изучено [13]. В отношении распределения ТПГ-2 в гипоталамических структурах имеется только одна работа, в которой с помощью иммуногистохимического подхода показано наличие ТПГ-2-иммунопозитивных гранул в латеральном гипоталамусе, но при этом неясно, являются ли иммунопозитивные структуры окончаниями отростков серотонинергических нейронов, приходящих из среднего мозга, или они соответствуют экспрессирующим ТПГ-2 гипоталамическим нейронам различной эргичности [14]. Следует отметить, что вопрос об источниках серотонина в гипоталамусе и о возможности его синтеза серотонина в гипоталамических нейронах de novo остается открытым.

Целью работы было изучение экспрессии ТПГ-2 в среднем мозге и распределение ТПГ-2 в нейронах аркуатных, паравентрикулярных и супраоптических ядер гипоталамуса у мышей с диета-индуцированным ожирением (ДИО) и у агути-мышей с ожирением меланокортинового типа. Для исследования были выбраны два типа ожирения, различающихся по этиологии и патогенезу – ожирение у мышей линии C57Bl/6J (a/a), индуцированное комбинированной высокожировой и высокоуглеводной диетой, сходное с абдоминальным ожирением у человека [13], и генетически-обусловленное ожирение у агути-мышей, вызванное мутацией в локусе agouti (Ay/a), результатом которой является повышенная экспрессии агути-сигнального пептида, эндогенного ингибитора меланокортиновых рецепторов, опосредующих анорексигенные эффекты α-меланоцитстимулирующего гормона [15]. Для мечения нейронов в аркуатных ядрах гипоталамуса использовали антитела к проопиомеланокортину (ПОМК), прекурсору анорексигенных пептидов меланокортинового семейства, который интенсивно экспрессируется в этой области гипоталамуса [15, 16]. Для иммуномечения нейронов в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса, где локализованы тела вазопрессин-иммунопозитивных нейронов (нейросекреторных клеток), использовали антитела к вазопрессину [17].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая статья не содержит результатов каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований. Все эксперименты проводили в соответствии с правилами, разработанными Комитетом по биоэтике ИЭФБ РАН (15.02.2018 г.), правилами и требованиями, изложенными в документах “European Communities Council Directive (2010/63/EEC) и правилами, изложенными в “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”. На проведение экспериментов получено разрешение Комитета по биоэтике ИЭФБ РАН.

В экспериментах использовали виргинных самок мышей С57Bl/6J (a/a) и самок агути-мышей С57Bl/6J (Ay/a), генетически предрасположенных к ожирению. Возраст животных в начале эксперимента во всех группах составил четыре месяца. Мыши C57Bl/6J (a/a) были получены из питомника Рапполово (Ленинградская область, Россия), агути-мыши – из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия). После двух недель адаптации мыши С57Bl/6J (a/a) были разделены на две группы – контроль, который содержали на стандартном сухом корме (контроль-1), и ДИО-мыши, которые получали высококалорийную диету в течение 16 недель (группа ДИО). Высококалорийная диета включала животный жир, обогащенный насыщенными жирными кислотами (свиное сало), и 30%-ный раствор сахарозы, который животным давали вместо питьевой воды. Агути-мыши (Ay/a) и контрольные для них мыши С57Bl/6J генотипа а/a того же возраста (контроль-2) содержались на стандартной диете.

Уровни инсулина и лептина в крови, взятой из сердца животных в конце эксперимента, определяли с помощью наборов Mouse Insulin ELISA (Mercodia AB, Швеция) и ELISA Kit for Leptin (Cloud-Clone Corp., США). Уровень глюкозы в крови после ее забора из хвостовой вены измеряли с помощью глюкометра Life Scan Johnson & Johnson (Дания) и тест-полосок One Touch Ultra (США). Нагрузку глюкозой осуществляли из расчета 2 г/кг массы тела животного после шестичасового голодания, и оценивали уровень глюкозы через 120 мин после нагрузки, как описано ранее [18].

Для изучения оценки экспрессии гена Tph2, кодирующего ТПГ-2 (NM_173391.3), в гипоталамусе и среднем мозге использовали ПЦР в реальном времени, сопряженную с обратной транскрипцией (ОТ), для приготовления которой использовали 1 мкг общей РНК и набор RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Протокол реакции и используемые реактивы были описаны ранее [15]. Амплификацию осуществляли в 96-луночных планшетах в смеси (25 мкл), содержащей 10 нг ОТ-продукта из ткани среднего мозга или 20 нг ОТ-продукта из ткани гипоталамуса, по 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров, а также реакционной смеси с красителем SYBR Green и референсным красителем ROX (qPCRmix-HS SYBR + LowROX, Евроген, Россия). Каждую пробу повторяли 3 раза. Для определения экспрессии гена Tph2 использовали праймеры, синтезированные фирмой Evrogen (Россия) – CAATCGAGTTCGGCCTTTGC (For) и GCGTCCTGAAAGGTGGTGAT (Rev). В качестве референсных использовали ген Hprt1 (KR817915), кодирующий гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу – AGCCGACCGGTTCTGTCAT (For) и GGTCATAACCTGGTTCATCATCAC (Rev), а также ген 18s рибосомальной РНК (NR_003278) – GGGAGCCTGAGAAACGGC (For) и GGGTCGGGAGTGGGTAATTT (Rev). Амплификационный сигнал детектировали с помощью амплификатора 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies ABI, США). Количественный анализ относительного уровня мРНК проводили с помощью метода delta-delta Ct.

Концентрацию серотонина (5-HT) и его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в гипоталамусе мышей Ay/a с ожирением и контрольных для них мышей генотипа а/a определяли с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимической детекцией на хроматографе Beckman Coulter (США) [19]. Хроматографическая система включала инжектор Rheodyne 7125 с петлей объемом 20 мкл, колонку Phenomenex (250.0 × 4.6 мм) с сорбентом Sphere Clone 5 u ODS(2) и амперометрический детектор LC-4С BAS. Определение концентраций исследуемых веществ проводили при потенциале +0.70 В. Подвижная фаза включала 5.5 мМ цитратно-фосфатного буфера, содержащего 0.7 мМ октансульфоновой кислоты, 0.5 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрила (рН 3.0). Скорость элюции подвижной фазы составила 1 мл/мин, время анализа одной пробы – около 20 мин. Результаты представлены в процентах относительно контрольного, принятого за 100%, уровня серотонина и 5-ГИУК в гипоталамусе мышей генотипа a/a.

Для иммуногистохимических исследований (n = 4 в каждой группе) мышей анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б), транскардиально перфузировали 0.1 М Na+-фосфатным буфером (PB, рН 7.4) и раствором 4%-ного параформальдегида в 0.2 М PB. Мозг дофиксировали в течение ночи в том же фиксаторе (4°С), для криопротекции помещали в 30%-ный раствор сахарозы в 0.02 М PB с 0.9% NaCl (PBS, рН 7.4) и через 3 суток замораживали с помощью изопентана при –42°С. Из области гипоталамуса были приготовлены фронтальные срезы мозга толщиной 16 мкм с помощью криостата Leica СМ-1510 (Leica, Германия), которые монтировали на стеклах. На срезах мозга контрольных мышей (контроль-1 и контроль-2), ДИО-мышей и агути-мышей (Ay/a) проводили двойное флуоресцентное иммуномечение, для чего использовали ранее разработанный протокол [15]. Для блокировки неспецифического связывания перед нанесением блокирующего раствора проводили преинкубацию в течение 30 мин в 100 мМ растворе глицина, разведенного в PBS. Для реакции использовали смесь первичных антител кролика к ТПГ-2 (Millipore Corp., США; 1 : 500) с антителами мыши к ПОМК (Abcam, Великобритания; 1 : 1000) или вазопрессину (антитела любезно предоставлены профессором Harold Gainer, NIH, США; 1 : 1000). Также использовали смесь вторичных антител (Invitrogen, США; 1 : 1000), конъюгированных с различными флуорохромами – цыпленка против Ig кролика – Alexa-488 и осла против Ig мыши – Alexa-568. После промывки в PBS срезы инкубировали в течение 2 мин с красителем DAPI (Sigma, США; 1 : 2000), промывали, заключали под покровное стекло с помощью среды Mowiol (Sigma, США) и хранили при 4°C до ее полимеризации. Специфичность иммуногистохимической реакции проверяли с помощью негативного контроля (реакции без первичных или вторичных антител).

Анализ флуоресцентного иммуномечения проводили с помощью конфокального микроскопа DMI6000 и лазерной установки SP5 II (Leiсa Microsystems, Германия). Последовательное сканирование проводили с помощью иммерсионного объектива х63, лазеров с длиной волны возбуждения 488 и 568 нм. Съемку структур соответствующей контрольной и экспериментальной групп производили парами при одинаковых установках при максимальной интенсивности свечения по Z-позиции.

Интенсивность свечения ТПГ-2 в нейронах анализировали количественно с помощью пакета программ Leica LAS AF. Для анализа выбирали нейроны, в которых область, где локализовано ядро, располагалась в центре и была окружена перикарионом. Значения интенсивности свечения нормировали по их значениям в контроле. Изображения с DAPI анализировали с помощью микроскопа Carl Zeiss Axio Imager A1 с флуоресцентной установкой (HB-100) (Carl Zeiss, Германия), что было необходимо для подтверждения локализации ТПГ-2 в перикарионе исследуемых нейронов.

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, США). Оценку нормальности распределения данных проводили с использованием теста D’Agostino–Pearson. В случае нормального распределения (α = 0.05) различия между группами результатов метаболических, биохимических и ПЦР-анализа оценивали с помощью непарного t-теста, а результатов иммуногистохимических исследований оценивали с помощью парного t-теста. Различия считали статистически значимые при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У ДИО- и агути-мышей имелись отчетливо выраженное ожирение, постпрандиальная гипергликемия, гиперинсулинемия и гиперлептинемия, что указывает на развитие у них метаболического синдрома c характерными для него нарушенной толерантностью к глюкозе и инсулиновой резистентностью (табл. 1). При этом метаболические нарушения у агути-мышей с генотипом Ay/a были выражены в значительно большей степени, чем у ДИО-мышей.

Таблица 1.  

Масса тела, уровни глюкозы, инсулина и лептина у мышей с различными моделями ожирения в сравнении с контрольными животными Table 1.  The body weight and the glucose, insulin and leptin levels in mice with different models of obesity as compared to control animals

Показатель Indicators Контроль-1, C57Bl/6J,
n = 10 Control-1,
C57Bl/6J 		ДИО-мыши, C57Bl/6J,
n = 10 DIO mice, C57Bl/6J 		Контроль-2, C57Bl/6J,
n = 11 Control-2, C57Bl/6J 		Агути-мыши C57Bl/6J (Ay/a), n = 11 Agouti mice, C57Bl/6J (Ay/a)
Масса тела, г
Body weight, g 		19.8 ± 0.7 24.4 ± 0.9a 20.3 ± 1.0 38.8 ± 1.7b
Глюкоза, мМ*
Glucose, mM* 		4.8 ± 0.4 6.7 ± 0.6a 4.9 ± 0.5 11.2 ± 1.4b
Глюкоза (120 мин), мМ**
Glucose (120 min), mM** 		4.9 ± 0.6 7.4 ± 0.4a 4.9 ± 0.5 12.8 ± 1.3b
Инсулин, нг/мл
Insulin, ng/mL 		0.36 ± 0.07 0.59 ± 0.07a 0.31 ± 0.09 1.11 ± 0.22b
Лептин, нг/мл
Leptin, ng/mL 		1.09 ± 0.21 2.43 ± 0.43a 1.18 ± 0.17 12.97 ± 0.95b

* – уровень постпрандиальной глюкозы, ** – уровень глюкозы через 120 мин после глюкозной нагрузки (2 г глюкозы на 1 кг массы тела). Все значения представлены как M ± SD. a – различия между контролем-1 и ДИО-мышами статистически значимы при p < 0.05; b – различия между контролем 2 и агути-мышами с генотипом Ay/a статистически значимы при p < 0.05. * – the postprandial glucose level, ** – the glucose level 120 min after glucose loading (2 g/glucose per kg of body weight). All values are presented as the M ± SD. a – the differences between control-1 and DIO mice are significant at p < 0.05; b – the differences between control-2 and agouti mice with the Ay/a genotype are significant at p < 0.05.

С помощью ПЦР в реальном времени было показано, что экспрессия гена Tph2 в среднем мозге ДИО-мышей (n = 6) достоверно снижается по сравнению с контрольной группой (n = 6), в то время как в гипоталамусе экспрессия этого гена при ДИО не менялась (рис. 1A). У агути-мышей (Ay/a, n = 7) не было выявлено изменений экспрессии гена Tph2 в среднем мозге по сравнению с соответствующим контролем (n = 7), в то время как его экспрессия в гипоталамусе повышалась (рис. 1B).

Рис. 1.

Экспрессия гена Трh2 в среднем мозге и гипоталамусе мышей C57BL/6J с диета-индуцированным ожирением (ДИО) (А) и мышей Agouti yellow (Ay/a) с меланокортиновым типом ожирения (B) по сравнению с соответствующими контрольными группами. * – достоверность отличий (p < 0.05). Fig. 1. The expression of the Trh2 gene in the midbrain and hypothalamus of C57BL/6J mice with diet-induced obesity (DIO) (A) and Agouti yellow (Ay/a) mice with the melanocortin type of obesity (B) as compared with the corresponding control groups. * – the difference is significance at the p < 0.05.

Эти данные указывают на различия в экспрессии гена Tph2 в среднем мозге и гипоталамусе мышей с различными типами ожирения. Поскольку ТПГ-2 является основным ферментом синтеза серотонина в ядрах шва и других отделах мозга [10], то имеются основания полагать, что выявленные изменения экспрессии гена Tph2 будут коррелировать с изменениями уровня серотонина, который играет ключевую роль в контроле пищевого поведения и энергетического баланса. Для проверки этого с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ были оценены уровни серотонина и его основного метаболита 5-ГИУК в гипоталамусе агути-мышей. Показано, что как уровень серотонина, так и 5-ГИУК, в гипоталамусе агути-мышей (n = 7) были повышены в сравнении с контрольной группой (n = 7) при отсутствии значимых изменений в соотношении 5-ГИУК/5-HT (рис. 2). Результаты количественного анализа уровня серотонина в гипоталамусе агути-мышей хорошо коррелирует с изменениями в этой области мозга экспрессии гена, кодирующего ТПГ-2.

Рис. 2.

Оцениваемое с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ содержание серотонина (5-HT) и его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA), а также их соотношение в гипоталамусе агути-мышей (Ay/a) с меланокортиновым ожирением в сравнении с контрольными мышами (a/a) того же возраста. Данные представлены в процентах от контроля, * – достоверность различий между агути-мышами и контрольной группой (p < 0.05). Fig. 2. The content of serotonin (5-HT) and its metabolite 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA), as well as their ratio in the hypothalamus of agouti mice (Ay/a) with the melanocortin obesity as compared to control mice (a/a) of the same age, estimated using reverse-phase HPLC. The data are presented as a percentage of control, * – the difference between agouti mice and control group is significant at the p < 0.05.

Другими авторами при изучении овариэктомированных обезьян Callithrix jacchus из семейства игрунковых, находящихся на высокожировой диете, было показано небольшое снижение базального уровня экспрессии гена Tph2 в среднем мозге и полное отсутствие в отличие от животных, находящихся на низкокалорийной диете, стимулирующего эффекта на нее эстрогенов, важнейших активаторов экспрессии гена Tph2 в ЦНС [20]. У японских макак, которые родились от матерей, находящихся на высокожировой диете, вне зависимости от того, находились ли они в дальнейшем, после молочного вскармливания, на нормальной или на высокожировой диете, отмечали достоверное снижение экспрессии гена Tph2 в дорсальном ядре шва. Парадоксально, но у обезьян, родившихся от матерей, находящихся на нормальной диете и при этом получавших высокожировую диету, уровень экспрессии гена Tph2 в этой области среднего мозга имел тенденцию к снижению, но статистически значимо от контрольной группы не отличался [21].

При изучении влияния ДИО на уровни ТПГ-2 у грызунов были получены следующие результаты. В мозге мышей, которые на протяжении семи недель получали высокожировую диету, экспрессия гена Tph2 сохранялась на уровне, близком к таковому в контроле [22]. Содержание белка ТПГ-2 в ядре шва у крыс с ожирением, вызванным семинедельной высококалорийной диетой, статистически значимо также не отличалось от такового в контроле [23]. Следует, однако, отметить, что в обеих работах исследовали либо мозг в целом [22], либо только дорсальное и медианное ядра шва [23], в то время как мы изучали средний мозг. Необходимо обратить внимание на то, что содержание ТПГ-2 в дорсальном и медианном ядрах шва у обезьян в условиях нарушенного питания матерей менялось разнонаправленно – в дорсальном ядре шва оно снижалось, а в медианном ядре возрастало [21]. Выявленные нами различия между ДИО-мышами и агути-мышами в отношении изменений экспрессии гена Tph2 в среднем мозге могут быть обусловлены тем, что в случае ДИО изменения являются результатом компенсаторной реакции уже сформированной серотонинергической системы мозга на избыточное потребление калорий, направленной на снижение гиперфагии. В случае же агути-мышей с генетически детерминированным меланокортиновым типом ожирения эти компенсаторные изменения могли произойти еще в раннем онтогенезе, что, как мы полагаем, и обусловливает нормальные значения экспрессии ТПГ-2 и синтеза серотонина в среднем мозге.

Обнаружение экспрессии гена, кодирующего ТПГ-2 в гипоталамусе, хотя и существенно менее выраженной в сравнении со средним мозгом, поставило перед нами задачу идентифицировать нейроны, экспрессирующие этот фермент в структурах гипоталамуса. Имеющиеся сведения о наличии активности ТПГ-2 и присутствии иммунопозитивных к этому ферменту гранул в гипоталамусе не позволяют ответить на вопрос – является ли это результатом локализации ТПГ-2 в отростках и окончаниях серотонинергических нейронов среднего мозга или это указывает на присутствие в гипоталамусе нейронов различной эргичности, способных экспрессировать ТПГ-2 [24, 14 ]. Нами с помощью двойного иммуномечения было впервые показано, что во всех изученных группах мышей в аркуатных ядрах гипоталамуса имелись иммунопозитивные к ТПГ-2 гранулы, в том числе локализованные в телах ПОМК-иммунопозитивных нейронов (рис. 3). В паравентрикулярных ядрах также отмечали ТПГ-2-иммунопозитивные гранулы, часть которых была расположена в вазопрессин-иммунопозитивных нейронах (рис. 4). Сходная картина отмечалась и в супраоптических ядрах гипоталамуса (фотографии не приведены). Полученные данные свидетельствуют о том, что в различных гипоталамических структурах фермент ТПГ-2 может быть локализован не только в отростках и окончаниях нейронов среднего мозга (изолированные иммунопозитивные гранулы к ТПГ-2-антителам), но и в гипоталамических нейронах, экспрессирующих различные гипоталамические нейрогормоны – ПОМК, прекурсор меланокортиновых пептидов, и вазопрессин.

Рис. 3.

Двойнaя иммуногистохимическaя реaкция к триптофангидроксилазе-2 и проопиомеланокортину в аркуатных ядрах гипоталамуса мышей. A – контроль-1; B – ДИО; C – контроль-2; D – агути-мыши с генотипом Ay/a. Представлено иммуномечение ТПГ-2 (зеленый) и ПОМК (крaсный). Сплошными стрелками отмечены иммунопозитивные к ТПГ-2 гранулы в телах ПОМК-иммунопозитивных нейронов, прерывистыми стрелками – иммунопозитивные к ТПГ-2 гранулы в других структурах аркуатных ядер. Мaсштaб – 20 мкм. Fig. 3. Double immunohistochemical reaction to tryptophan hydroxylase-2 and proopiomelanocortin (POMC) in the arcuate nuclei of the mice hypothalamus. A – control-1; B – DIO; C – control-2; D – agouti mice with the Ay/a genotype. The immunolabeling of TRH-2 (green) and POMC (red) is presented. The solid arrows indicate the immunopositive granules for TRH-2 in the POMC-immunopositive neurons, and the dashed arrows indicate the immunopositive granules for TPH-2 in the other structures of the arcuate nuclei. The scale bars – 20 µm.

Рис. 4.

Двойнaя иммуногистохимическaя реaкция к триптофангидроксилазе-2 и вазопрессину в паравентрикулярных ядрах гипоталамуса мышей. A – контроль-1, B – ДИО, C – контроль-2, D – агути-мыши с генотипом Ay/a. Представлено иммуномечение ТПГ-2 (зеленый) и вазопрессина (крaсный). Сплошными стрелками отмечены иммунопозитивные к ТПГ-2 гранулы в телах вазопрессин-иммунопозитивных нейронов, прерывистыми стрелками – иммунопозитивные к ТПГ-2 гранулы в других структурах паравентрикулярных ядер. Мaсштaб – 25 мкм. Fig. 4. Double immunohistochemical reaction to tryptophan hydroxylase-2 and proopiomelanocortin (POMC) in the paraventricular nuclei of the hypothalamus of mice. A – control-1; B – DIO; C – control-2; D – agouti mice with the Ay/a genotype. The immunolabeling of TPH-2 (green) and POMC (red) is presented. The solid arrows indicate the immunopositive granules for TRH-2 in the vasopressin-immunopositive neurons, and the dashed arrows indicate the granules immunopositive for TRH-2 in the other structures of the paraventricular nuclei. The scale bars – 25 µm.

Далее с помощью двойного иммуномечения оценивали количество иммунопозитивных к ТПГ-2 гранул, локализованных в ПОМК- и вазопрессин-иммунопозитивных нейронах гипоталамуса, у ДИО- и агути-мышей в сравнении с контрольными животными. Показано, что у мышей с различными типами ожирения иммунопозитивность к ТПГ-2 в ПОМК-нейронах аркуатного ядра и в вазопрессин-иммунопозитивных нейронах паравентрикулярных и супраоптических ядер была выше, чем в контроле (рис. 3–5). В наибольшей степени такое повышение выявлялось в вазопрессин-иммунопозитивных нейронах супраптических ядер, в наименьшей степени – в вазопрессин-иммунопозитивных нейронах паравентрикулярных ядер (рис. 5). Повышение экспрессии ТПГ-2 в гипоталамических нейронах может быть обусловлено необходимостью усиления серотониновой регуляции в гипоталамусе в условиях ожирения, направленной на снижение потребления высококалорийной пищи при ДИО и на ослабление орексигенных влияний, вызванных подавлением меланокортинового сигналинга в гипоталамусе при гиперэкспрессии агути-сигнального пептида, антагониста меланокортиновых рецепторов, у агути-мышей. Это согласуется с ролью серотонина как нейрогормона, ослабляющего орексигенные каскады в гипоталамусе [25, 26]. Как было показано нами ранее, в условиях ДИО и меланокортинового ожирения в гипоталамусе также повышается экспрессия серотониновых рецепторов 1B- и 2С-подтипов, в том числе на ПОМК-иммунопозитивных нейронах, что также указывает на компенсаторное усиление серотонинового сигналинга в условиях ожирения [13]. Интраназальное введение крысам с ДИО серотонина или совместное введение мышам агонистов серотониновых рецепторов 1B- и 2С-подтипов снижает у них потребление пищи, что приводит к снижению массы тела животных и в случае ДИО-крыс нормализует их метаболические показатели [18, 27].

Рис. 5.

Интенсивность свечения триптофангидроксилазы-2 в ПОМК- и вазопрессин-иммунопозитивных нейронах гипоталамуса мышей с ДИО (А) и с генетически обусловленным меланокортиновым ожирением (агути мыши с генотипом Ay/a) (B). ARC, PVN и SON – аркуатные, паравентрикулярные и супраоптические ядра гипоталамуса. Данные представлены в условных единицах (у. ед.). * – различия между группой с ожирением и соответствующей контрольной группой статистически значимы при p < 0.05. Fig. 5. The intensity of the luminescence of tryptophan hydroxylase-2 in the POMC- and vasopressin-immunopositive neurons of the hypothalamus of the mice with DIO (A) and genetically-induced melanocortin obesity (agouti mice with the Ay/a genotype) (B). ARC, PVN, and SON are the arcuate, paraventricular, and supraoptic nuclei of the hypothalamus. The data are presented in arbitrary units (a. u.). * – the differences between the obese and corresponding control group are significant at p < 0.05.

Таким образом, в гипоталамусе мышей С57Bl/6J выявлена экспрессия гена, кодирующего ТПГ-2, и с помощью двойного иммуномечения впервые показана локализация этого фермента в ПОМК-иммунопозитивных нейронах аркуатных ядер и в вазопрессин-иммунопозитивных нейронах паравентрикулярных и супраоптических ядер гипоталамуса. При ДИО и меланокортиновом ожирении количество ТПГ-2-иммунопозитивных гранул в ПОМК- и вазопрессин-иммунопозитивных нейронах повышалось, хотя экспрессия гена Tph2 повышалась только у агути-мышей. В среднем мозге ДИО-мышей содержание ТПГ-2 снижалось, в то время как у агути-мышей оно не менялось. Эти результаты свидетельствуют о важной роли синтезируемого в гипоталамусе серотонина, который совместно с серотонином, поступающим в гипоталамус из среднего мозга, вовлечен в компенсаторные изменения гипоталамического сигналинга у мышей с ожирением и ассоциированными с ним метаболическими и гормональными расстройствами. Обнаружение гипоталамических ТПГ-2-иммунопозитивных нейронов различной эргичности, способных синтезировать серотонин, указывает на существование новых механизмов аутокринной и паракринной серотониновой регуляции в гипоталамусе, в том числе, реализуемых при ожирении.

Исследование проведено с использованием оборудования ЦКП ИЭФБ РАН.

Список литературы

  1. Halliday G.M., Tork I. Serotonin-like immunoreactive cells and fibres in the rat ventromedial mesencephalic tegmentum. Brain Res. Bull. 22: 725–735. 1989.

  2. Baker K.G., Halliday G.M., Hornung J.P., Geffen L.B., Cotton R.G., Tork I. Distribution, morphology and number of monoamine-synthesizing and substance P-containing neurons in the human dorsal raphe nucleus. Neuroscience. 42: 757–775. 1991.

  3. Chen G.L., Novak M.A., Hakim S., Xie Z., Miller G.M. Tryptophan hydroxylase-2 gene polymorphisms in rhesus monkeys: association with hypothalamic-pituitary-adrenal axis function and in vitro gene expression. Mol. Psychiatry. 11(10): 914–928. 2006. https://doi.org/10.1038/sj.mp.4001870

  4. Carkaci-Salli N., Salli U., Kuntz-Melcavage K.L., Pennock M.M., Ozgen H., Tekin I., Freeman W.M., Vrana K.E. TPH2 in the ventral tegmental area of the male rat brain. Brain Res. Bull. 84(6): 376–80. 2011. https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2011.01.006

  5. Nezafati M.H., Eshraghi A., Vojdanparast M., Abtahi S., Nezafati P. Selective serotonin reuptake inhibitors and cardiovascular events: A systematic review. J. Res. Med. Sci. 21: 66. 2016. eCollection 2016. https://doi.org/10.4103/1735-1995.189647

  6. Yabut J.M., Crane J.D., Green A.E., Keating D.J., Khan W.I., Steinberg G.R. Emerging Roles for Serotonin in Regulating Metabolism: New Implications for an Ancient Molecule. Endocr. Rev. 40(4): 1092–1107. 2019. https://doi.org/10.1210/er.2018-00283

  7. Bacqué-Cazenave J., Bharatiya R., Barrière G., Delbecque J-P., Bouguiyoud N., Di Giovanni G., Cattaert D., De Deurwaerdère P. Serotonin in Animal Cognition and Behavior. Int. J. Mol. Sci. 21(5): E1649. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21051649

  8. Bamalan O.A., Al Khalili Y. Physiology, Serotonin. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020–2019.

  9. Walther D.J., Peter J.U., Bashammakh S., Hortnagl H., Voits M., Fink H., Bader M. Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform. Science. 299: 76. 2003.

  10. Heydendael W., Jacobson L. Glucocorticoid status affects antidepressant regulation of locus coeruleus tyrosine hydroxylase and dorsal raphé tryptophan hydroxylase gene expression. Brain Res. 1288: 69–78. 2009. https://doi.org/10.1016/j.brainres.2009.06.082

  11. Mosienko V., Bert B., Beis D., Matthes S., Fink H., Bader M., Alenina N. Exaggerated aggression and decreased anxiety in mice deficient in brain serotonin. Transl. Psychiatry. 2(5): e122. 2012. https://doi.org/10.1038/tp.2012.44

  12. Wang L., Han D., Yin P., Teng K., Xu J., Ma Y. Decreased tryptophan hydroxylase 2 mRNA and protein expression, decreased brain serotonin concentrations, and anxiety-like behavioral changes in a rat model of simulated transport stress. Stress. 22(6): 707–717. 2019. https://doi.org/10.1080/10253890.2019.1625328

  13. Mikhailova E.V., Romanova I.V., Derkach K.V., Vishnevskaya O.N., Shpakov A.O. The Effect of Diet-Induced and Melanocortin Obesity on Expression of Tryptophan Hydroxylase 2 in the Dorsal Raphe Nucleus and Ventral Tegmental Area in Mice. J. Evol. Biochem. Physiol. 55(4): 293–301. 2019. https://doi.org/10.1134/S0022093019040057

  14. Clark J.A., Flick R.B., Pai L.Y., Szalayova I., Key S., Conley R.K., Deutch A.Y., Hutson P.H., Mezey E. Glucocorticoid modulation of tryptophan hydroxylase-2 protein in raphe nuclei and 5-hydroxytryptophan concentrations in frontal cortex of C57/Bl6 mice. Mol. Psychiatry. 13(5): 498–506. 2008. https://doi.org/10.1038/sj.mp.4002041

  15. Romanova I.V., Derkach K.V., Mikhrina A.L., Sukhov I.B., Mikhailova E.V., Shpakov A.O. The leptin, dopamine and serotonin receptors in hypothalamic POMC-neurons in normal and obese rodents. Neurochem. Res. 43(4): 821–837. 2018. https://doi.org/10.1007/s11064-018-2485-z

  16. Bagnol D., Lu X.Y., Kaelin C.B., Day H.E., Ollmann M., Gantz I., Akil H., Barsh G.S., Watson S.J. Anatomy of an Endogenous Antagonist: Relationship between Agouti-Related Protein and Proopiomelanocortin in Brain. J. Neurosci. 19: 1–7. 1999.

  17. Altstein M., Gainer H. Differential biosynthesis and posttranslational processing of vasopressin and oxytocin in rat brain during embryonic and postnatal development. J. Neurosci. 8: 3967–3977. 1988. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.08-11-03967.1988

  18. Derkach K., Zakharova I., Zorina I., Bakhtyukov A., Romanova I., Bayunova L., Shpakov A. The evidence of metabolic-improving effect of metformin in Ay/a mice with genetically-induced melanocortin obesity and the contribution of hypothalamic mechanisms to this effect. PloS One. 14(3), e0213779. 2019. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213779

  19. Krasnova I.N., Bychkov E.R., Lioudyno V.I. Zubareva O.E., Dambinova S.A. Intracerebroventricular administration of substance P increases dopamine content in the brain of 6-hydrodopamine lesioned rats. Neuroscience. 95(1): 113–117. 2000.

  20. Bethea C.L., Reddy A.P., Flowers M., Shapiro R.A., Colman R.J., Abbott D.H., Levine J.E. High fat diet decreases beneficial effects of estrogen on serotonin-related gene expression in marmosets. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 58: 71–80. 2015. https://doi.org/10.1016/j.pnpbp.2014.11.008

  21. Thompson J.R., Valleau J.C., Barling A.N., Franco J.G., De Capo M., Bagley J.L., Sullivan E.L. Exposure to a High-Fat Diet during Early Development Programs Behavior and Impairs the Central Serotonergic System in Juvenile Non-Human Primates. Front. Endocrinol. (Lausanne). 8: 164. 2017. https://doi.org/10.3389/fendo.2017.00164

  22. Pan Q., Liu Q., Wan R., Kalavagunta P.K., Liu L., Lv W., Qiao T., Shang J., Wu H. Selective inhibition of intestinal 5-HT improves neurobehavioral abnormalities caused by high-fat diet mice. Metab. Brain Dis. 34(3): 747–761. 2019. https://doi.org/10.1007/s11011-019-0392-x

  23. Park S., Harrold J.A., Widdowson P.S., Williams G. Increased binding at 5-HT(1A), 5-HT(1B), and 5-HT(2A) receptors and 5-HT transporters in diet-induced obese rats. Brain Res. 847(1): 90–97. 1999.

  24. Deguchi T., Barchas J. Regional distribution and developmental change of tryptophan hydroxylase activity in rat brain. J. Neurochem. 19 (3): 927–929. 1972.

  25. Burke L.K., Doslikova B., D’Agostino G., Garfield A.S., Farooq G., Burdakov D., Low M.J., Rubinstein M., Evans M.L., Billups B., Heisler L.K. 5-HT obesity medication efficacy via POMC activation is maintained during aging. Endocrinology. 155 (10): 3732–3738. 2014.

  26. Shpakov A.O., Derkach K.V., Berstein L.M. Brain signaling systems in the type 2 diabetes and metabolic syndrome: promising target to treat and prevent these diseases. Future Sci. OA. 1(3): FSO25. 2015. https://doi.org/10.4155/fso.15.23

  27. Doslikova B., Garfield A.S., Shaw J., Evans M.L., Burdakov D., Billups B., Heisler L.K. 5-HT2C receptor agonist anorectic efficacy potentiated by 5-HT1B receptor agonist coapplication: an effect mediated via increased proportion of pro-opiomelanocortin neurons activated. J. Neurosci. 33 (23): 9800–9804. 2013.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал