Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 10, стр. 1209-1237

1.1. Значение тромбоцитов в распространении метастазов

После выхода в кровоток раковые клетки подвергаются значительному стрессу из-за наличия градиента скорости потока крови в сосудах и активности NK-клеток, которые в норме очень быстро распознают и элиминируют раковые клетки. В связи с этим лишь очень небольшой процент попадающих в кровоток клеток способны образовать метастазы [55]. После выхода в просвет сосуда раковая клетка может выделять в кровь растворимые медиаторы, такие как ADP [56], тромбин [19], TxA2 [57] и HMGB1 (high-mobility group box 1 ) [58], связывающиеся с поверхностными рецепторами тромбоцитов и запускающие их локальную активацию. Некоторые типы опухолевых клеток (например, клетки сквамозно-клеточной карциномы или герминомы) могут экспрессировать на своей поверхности белок подопланин [59], который напрямую связывается с рецептором CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) на тромбоцитах, запуская их активацию [60]. Также раковые клетки разного происхождения могут связываться с тромбоцитарным рецептором FcγRIIa, индуцируя, таким образом, секрецию δ-гранул, содержащих ADP, серотонин и ряд факторов свертывания крови [61]. Помимо этого, некоторые раковые клетки экспрессируют на своей поверхности тканевой фактор (ТФ), который запускает генерацию тромбина и посредством этого активирует тромбоциты [62]. И, наконец, раковые клетки могут экспрессировать на своей поверхности интегрины, которые через связывание с vWF также активируют тромбоциты [63]. Следовательно, раковые клетки способны запускать активацию тромбоцитов самыми разными способами: (1) секретируя в кровь вторичные медиаторы активации, (2) образовывая прямой контакт с рецепторами на поверхности тромбоцитов, (3) опосредованно индуцируя выброс вторичных медиаторов, которые вызывают активацию тромбоцитов, и (4) связывая и активируя факторы, необходимые для активации тромбоцитов.

После активации тромбоциты взаимодействуют с поверхностью раковой клетки и покрывают ее оболочкой, состоящей из агрегировавших тромбоцитов и нитей фибрина. Молекулы, выделяемые тромбоцитами из α- и δ-гранул в ходе активации, подавляют цитотоксическую активность NK клеток [24, 64], а также поддерживают опухолевые клетки за счет выброса факторов роста и про-ангиогенных факторов [19]. На своей поверхности тромбоциты содержат большое количество молекул главного комплекса гистосовместимости I (MHC-I), и после адгезии к опухолевой клетке могут презентировать его NK-клеткам, помогая тем самым уклоняться от цитотоксического воздействия иммунной системы [65]. Кроме того, показана способность тромбоцитов предотвращать аноикоз (апоптоз, запускающийся в случае потери клеткой связи с соседними клетками) клеток рака яичника посредством активации YAP1 сигнального пути [66].

Помимо защиты от иммунной системы, физического стресса и предотвращения гибели опухолевых клеток, тромбоциты также могут способствовать успешной адгезии раковых клеток к стенке сосуда и их последующей экстравазации. Циркулирующие раковые клетки обычно заякориваются в пре-капиллярных артериолах или непосредственно в капиллярах [67]. При этом арест клетки к стенке сосуда может происходить путем физического захвата, когда диаметр клетки примерно равен диаметру сосуда, либо путем адгезии опухолевой клетки к эндотелию, а в случае поврежденных сосудов – к субэндотелиальному матриксу [68]. Участие тромбоцитов в случае физического захвата необязательно для образования контакта между опухолевой клеткой и поверхностью эндотелия [69], однако, наличие активированных тромбоцитов может способствовать аресту опухолевой клетки в сосудах с бо́льшим диаметром [67]. Ранее упоминалось, что на поверхности тромбоцитов содержится множество различных адгезионных молекул: интегрины (αIIbβ3, α2β1, α5β1, α6β1, αLβ2, αvβ3), рецепторы суперсемейства иммуноглобулинов (FcγRIIA, GPVI, ICAM-2, PECAM-1, JAM и кадгерин 6), рецепторы семейства лектинов C-типа (CLEC-2, P-selectin), GPIb-IX-V комплекс и др. [70]. Эти рецепторы опосредуют взаимодействие тромбоцитов в ходе активации с компонентами ECM (ламинином – через α6β1, фибронектином – через αIIbβ3, коллагеном – через α2β1 и фактором фон Виллебранда – через GPIb-IX-V), с другими тромбоцитами и с клетками других типов [71]. Посредством тромбоцитов образуется контакт между раковой клеткой и эндотелием сосуда, что может привести к заякориванию и последующему роллингу клетки вдоль эндотелия [72]. Жесткая адгезия к эндотелию по аналогии с лейкоцитами осуществляется за счет интегринов, CLEC-2 и P-селектина, экстернализующегося на мембране тромбоцитов после выброса α-гранул [73, 74]. Ингибирование этих белков, равно как и блокирование агрегации тромбоцитов, приводит к уменьшению образования метастазов [75]. Однако существует ряд данных, полученных как in vitro, так и in vivo, согласно которым тромбоциты рекрутируются уже после ареста опухолевой клетки к эндотелию [16, 17, 76]. Поэтому некоторые авторы придерживаются мнения, что в большинстве случаев тромбоциты не участвуют в самой адгезии опухолевой клетки к стенке сосуда, а необходимы лишь для поддержания этой адгезии [67].

Для завершения процесса экстравазации и выхода в мезенхимальную ткань опухолевой клетке необходимо пройти через слой эндотелиальных клеток. Для этого нужно либо ослабить контакт между соседними клетками эндотелия, либо вызвать их гибель путем апоптоза или некроза. В работе Schumacher с соавт. показано, что секретируемый во время активации из δ-гранул АТФ может связываться с рецептором P2Y₂ на эндотелиальных клетках, вызывая их ретракцию [77]. Данная работа была выполнена на мышах, нокаутных по необходимому для нормальной регуляции экзоцитоза белку Munc13-4. Однако другие авторы утверждают, что у нокаутных по Munc13-4 мышей помимо нарушения секреции плотных гранул в тромбоцитах, уменьшается секреция и α-гранул, что также могло повлиять на успешность метастазирования опухолевых клеток [78]. Далее, тромбоциты содержат множество факторов, регулирующих проницаемость сосудов, таких как серотонин, гистамин, эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), PAF (platelet activating factor), АТФ, HGF, фибриноген и 12(S)-HETE [67]. Эти факторы после активации тромбоцитов попадают в кровоток и могут способствовать ретракции эндотелиальных клеток. Тромбоциты во время активации могут выделять матриксные металлопротеазы (MMP) 1, 2, 3 и, по некоторым данным, 9 [79], гиалуронидазу 2 [80] и гепараназу [81], способствуя тем самым деградации базальной мембраны и экстраклеточного матрикса и облегчая инвазию раковой клетки [82]. В исследовании in vivo с использованием ксенографтовых клеток рака молочной железы человека удалось установить, что при ингибировании тромбоцитов блокируется образование новых метастазов у мышей [83]. Более того, уменьшение количества тромбоцитов практически полностью блокировало экстравазацию раковых клеток, и процент пролиферирующих клеток был ниже в легких животных со сниженным количеством тромбоцитов по сравнению с контролем [83]. Согласно данным Mammadova-Dach с соавт., в процессе метастазирования также принимает участие тромбоцитарный рецептор GPVI, который, взаимодействуя с галектином-3 на раковой клетке, способствует ее успешной экстравазации [84]. Более того, тромбоциты на своей поверхности содержат Fas лиганд, который при взаимодействии с Fas рецептором может индуцировать гибель клеток других типов [85], в том числе, эндотелиальных клеток во время сепсиса [86]. Однако раковые клетки сами способны вызывать гибель клеток эндотелия [87, 88], и прямых доказательств того, что тромбоциты могут участвовать в этом процессе, пока что нет.

В дополнение, тромбоциты могут опосредованно способствовать миграции опухолевой клетки через эндотелий путем рекрутирования иммунных клеток [89]. Лейкоциты, в частности моноциты и макрофаги, могут способствовать экстравазации раковой клетки путем секреции эндотелиального фактора роста сосудов A (VEGFA) [90], а также предотвращать клеточную гибель за счет связывания лейкоцитарных интегринов α4β1 или α4β7 с рецептором VCAM1 (vascular cell adhesion molecule-1) на раковых клетках, приводящего к активации Akt сигнального пути [91, 92]. В исследовании [89] была показана роль тромбоцитов в рекрутировании гранулоцитов к клеткам колоректальной карциномы, что способствовало их выживанию и успешной экстравазации. Однако, несмотря на множество статей, посвященных участию тромбоцитов в миграции опухолевых клеток через эндотелий, до сих пор не показана их прямая роль в деградации эндотелия и базальной мембраны. Известно, что раковые клетки сами по себе, без участия тромбоцитов, способны запускать гибель эндотелиальных клеток и последующую экстравазацию [67]. Эти данные свидетельствуют о том, что тромбоциты не являются необходимым звеном в процессах миграции раковых клеток через эндотелий, однако, в силу своих особенностей могут способствовать этому процессу.

1.2. Роль тромбоцитов в ангиогенезе опухоли

Долгое время считалось, что формирование первичной сети сосудов из ангиобластов (васкулогенез) происходит только на стадии эмбрионального развития организма, тогда как дальнейшее разветвление сети и образование капилляров из уже существующих сосудов (ангиогенез) начинается на поздних стадиях развития эмбриона и продолжается в течение всей жизни [93, 94]. В настоящее время установлено, что васкулогенез может протекать и во взрослом организме, например, при различных репаративных процессах, а также при опухолевых заболеваниях [95]. Опухоли, как и любому нормальному органу, необходимо сформировать сеть кровеносных сосудов для удовлетворения своих потребностей в кислороде и питательных веществах, а также для выведения продуктов обмена. Эта задача решается за счет запуска опухолевыми клетками процессов ангио- и васкулогенеза. Показано, что опухоль и ее микроокружение способны рекрутировать находящиеся в костном мозге эндотелиальные клетки-предшественницы, запускать их дифференцировку и последующее формирование сосудистых трубочек, сходных с эмбриональными [96]. Помимо костного мозга, источником ангиобластов могут служить резидентные стволовые клетки или стволовые клетки ракового происхождения [95]. При этом микроокружение опухоли может менять генетическую программу дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественниц и стволовых клеток, в результате чего эти клетки подвергаются анеуплоидии и различным генетическим аберрациям, что приводит к формированию аномальных сосудов [97]. Морфологически это выражается в отсутствии отдельных венул, артериол и капилляров, и образовании сети искаженных и расширенных сосудов, склонных к кровотечениям [97].

Ключевым фактором, запускающим рост новых сосудов, является гипоксия [98]. Раковые клетки, подверженные гипоксии, секретируют VEGFA, запускающий ангиогенез путем взаимодействия с рецептором VEGFAR2 на поверхности эндотелиальных клеток ближайшего сосуда [99]. Градиент растворимого VEGFA индуцирует образование подвижных эндотелиальных клеток, которые разрушают окружающий их экстраклеточный матрикс, что приводит к образованию нового отростка сосуда, направленного по градиенту увеличения VEGFA [98]. Многочисленные исследования показали, что опухолевый ангиогенез может быть индуцирован не только непосредственно опухолевыми клетками, но также микроокружением опухоли, клетками стромы и ассоциированными с опухолью макрофагами [25]. При этом еще два десятилетия назад было показано наличие активированных тромбоцитов в просветах опухолевых сосудов в ходе хирургического лечения пациентов с саркомой [100]. В дальнейшем было показано, что тромбоциты могут участвовать в процессах ангиогенеза in vivo, а исследования in vitro позволили установить, что тромбоциты могут запускать пролиферацию эндотелиальных клеток и формирование сосудистых трубочек после адгезии тромбоцитов к эндотелию, опосредованной гликопротеиновыми рецепторами на их поверхности [101]. Тромбоциты, наряду с эритроцитами, являются самыми многочисленными клетками крови и содержат в гранулах как проангиогенные (VEGF, PDGF, bFGF, PD-ECGF/TP, CXCL12) [99, 102, 103], так и антиангиогенные факторы (тромбоспондин-1, PF4, эндостатин, ангиостатин и др.) [104, 105], что делает их крупнейшим резервуаром регуляторов ангиогенеза в крови [102]. Более того, существуют данные о том, что про- и антиангиогенные факторы в тромбоцитах пространственно разделены и содержатся в разных α-гранулах, которые секретируются в ответ на различные стимулы (активация либо рецептора PAR1, либо PAR4) [105]. Однако механизмы распределения белков в α-гранулах, равно как и механизмы распределения самих гранул между тромбоцитами, до сих пор не показаны, в связи с чем результаты, полученные Italiano с соавт., вызывают много сомнений [105]. При этом другой группе, напротив, удалось показать, что активация обоих рецепторов PAR1 и PAR4 является исключительно стимулирующей для ангиогенеза в экспериментах как in vitro, так и in vivo, при этом эффект от рецептора PAR1 выражен сильнее [106]. В другом исследовании АДФ-индуцированная активация тромбоцитов приводила к стимуляции ангиогенеза, тогда как TxA2-стимулированная активация оказывала ингибиторный эффект на рост сосудов в экспериментах in vitro [107].

Исходя из данных литературы, можно сделать вывод, что активация и дегрануляция тромбоцитов являются проангиогенными факторами в контексте развития опухолей [98]. Показано, что тромбоциты больных с глиобластомой [108] и раком толстой кишки [109] содержат большее количество проангиогенных факторов (VEGF, PF4 и PDGF) по сравнению со здоровыми донорами, а также оказывают проангиогенный эффект на эндотелий, способствуя росту новых сосудов [108]. Недостаток тромбоспондина-1 в тромбоцитах приводит к разбалансированию действия про- и антиангиогенных факторов, что влечет за собой ускорение роста опухоли и ее васкуляризации [110]. Существуют данные о том, что экспрессирующийся на поверхности тромбоцитов лиганд рецептора CD40 (CD40L), взаимодействуя с рецептором CD40 на эндотелии, также способен запускать опухолевый ангиогенез [111]. Помимо этого, тромбоциты могут способствовать формированию новых сосудов путем запуска мобилизации миелоидных клеток из костного мозга, ускоряя при этом их хоуминг к опухоли [110]. В работе Kuznetsov с соавт. показано, что тромбоциты играют роль в запуске ангиогенеза покоящихся метастазов рака молочной железы, способствуя тем самым их росту и пролиферации [112]. При этом сами эндотелиальные клетки опухолевых сосудов содержат повышенное количество молекул ТФ на своей поверхности, который способствует генерации фибрина и тромбина и, как следствие, активации тромбоцитов [100, 113]. В связи с этим в опухолевых сосудах зачастую содержатся адгезировавшие тромбоциты, тромбоцитарные агрегаты или даже микротромбы [114]. Секретирующиеся в ходе активации тромбоцитов проангиогенные факторы далее воздействуют на эндотелиальные клетки, вызывают их деление и, таким образом, запускают ангиогенез [114]. При этом, что немаловажно, тромбоциты играют ключевую роль в предотвращении кровотечений в опухолевых сосудах. Продолжительный выброс регуляторных молекул из тромбоцитов приводит к стабилизации опухолевых сосудов, предотвращая их кровотечения и поддерживая дальнейший рост опухоли [115]. Уменьшение количества тромбоцитов приводит к замедлению созревания раковых сосудов и уменьшению их плотности [116]. Все эти данные свидетельствуют о том, что тромбоциты могут играть важную роль в ангиогенезе опухоли. Однако до сих пор открытым остается вопрос, могут ли сами тромбоциты запускать процессы ангио- и васкулогенеза опухоли, и являются ли тромбоциты неотъемлемой частью этих процессов.

1.3. Участие тромбоцитов в активации опухолевого роста

Помимо про- и антиангиогенных факторов, в тромбоцитарных α-гранулах содержатся также различные ростовые факторы (эпидермальный фактор роста – EGF, фактор роста гепатоцитов – HGF, инсулино-подобный фактор роста – IGF и TGFβ) [117], выделяющиеся после активации тромбоцитов и в норме участвующие в восстановлении поврежденного эндотелия. Известно, что содержащиеся в тромбоцитах TGFβ и bFGF способны in vitro ускорять пролиферацию раковых клеток [118]. Теоретически, при попадании в кровь эти факторы могут запускать внутрисосудистую пролиферацию раковых клеток и способствовать увеличению размера опухоли. Действительно, существуют данные о том, что тромбоциты увеличивают пролиферацию раковых клеток яичников in vitro и in vivo, тогда как блокирование белка TGF-β1 снижает их пролиферативный статус [119]. Однако в приведенной работе не было проверено, приводит ли уменьшение количества тромбоцитов к снижению уровня пролиферации раковых клеток, а также не были измерены размеры опухоли до и после трансфузии тромбоцитов. В другой работе, наоборот, показано, что тромбоцитопения приводит к уменьшению объема опухоли у мышей, тогда как трансфузия тромбоцитов практически не влияет на размер опухоли [120]. В работе, посвященной исследованию роли лизофосфатидной кислоты (LPA) в развитии рака, показано, что тромбоциты участвуют в запуске пролиферации клеток рака молочной железы [121]. Мышам вводили клетки линии MDA-BO2, которые образовывали метастазы в костной ткани животных. Было показано, что LPA через взаимодействие с рецептором LPA1 на раковых клетках запускает их пролиферацию, а также вызывает секрецию интерлейкинов 6 и 8, которые ответственны за резорбцию костной ткани. Основным источником LPA1 оказались именно тромбоциты, которые секретируют LPA в кровь в ходе активации. При этом блокирование активации тромбоцитов приводило к ингибированию как образования метастазов, так и резорбции кости. Однако в работе не были оценены размеры опухоли в опытных и контрольных образцах, поэтому невозможно оценить прямой вклад тромбоцитов в пролиферацию опухолевых клеток.

В работе Janowska-Wieczorek с соавт. было показано, что образующиеся в ходе активации тромбоцитов микрочастицы (МЧ) вызывают активацию киназ MAP каскада (Mitogen-activated protein kinases) в клетках линии карциномы легких и тем самым участвуют в запуске их пролиферации [22]. Более того, инкубирование клеток карциномы легких с тромбоцитарными МЧ приводило к повышению экспрессии MMP, что способствовало последующей миграции клеток через матригель. В другом исследовании показано, что ингибирование рецептора P2Y12 на тромбоцитах вызывало редуцирование роста первичной опухоли яичника у мышей на 60–70% по сравнению с контрольными значениями [26].

Однако в ряде работ показано, что тромбоциты не влияют на рост первичной опухоли в моделях in vivo. В исследовании, проведенном на мышах, нокаутных по Gαq белку с дефектной функцией тромбоцитов, рост меланомы B16-BL6 и карциномы Льюиса не изменялся по сравнению с контрольными животными [24]. Индуцированная тромбоцитопения не влияла на рост меланомы B16-F10 у мышей [116], и в экспериментах на нокаутных по ТПО (Tpo^–/–) также не удалось установить связи между тромбоцитами и ростом опухоли [122]. Эти данные дают основания полагать, что однозначного ответа о роли тромбоцитов в регуляции роста опухоли на сегодняшний день нет. Согласно имеющимся данным можно сделать вывод, что тромбоциты могут как способствовать, так и наоборот, ингибировать пролиферацию раковых клеток в зависимости от условий эксперимента и типа опухоли.

1.4. Тромбоцитарные микрочастицы и рак

Помимо уже описанных гранул трех типов, тромбоциты формируют и выбрасывают в кровоток МЧ, представляющие собой небольшие (100–1000 нм) тельца, окруженные цитоплазматической мембраной, которые образуются из участков цитоплазмы тромбоцита [123]. МЧ образуются в ходе активации или гибели тромбоцита, однако, часть из них имеет мегакариоцитарное происхождение. МЧ, выделяющиеся из тромбоцитов и мегакариоцитов, являются самыми многочисленными в человеческой крови, они несут на своей поверхности те же самые маркерные белки, что и тромбоциты, а их содержимое состоит из различных белков (факторы роста, цитокины, провоспалительные факторы и др.), матричной и микроРНК, играющих важную роль в регуляции физиологических и патологических процессов в организме [124].

Благодаря способности переносить свое содержимое другим клеткам, тромбоцитарные МЧ (ТМЧ) играют важную роль в межклеточной коммуникации [124], а также участвуют в процессах коагуляции [125]. На своей поверхности ТМЧ содержат те же самые поверхностные белки и рецепторы, что и тромбоциты [126], а взаимодействие ТМЧ с клетками-мишенями может привести к запуску физиологического ответа, например, активации тромбоцитов, эндотелиальных клеток или лейкоцитов [126]. При этом повышенное количество ТМЧ в крови связывают со множеством различных патологий сердечно-сосудистой системы, среди которых инфаркт миокарда, острый коронарный синдром, инсульт, тромбоэмболия сосудов, преэклампсия, артриты и др. [123]. У раковых больных с тромбоэмболией сосудов наблюдается повышенная прокоагуляционная активность ТМЧ, а увеличение их количества в ряде онкологических заболеваниях коррелирует с более агрессивным фенотипом опухоли, неблагоприятными прогнозами и образованием метастазов [29]. Активация тромбоцитов раковыми клетками приводит к увеличению образования ТМЧ, которые, в свою очередь, способствуют развитию рака и ассоциированного с раком тромбоцитоза [127]. ТМЧ могут стимулировать миграцию и инвазию раковых клеток, при этом более агрессивный фенотип опухоли активней взаимодействует с ТМЧ по сравнению с менее агрессивным [128]. Также установлена связь между ТМЧ и процессом ангиогенеза. ТМЧ стимулируют пролиферацию, выживание, адгезию и обеспечивают хемотаксис гемопоэтических клеток, а также способствуют формированию капиллярных трубочек in vitro [129]. Показано, что ТМЧ могут запускать экспрессию проангиогенных факторов (MMP9, VEGF, IL8 и HGF) в различных линиях клеток рака молочной железы [22]. Помимо этого, инкубирование некоторых линий клеток рака молочной железы и легких с ТМЧ in vitro приводило к активации киназ MAP каскада и Akt сигнального пути, в результате чего увеличивался уровень пролиферации клеток и секреция мембран-связанной MMP 1 типа (MP1-MMP), участвующей в процессах инвазии раковых клеток [22, 130]. ТМЧ также увеличивают инвазивность клеток рака простаты путем запуска продукции MMP-2 [131]. Однако в экспериментах с клетками рака молочной железы человека ТМЧ, образовавшиеся после активации тромбоцитов арахидоновой кислотой, вызывали арест клеточного цикла, уменьшали миграционную активность и увеличивали чувствительность раковых клеток к противоопухолевым препаратам [132]. Эти данные явно свидетельствуют о том, что физиологический ответ клеток на ТМЧ зависит от активационного стимула, вызывающего их генерацию, и может иметь как позитивные, так и негативные последствия.

Известно, что ТМЧ могут транспортировать различные белки и даже функционально активные митохондрии, однако в последнее время основное внимание сфокусировано на их способности передавать генетическую информацию в виде микроРНК другим клеткам [133]. МикроРНК относятся к некодирующим РНК и транскрибируются в ядре при помощи РНК полимеразы II типа [134]. После первичных модификаций пре-микроРНК транспортируется из ядра в цитозоль при помощи экспортина 5, где претерпевает конечные модификации, связывается со специфичным Ago2 белковым комплексом [135], защищающем ее от деградации, и становится активной микроРНК, способной связываться с 3'-некодирующим концом на таргетной мРНК, супрессируя ее активность. [136]. Таким образом, микроРНК участвует в пост-транскрипционной регуляции активности ряда генов [136]. Существует множество свидетельств того, что микроРНК может секретироваться и попадать в другие клетки, вызывая изменение их функций [124]. В то же время, большая часть микроРНК попадает в межклеточное пространство случайно в результате апоптоза, некроза или секреторных процессов, и не обладает какой-либо специфичной функциональной активностью [137].

В тромбоцитах синтез микроРНК de novo не происходит, поэтому весь пул содержащихся в них РНК (в том числе и пре-микроРНК) имеет мегакариоцитарное происхождение. Однако тромбоциты содержат белки, необходимые для созревания микроРНК, следовательно, способны образовывать функционально активные микроРНК, участвующие в регуляции функций тромбоцитов [138]. Образующиеся во время активации МЧ отражают содержимое цитоплазмы тромбоцита в момент активации и несут в себе тот же репертуар микро- и мРНК. ТМЧ действительно могут переносить и трансфецировать молекулы РНК в другие клетки, и, таким образом, модулировать активность некоторых генов, однако результат очень сильно варьирует в зависимости от условий эксперимента [48]. Например, содержащаяся в ТМЧ miR-939 после трансфекции в клетки эпителиального рака яичника запускает эпителиально-мезенхимальный переход путем снижения экспрессии E-кадгерина, а также повышения уровня экспрессии N-кадгерина, виментина, фибронектина и некоторых других генов, участвующих в процессе приобретения клетками мезенхимных свойств [139]. MiR-223 при попадании в клетки рака легких вызывает снижение экспрессии белка EPB41L3, относящегося к опухолевым супрессорам, приводя, таким образом, к увеличению их инвазивного потенциала [140]. Помимо вклада в прогрессию опухолей, некоторые содержащиеся в ТМЧ микроРНК участвуют в формировании резистентности опухолей к терапии. MiR-24-3p способствует формированию резистентности клеток мелкоклеточного рака легких к комбинированной терапии этопозидом и цисплатином путем активации автофагии [141]. В экспериментах на раковых клеточных линиях A2780DX5 и KB-V1 было показано, что miR-27a и miR-451 участвуют в активации экспрессии P-гликопротеина, который является продуктом гена MDR1 и относится к белкам множественной опухолевой резистентности [142]. Помимо этого, трансфекция тромбоцитарных микроРНК let-7a и miR-27b в эндотелиальные клетки приводит к супрессии тромбоспондина-1, который является ингибитором ангиогенеза и, тем самым, способствует формированию сосудистых трубочек в экспериментах in vitro [143, 144]. Эти данные явно свидетельствуют о вовлеченности тромбоцитарных микроРНК в процессы регуляции ангиогенеза в организме, а также о возможном вкладе в развитие рака путем индукции роста опухоли и модификации активности таргетных белков в клетках. Однако существующие на сегодняшний день данные литературы противоречивы, что может быть связано с использованием различных моделей в изучении роли микроРНК, а также с выбором модельного объекта (типы микроРНК и клетки-мишени).

1.5. Ингибиторный эффект тромбоцитов в развитии опухолей

Несмотря на общепринятую концепцию о вкладе тромбоцитов в развитие и распространение опухолей, а также на огромное количество данных ее подтверждающих, некоторые работы свидетельствуют о том, что тромбоциты в некоторых случаях могут оказывать ингибирующий эффект на развитие опухоли и ее метастазирование [67]. Показано, что количество метастазов в печени у мышей увеличивается значительнее в случае сопутствующего ингибирования тромбоцитов и NK-клеток, нежели в случае ингибирования только NK-клеток. Однако в легких наблюдалась совершенно обратная ситуация, и метастазов было меньше у животных в случае одновременного ингибирования NK-клеток и тромбоцитов [145]. В другом исследовании у Tpo^–/– мышей c пониженным количеством тромбоцитов введение изологичных клеток карциномы приводило к более раннему появлению метастазов и увеличению их общего числа по сравнению с контрольными Tpo^+/+ животными [146]. В двух изологичных моделях с использованием клеток рака молочной железы у Tpo^–/– мышей наблюдалось увеличение метастазирования лимфатических узлов по сравнению с контролем [122]. Известно об участии тромбоцитарного фактора-4 (PF4/CXCL4) в опухолевой супрессии, а также в процессах ингибирования ангиогенеза путем блокирования пролиферации и миграции эндотелиальных клеток [147]. При этом совместное культивирование тромбоцитов с клетками меланомы и рака простаты приводило к ингибированию пролиферации раковых клеток [147].

В последнее время появляется все больше данных об участии тромбоцитарных микроРНК в ингибировании опухолей. Некоторые авторы считают, что ТМЧ и содержащаяся в них микроРНК поддерживают прогрессию и метастазирование рака скорее на поздних стадиях, тогда как на более ранних стадиях играют роль супрессоров [48]. Показано участие тромбоцитарной miR-24 в индукции апоптоза опухолевых клеток в моделях in vitro и in vivo [148]. Прямыми мишенями miR-24 оказались малые ядерные некодирующие РНК mt-Nd2 и Snora75, ингибирование которых приводило к дисфункции митохондрий и блокированию роста опухолевой клетки [148]. Две другие тромбоцитарные микроРНК miR-223 и miR-126 способны индуцировать арест клеточного цикла, блокировать миграцию и увеличивать чувствительность клеток рака молочной железы человека к цисплатину [132, 149–151]. К мишеням miR-126 также относят белок VEGF, который является одним из ключевых факторов ангиогенеза [152], в то время как miR-223 ингибирует формирование новых сосудов путем блокирования интегрина β1 и передачи сигнала от ростовых факторов в эндотелиальных клетках [153].

В некоторых случаях тромбоциты могут блокировать развитие и метастазирование опухолей. Противоречивые результаты в данном случае можно объяснить различиями в условиях и модели экспериментов, используемых в разных исследованиях.

2.1. Антитромбоцитарная терапия в лечении опухолей

Аспирин, относящийся к классу нестероидных противовоспалительных препаратов, на сегодняшний день является одним из самых популярных лекарств в мире. В терапевтических дозах аспирин блокирует синтез простаноидов, таким образом, оказывая противовоспалительное, антикоагуляционное, анальгетическое и жаропонижающее действия [155]. Основной эффект аспирина опосредован необратимым ингибированием циклооксигеназ 1 и 2 (ЦОГ1 и ЦОГ2), обеспечивающих синтез простагландинов из арахидоновой кислоты (АК) в клетке. Блокирование ЦОГ1 приводит к ингибированию синтеза TxA2, который является одним из вторичных медиаторов активации и основным продуктом метаболизма АК в тромбоцитах [156]. В отличие от ЦОГ1, ЦОГ2 в норме синтезируется только некоторыми типами тканей (например, эндотелий), в то время как повышенная экспрессия ЦОГ2 характерна для многих типов опухолей. ЦОГ2 путем синтеза простагландина Е2 активирует пролиферацию раковых клеток, запускает процессы воспаления, участвует в ангиогенезе опухоли, а также способствует уклонению раковых клеток от действия иммунной системы [157]. Согласно фармакологическим данным, аспирин в низких дозах (75–160 мг ежедневно) блокирует активацию тромбоцитов и предотвращает их взаимодействие с раковыми клетками в циркуляции [29]. Этот эффект обусловлен низким уровнем синтеза белка в тромбоцитах, поэтому даже небольшие дозы аспирина вызывают блокирование ЦОГ1, сохраняющееся в течение длительного времени [158]. Однако малые дозы аспирина не способны поддерживать длительное ингибирование ЦОГ2 в ядерных клетках, поскольку синтез ЦОГ2 de novo восстанавливает ее активность в течение нескольких часов [159]. При этом более высокие дозы аспирина (650 мг ежедневно) успешно поддерживают блокирование активности ЦОГ2 в течение суток даже в ядерных клетках [160]. Согласно результатам клинических исследований, ежедневное применение аспирина снижает риск возникновения опухоли [161] и уменьшает смертность среди пациентов с раком толстой кишки [162], а также предотвращает рецидив аденомы толстой кишки [163, 164]. В то же время другие исследователи не находят связи между приемом аспирина и снижением риска возникновения аденомы толстой кишки [165]. Возможно, это связано с разным уровнем экспрессии ЦОГ2 в раковых клетках исследуемых больных. Так, прием аспирина на ежедневной основе уменьшал риск образования колоректального рака только у пациентов с оверэкспрессией гена ЦОГ2 и не влиял на развитие рака у пациентов с нормальным уровнем ЦОГ2 [166]. Помимо рака толстой кишки, есть данные об эффективности аспирина при раке молочной [104] и поджелудочной железы [167], раке желудка [168] и простаты [169]. Последующие исследования позволили установить, что противоопухолевый эффект аспирина также может быть связан с блокированием активности тромбоцитов [157]. Аспирин способен блокировать про-ангиогенный сигнал от тромбоцитов [104] и способствовать снижению метастазирования [170]. Однако до сих пор нерешенным остается вопрос, связан ли основной ингибирующий эффект аспирина с блокированием активации тромбоцитов, или с непосредственным влиянием на раковые клетки. Небольшие и часто спорные преимущества использования аспирина в противоопухолевой терапии не перевешивают его недостатки в виде побочных эффектов, главным из которых являются кровотечения. Поэтому в большинстве развитых стран аспирин все же не рекомендуется к использованию для предотвращения образования первичной или вторичной опухоли у пациентов [157].

Другим широко применяемым антикоагулянтом в клинике является клопидогрель. Клопидогрель, относящийся к тиенопиридинам второго поколения, приобретает активную форму только после трансформации ферментами печени, в связи с чем его действие отложено во времени [171]. Клопидогрель оказывает выраженное антикоагуляционное действие за счет ингибирования рецептора P2Y12, активация которого является одним из ключевых факторов запуска агрегации и дегрануляции тромбоцитов [172]. Согласно данным клинических испытаний, клопидогрель способствует снижению риска возникновения рака толстой кишки у пациентов [173]. Однако в ретроспективном исследовании 2015 г. не было выявлено взаимосвязи между приемом клопидогреля и снижением риска развития рака молочной железы, простаты или толстой кишки [174]. Мета-анализ клинических исследований также не выявил связи между применением клопидогреля и снижением вероятности развития рака у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и цереброваскулярными нарушениями [175]. При этом клопидогрель не снижал риск развития инфаркта миокарда или инсульта, а также увеличивал возможность образования кровотечений у больных [175]. Более того, была обнаружена связь между применением прасугреля, другого специфичного ингибитора рецептора P2Y12, также относящегося к тиенопиридинам, и развитием рака [176]. Анализ данных клинических исследований по влиянию комбинационной антитромбоцитарной терапии (прасугрель в сочетании с аспирином, либо клопидогрель в сочетании с аспирином) на пациентах, подвергавшихся чрезкожному коронарному вмешательству, позволил установить, что частота новообразований, особенно в легких и толстом кишечнике, была значительно выше у пациентов, принимавших прасугрель [177]. При этом смерть от рака также была выше в группе, принимавшей прасугрель. В противоположность этим данным, недавние систематические обзоры и анализ мета-данных позволили установить, что частота появления злокачественных новообразований не различается у пациентов, принимающих прасугрель или клопидогрель, также не было обнаружено различий в частоте случаев образования рака и смертности между группами, получавшими тиенопиридины, аспирин или плацебо [178]. В результате другого довольно большого исследования был сделан вывод, что люди, принимавшие аспирин, менее расположены к риску заболевания раком, а комбинация аспирина с клопидогрелем приводит к еще большему снижению этого риска [179]. На сегодняшний день противоопухолевая активность тиенопиридинов и их производных является спорным вопросом, который требует дополнительного проведения контролируемых клинических исследований.

Перспективным направлением в антитромбоцитарной терапии является разработка и применение антагонистов αIIbβ3 (или GPIIb/IIIa) рецептора. Интегриновый рецептор αIIbβ3 специфичен для МК и тромбоцитов и представляет собой гетеродимер, состоящий из α2- и β3-субъединиц, который в активированном состоянии может связываться с фибриногеном, vWF, фибрином и фибронектином [180]. Главная роль рецептора αIIbβ3 заключается в связывании фибриногена на поздних стадиях активации тромбоцитов, необходимого для успешной агрегации [180]. Рецептор αIIbβ3 играет важную роль в индуцированной опухолью агрегации тромбоцитов [177]. Более того, αIIbβ3 может синтезироваться самими раковыми клетками, принимая участие в процессах адгезии и инвазии [181]. Применение различных ингибиторов αIIbβ3 приводит к значительному снижению метастазирования в экспериментальных моделях, поэтому некоторые исследователи высказывали предположение возможного использования блокаторов αIIbβ3 в противоопухолевой терапии [182, 183]. Среди αIIbβ3 ингибиторов в клинике используются абциксимаб, эфптифибатид и тирофибан, которые вводятся пациенту внутривенно. Однако их применение ограничено из-за высокого риска развития кровотечений и оправдано только при острых симптомах, например, в терапии острого коронарного синдрома или при чрезкожном коронарном вмешательстве [181]. В этой связи длительное применение подобных препаратов в противоопухолевой терапии для предотвращения метастазирования является нецелесообразным. Следующим витком эволюции αIIbβ3 блокаторов стала разработка пероральных препаратов, специфически связывающихся с RGD последовательностью на рецепторе, однако, клинические исследования так и не были завершены из-за недостаточного положительного эффекта и увеличения смертности пациентов [184]. Впоследствии появилась идея изменить стратегию блокирования и воздействовать исключительно на активированную форму рецептора. Это позволило бы использовать гораздо меньшие концентрации блокатора и избежать нежелательных побочных эффектов, поскольку препарат будет скапливаться главным образом в очагах активации тромбоцитов [181]. Так, первым был разработан scFvMA2, представляющий собой одноцепочечное антитело, связывающее активную форму αIIbβ3 [185]. Следующими стали низкомолекулярные соединения RUC-2 и его более усовершенствованный аналог RUC-4, обнаруженные в ходе высокопроизводительного скрининга, которые специфически связываются с ион-зависимым адгезионным сайтом (MIDAS) на β3 субъединице рецептора [186]. Однако до сих пор открытым остается вопрос, обладают ли подобные препараты противоопухолевой активностью и могут ли использоваться в качестве адъювантной терапии в клинике.

Тромбиновый рецептор PAR-1 является гораздо менее популярным в антитромбоцитарной терапии по сравнению с аспирином и блокаторами P2Y12, однако, все же представляет большой интерес для клиницистов из-за важной роли в развитии различных патологий и опухолевых заболеваний. PAR-1 представляет собой рецептор, ассоциированный с G-белком, который активируется в результате протеолитического расщепления внеклеточного N-концевого домена [187]. PAR-1 активируется плазмином, трипсином, тканевым фактором, активным белком С, матриксным металлопротеазами и некоторыми факторами крови, однако, главным его лигандом является тромбин, который запускает канонический путь активации рецептора [188]. Тромбин является одним из главных активаторов тромбоцитов, который запускает выброс вторичных медиаторов активации, а также опосредует превращение неактивного фибриногена в активные мономеры фибрина, необходимые для завершения формирования стабильного тромба [189]. Помимо тромбоцитов, PAR-1 рецептор обнаруживается на других типах клеток крови, за исключением эритроцитов, а также на эпителиальных клетках, нейронах, астроцитах и клетках иммунной системы [188]. Более того, PAR-1 присутствует на поверхности раковых клеток различного происхождения и клеток микроокружения, где в отличие от нормальных тканей рецептор находится в конститутивно активированном состоянии [190]. Оверэкспрессия PAR-1 в раковых клетках увеличивает инвазивность и способствует диссеминации раковых клеток, поэтому для некоторых типов рака связана с неблагоприятными прогнозами течения заболевания [191]. Помимо этого, PAR-1 способствует росту и выживаемости раковых клеток, вовлечен в процессы эпителиально-мезенхимального перехода, метастазирования и ангиогенеза опухоли [190]. Следовательно, применение препаратов, направленных на ингибирование PAR-1 рецептора, позволит не только минимизировать вклад тромбоцитов в развитие опухолей, но также воздействовать напрямую на раковые клетки посредством модуляции активности поверхностных рецепторов. Первым одобренным к использованию в клинике блокатором PAR-1 рецептора стал ворапаксал, который, согласно клиническим исследованиям, оказался эффективен в лечении периферической артериальной болезни, легочной гипертензии, острого коронарного синдрома и ряда других заболеваний [190]. Однако данные о влиянии ворапаксала на опухолевые заболевания все еще очень ограничены. Известно, что ворапаксал способен ингибировать пролиферацию клеток рака яичника in vitro [192]. Вторую стадию клинических испытаний прошел атопаксар и проходит PZ-128, которые также обладают антикоагуляционным эффектом [193, 194]. Атопаксар путем ингибирования JAK/STAT сигнального пути вызывал арест клеточного цикла и апоптоз раковых клеток in vivo [195]. Однако влияние блокаторов PAR-1 рецептора на развитие опухолевых заболеваний недостаточно изучено для проведения клинических испытаний.

Помимо упомянутых выше, клинические испытания также проходят ингибитор фосфодиэстераз 5 и 3 дипиридамол и аналоги простациклина [177]. Фосфодиэстеразы (PDE) катализируют гидролиз циклических мононуклеотидов, снижая количество цАМФ и цГМФ в тромбоцитах и модулируя тем самым активность ингибиторных сигнальных путей [196]. Дипиридамол используется в клинике как антитромбоцитарный препарат для лечения инсульта и в качестве вазодилатирующего агента [196]. Несколько довольно старых клинических исследований показали эффективность дипиридамола в лечении меланомы [197] и рака поджелудочной железы [198]. Однако согласно результатам других исследований не было обнаружено положительного влияния дипиридамола в терапии саркомы, колоректального рака, рака простаты, молочной железы и почечно-клеточного рака [177]. Что касается аналогов простациклина, синтетический аналог PGI2 илопрост проходит клинические исследования на больных раком легких и в качестве химиопрофилактики на людях с высоким риском развития рака легких [199, 200]. На сегодняшний день использование илопроста и его аналогов в качестве антитромбоцитарной терапии является спорным вопросом [201].

2.2. Использование тромбоцитов для таргетной терапии опухолей

Благодаря способности тесно взаимодействовать с раковыми клетками, тромбоциты были выбраны в качестве возможного переносчика для таргетной доставки противоопухолевых препаратов напрямую к раковым клеткам. Такой способ доставки позволит минимизировать побочные эффекты, связанные с неспецифическим воздействием препарата, и увеличить время его циркуляции за счет уменьшения физиологического выведения. Существует два способа доставки препаратов при помощи тромбоцитов в противоопухолевой терапии: загрузка препаратов непосредственно в тромбоциты и использование нагруженных препаратами нано- или микрочастиц, покрытых мембраной тромбоцитов [177].

В рамках первого подхода проводились исследования по таргетной доставке доксорубицина при помощи тромбоцитов в клетки аденокарциномы легких в моделях in vitro и in vivo [202]. Доксорубицин относится к группе антрациклиновых антибиотиков и является известным цитостатиком, широко применяемым в химиотерапии опухолей различного происхождения [203]. Нагрузка доксорубицином не оказывала существенного влияния на функции тромбоцитов, при этом эффективность действия препарата была значительно выше по сравнению с введением свободной формы доксорубицина в той же дозе [202]. В другом исследовании использование нагруженных доксорубицином тромбоцитов, конъюгированных с анти-CD22 моноклональными антителами, приводило к уменьшению токсичности доксорубицина и увеличению его противоопухолевой активности против B-клеточной лимфомы [204]. Для элиминации раковых клеток в циркуляции был предложен способ генно-инженерного встраивания на поверхность цитоплазматической мембраны тромбоцитов молекул TRAIL, которые являются лигандом широко представленных на раковых клетках рецепторов смерти [205]. Тромбоциты, несущие TRAIL, запускали гибель раковых клеток in vitro и значительно снижали количество метастазов рака простаты у мышей в моделях in vivo [205]. Однако использование тромбоцитов для таргетного воздействия на раковые клетки имеет свои недостатки. Поскольку тромбоциты являются очень сложными образованиями, чутко реагирующими на любые изменения в их окружении, даже незначительные физические воздействия (центрифугирование, отмывка, температурные изменения) могут привести к активации тромбоцитов, что усложняет их использование и процесс хранения [206]. При этом важным нерешенным вопросом остаются последствия применения генной инженерии на экспрессию эндогенных белков в тромбоцитах [206]. В связи с этим в последнее время более популярными становятся работы с использованием наночастиц, покрытых тромбоцитарной цитоплазматической мембраной, которые лишены описанных недостатков.

Применение наночастиц, состоящих из внутреннего ядра на основе наногеля, нагруженного доксорибуцином, и мембраны тромбоцитов со встроенным TRAIL, приводило к снижению количества циркулирующих раковых клеток и блокированию образования метастазов в модели in vivo [207]. В другом исследовании конструирование наночастиц из черного фосфора в качестве ядра и мембраны тромбоцитов в качестве оболочки позволили потенцировать противораковое действие гедерагенина, природного тритерпеноида, выделяемого из плюща [208]. Сам по себе гедерагенин обладает низкой токсичностью, однако, его противоопухолевая эффективность ограничена при прямом введении в свободной форме. Использование микрочастиц, нагруженных гедерагенином, приводило к снижению пролиферации и выживаемости раковых клеток за счет запуска митохондриального апоптоза, увеличению образования активных форм кислорода и активации процесса автофагии [208].

Наночастицы из золота, покрытые химерной цитоплазматической мембраной, состоящей из фрагментов мембраны тромбоцитов и эритроцитов, в которую были добавлены гидрофобные молекулы куркумина, продемонстрировали способность таргетной доставки препарата раковым клеткам [209]. Для подобных конструктов характерны увеличенное время жизни в циркуляции и уклонение от воздействия иммунной системы за счет содержания компонентов эритроцитарной мембраны, а также способность напрямую взаимодействовать с раковыми клетками, благодаря компонентам мембраны тромбоцитов. При этом таргетная доставка куркумина позволила потенцировать его противоопухолевую активность за счет увеличения биологической доступности [209].

Группа ученых из Индии предложила достаточно простой и удобный способ доставки противораковых препаратов путем использования микрочастиц, выделяемых самими тромбоцитами во время активации. Для этого тромбоциты выделяли из цельной крови, нагружали доксорибуцином и затем активировали кальциевым ионофором для получения МЧ [210]. Подобная методика позволила избежать ответа иммунной системы и увеличить активность доксорибуцина против клеток лейкемии, выделенных из крови больных [210].

Методика таргетной доставки препаратов при помощи покрытых мембраной микрочастиц, несомненно, является многообещающей в терапии опухолевых заболеваний, однако все же не лишена недостатков. Для достижения необходимого терапевтического эффекта требуется довольно большое количество частиц, а, следовательно, и клеток, из которых они выделяются [211]. Доработки требует процесс выделения мембраны тромбоцитов, поскольку в ходе процедуры происходит большая потеря клеток, служащих строительным материалом для частиц. Для того, чтобы добиться широкого применения, должны быть усовершенствованы методы и упрощен протокол получения микрочастиц [211]. Также должны быть подробно исследованы последствия применения подобной терапии для организма в целом. Метод использования покрытых мембраной микрочастиц демонстрирует хороший потенциал в терапии различных заболеваний, однако, для проведения клинических испытаний необходимо проведение дальнейших исследований и устранение упомянутых выше недостатков.

2.3. Тромбоциты в диагностике раковых заболеваний

Ранняя диагностика и своевременная терапия значительно увеличивают шансы пациентов в борьбе с раковыми заболеваниями. Связь между тромбоцитозом и развитием рака была установлена более века назад, и за это время накопилось большое количество свидетельств участия тромбоцитов в прогрессировании опухолей. Рак может брать под контроль процессы продукции тромбоцитов, а также напрямую воздействовать на тромбоциты, вынуждая систему коагуляции работать в своих интересах. При этом из-за способности избирательно поглощать некоторые компоненты плазмы, в том числе микровезикулы, выделяемые другими клетками, сами по себе тромбоциты могут служить своеобразным индикатором происходящих в организме изменений [154]. Показана способность тромбоцитов связывать белки и поглощать РНК-содержащие микровезикулы, выделяемые раковыми клетками, в моделях in vivo как у животных, так и у раковых больных [212, 213]. Некоторые исследователи считают, что путем изменения экспрессии генов в МК и репертуара тромбоцитарных РНК, опухоль способна влиять на тромбоциты, делая их более полезными для развития и распространения рака (так называемые обученные опухолью тромбоциты) [213, 214]. В тромбоцитах раковых больных в отличие от тромбоцитов здоровых людей представлен другой паттерн белков и нуклеиновых кислот [215]. Благодаря своей доступности и многочисленности, тромбоциты могут стать идеальной моделью для ранней диагностики раковых заболеваний. Так, группе Best с соавт. по сиквенсу тромбоцитарных мРНК удалось не только отличить здоровых доноров от раковых больных (96% точность), но также определить место локализации первичной опухоли более чем в половине случаев (точность до 71% в зависимости от типа опухоли) [216].

ТМЧ, способные менять свое количество, репертуар содержащихся в них РНК и белков в зависимости от изменения поступающих в тромбоциты сигналов также могут использоваться в качестве маркера в диагностике. У больных колоректальным раком или раком поджелудочной железы наблюдается увеличение общего числа и повышенная прокоагулянтная активность ТМЧ, которая снижается в периоды ремиссии [217]. Подобные изменения характеристик ТМЧ могут использоваться в качестве биомаркера, отражающего эволюцию заболевания [217]. В исследовании, проведенном на больных немелкоклеточным раком легких также показано увеличение количества МЧ эндотелиального и тромбоцитарного происхождения у больных, которое снижалось после проведения терапии [218]. Более того, на основании анализа МЧ был сделан одногодичный прогноз результата лечения пациентов с продвинутой стадией развития рака [218]. Эти данные звучат многообещающе и, возможно, использование анализа тромбоцитарных белков и ТМЧ станет новым прорывом в диагностике рака, который позволит остановить развитие опухолей на ранних стадиях и предотвратить образование метастазов.