Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 4, стр. 474-485

Спектры поглощения роговицы

После 5–6 ч световой адаптации рыб обездвиживали, помещая в раствор MS222 (Sigma Co., США), затем декапитировали. Для изготовления препарата роговицы рыб использовали метод, описанный ранее [7]. Роговицу выделяли из глаза, после чего помещали под покровное стекло в нескольких каплях фосфатного буфера. Спектры пропускания на отдельных участках целой роговицы измеряли с помощью спектрометра USB2000+ (Ocean Optics Co.) [13]. Для подведения и отведения света использовали световоды с диаметром 0.6 мм и источник с галогенной лампой HL-2000 этой же фирмы.

Микроспектрофотометрия

Методика микроспектрофотометрического исследования фоторецепторов сетчатки подробно и неоднократно была описана ранее [27, 28]. Для измерений использовали микроспектрофотометр оригинальной конструкции [29] с записью результатов в файлы на персональном компьютере. Регистрировали спектры поглощения наружных сегментов изолированных фоторецепторов (25 рыб, 470 учтенных спектров). Записи обрабатывали с помощью компьютерной программы MSP-PRO, переданной нам ее автором В.И. Говардовским (ИЭФБ РАН, Санкт-Петербург), и принципы работы которой были описаны ранее [27]. Программа аппроксимирует данные измерений в предположении, что результат представляет собой суперпозицию спектров пары пигментов в определенной пропорции, построенных из одного и того же опсина и разных хромофоров – ретиналя (A1) или 3-дегидроретиналя (А2). Таким образом были определены состав зрительных пигментов (А1-родопсины, А2-порфиропсины или их смесь) и средние величины максимумов поглощения (λ_макс). Стандартное отклонение λ_макс для всех типов фоторецепторов составляло 2–5 нм.

Использовали два вида простых физиологических растворов (pH 7.2–7.4): один – стандартный, содержащий ионы Cl^– в форме NaCl в обычной концентрации для морских (0.9%-ный или 170 мM) или пресноводных (0.6%-ный) рыб, а другой – без ионов Cl^–, в котором использовалась бидистиллированная вода, и где NaCl был заменен на NaNO₃ в той же концентрации (170 мM). Эксперименты с влиянием бесхлорной среды проводили только с сетчаткой морских рыб спустя 1 ч после вымачивания сетчатки в этом растворе при 2–4°С. Поскольку известно, что ионохромный эффект проявляется на зрительных пигментах типа LWS [23, 24], его наличие проверялось только у двойных колбочек, имевших наиболее длинноволновые пигменты. Продолжительность каждого эксперимента с записями спектров не превышала 2 ч, во время которых полностью сохранялась целостность наружных сегментов фоторецепторов.

Условия экспериментов соответствовали правилам работы с животными, установленными Комитетом по этике Национального научного центра морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.

Спектры поглощения роговицы и фоторецепторов в обычном физиологическом растворе

После содержания рыб на свету в течение 2 ч оптическая плотность роговицы у T. xantopterus, Takifugu chinensis и D. fluviatilis достигала максимально возможных значений от 0.5 до 2 лог. единиц (полная световая адаптация). Пересчет спектров в виде кривой пропускания сглаживает максимумы, характерные для каротиноидов, и показывает, что на ярком свету эти роговицы максимально поглощают свет от 40 до 99% в диапазоне 420–500 нм (рис. 1A, D)

Рис. 1.

Микроспектрофотометрия колбочек и роговиц рыб отряда Tetraodontiformes. Средние значения положения максимумов кривых, состав смесей А1/А2 и количество измерений представлены в таблице. Кривые для пигментов получены после наилучшей аппроксимации стандартными кривыми для A1, A2 или их комбинации (A1 + A2) [27]. А – Рыбы-фугу. Takifugu xanthopterus: короткий штрих – одиночные колбочки, длинный штрих – MW-членик, сплошная линия – LW-членик. Правая ось ординат – пропускание дорсальной части роговицы: пунктир – T. chinensis; штрих-пунктир – T. xanthopterus. B – Двойные колбочки рыбы-фугу T. xanthopterus в нормальном растворе (заливка) и в бесхлорной среде (открытые символы). 1, 3 – LW-членики; 2, 4 – MW-членики. Черные кривые – аппроксимация, серая кривая – сглаживание экспериментальных данных методом скользящей средней. C – Cпинорог Thamnaconus modestus. 1 – LW-членики двойных колбочек; 2 – MW-членики двойных колбочек; 3 – одиночные колбочки. Кривая для 1 – A2, кривая для 2 – комбинация A1/A2. Штриховая кривая для 3 – комбинация 50% A1 + 50% A2. D. Колбочки и роговица иглобрюха Dichotomyctere fluviatilis. Аппроксимация стандартной кривой для порфиропсина: 1 – LW-членики двойных колбочек; 2 – MW членики двойных колбочек; 3 – одиночные колбочки. 4 – пропускание роговицы в состоянии максимальной световой адаптации, относится к правой шкале Y. Fig. 1. MSP data of absorbance spectra of cones and corneas of some species from Tetraodontiformes. Mean λ_max value of the pigment mixtures and its components, corresponding A1/A2 ratio of the components and the number of cell measured are presented in the Table. Smooth curves for the pigments are the best fits of the normalized data using templates for A1 and A2 pigments [27]. A – Fugu-fish. Takifugu xanthopterus: short dash – single cones; long dash – MW member of double cones; solid line – LW member of double cones. Right Y-axis—transmittance of the dorsal part of the cornea: dotted line – T. chinensis, dash-dotted – T. xanthopterus. B – Double cones of the puffer T. xanthopterus in normal solution (filled symbols) and Cl-free medium (substitution of NaCl for NaNO₃, open symbols). 1, 3 – LW-members, 2, 4 – MW-members. Black curves – template fitting, grey curve – smoothing of the data by the method of running average. C – Filefish Thamnaconus modestus. 1 – LW-members of double cones; 2 – MW-members of double cones; 3 – single cones. Curves for 1 and 2 data – template fits for A2 and A1/A2, correspondingly. Short dash – superposition of templates for 50% A1 + 50% A2. D. Cones and cornea of the pufferfish Dichotomyctere fluviatilis. Best fit by the A2-templates: 1—LW-members of double cones, 2 – MW-members of double cones, 3 – single cones. 4 – corneal transmittance after maximal light adaptation (refer to the right Y-axis).

У всех исследованных 6 видов тетрадонтов имеются многочисленные тонкие (диаметром менее 2 мкм) палочки, а также одиночные и двойные колбочки. Три морских вида рода Takifugu (рыбы-фугу) имели почти одинаковый состав пигментов, незначительно различаясь лишь составом смесей родопсина (A1) и порфиропсина (A2), судя по результатам аппроксимации стандартными кривыми (табл. 1; рис. 1А). Данные для одиночных колбочек T. rubripes не удалось трактовать однозначно, поэтому мы приняли для λ_макс среднее значение 445 нм между крайними величинами, соответствующими либо родопсину либо порфиропсину (447–442 нм).

Зрительные пигменты спинорога Thamnaconus modestus (Monacanthidae) отличались другой особенностью: все типы фоторецепторов оказались более ”коротковолновыми” по сравнению с найденными у других видов. Наибольшее значение λ_макс зрительных пигментов спинорога зафиксировано для одного из члеников двойных колбочек – всего 523 нм (табл. 1; рис. 1С). Пигменты представлены как родопсином (палочки), порфиропсином (длинноволновый, LW – членик двойных колбочек), так и их смесью в средневолновом (MW) членике двойных колбочек. Как и в случае с T. rubripes, для λ_макс одиночных колбочек было принято среднее значение 409 нм между крайними величинами для пары родопсина и порфиропсина (406–412 нм).

Два пресноводных вида иглобрюхов имели более красно-чувствительные пигменты по сравнению с другими рыбами отряда (табл. 1). Наибольшие значения λ_макс характерны для таиландского иглобрюха Pao (Tetraodon) leiurus, у которого один из компонентов двойных колбочек имеет λ_макс = 630 нм. Судя по результатам аппроксимации спектральных данных, все пигменты у этих рыб являются порфиропсинами (тип А2) (рис. 1D).

У T. xanthopterus при использовании бесхлорной среды сдвиг λ_макс на 17 нм наблюдали только для LW-членика двойных колбочек (550 нм против 567 нм). Спектр поглощения MW-членика в норме хорошо совпадал с показателями поглощения, измеренными в бесхлорной среде по всему длиноволновому плечу спектра (рис. 1B). Так как все использованные в работе рыбы-фугу имели практически одинаковый набор зрительных пигментов, то опыты с другими видами не проводили.

Ионохромный эффект у бурого терпуга отчетливо проявлялся в том, что λ_макс у LW-члеников двойных колбочек смещался в сторону коротких волн на 35 нм (с 582 до 547 нм), а у MW-члеников – на 20 нм (с 543 до 523 нм) (табл. 1, рис. 2А). Такая картина наблюдалась в колбочках летом, когда в сетчатке преобладал порфиропсин [9].

Рис. 2.

Спектры поглощения пигментов в члениках двойных колбочек бурого терпуга Hexagrammos octogrammus. Сплошные и штриховые кривые – результаты аппроксимации стандартными кривыми усредненных данных для LW- и MW-члеников в нормальном растворе. А – Свежевыловленные рыбы из моря, обычные условия содержания. Результаты изменения спектров в бесхлорной среде: 1 – LW-членики, 2 – MW-членики. B – Рыбы через месяц после содержания в темноте в бассейне. Символы на панели (B) соответствуют поглощению, измеренному в бесхлорном растворе в обоих члениках. Fig. 2. Normalized absorbance spectra of visual pigments in LW- and MW-members of doubles cones of greenling, Hexagrammos octogrammus. (A) Fish from the sea. Solid and dashed curves are the results of fitting of mean data for LW- and MW-members, correspondingly. Absorbance in the Cl-free medium: 1 – LW-members, 2 – MW-members. (B) Fish after 1 month of dark adaptation in the water tank. Symbols on panel (B) correspond to equal absorbance in both members of double cones in the Cl-free medium.

Серия экспериментов с продолжительным содержанием рыб в темноте была направлена на выявление вклада в ионохромный эффект отдельных компонентов, входящих в состав смеси зрительных пигментов. После длительной непрерывной темновой адаптации (до одного месяца) соотношение пигментов в сетчатке изменилось в сторону родопсина (10, табл. 1). В результате, в бесхлорном растворе было обнаружено смещение максимума поглощения LW-членика примерно на 45 нм, а MW-членика на 10 нм (рис. 2B).

Спектральные свойства зрительных пигментов и роговиц

Микроспектрофотометрическое исследование показало, что три близкородственных вида рыб-фугу имеют единообразный состав зрительных пигментов c λ_макс = 502–505 нм (палочки), 445 нм (одиночные колбочки) и 524/567 нм (двойные колбочки) (рис. 1А). Значения для палочек и одиночных колбочек вполне соответствуют величинам для большинства прибрежных рыб Японского моря c переменными фильтрами роговицы, изученных нами ранее (503 ± 2, 450 ± 5 нм), но λ_макс двойных колбочек у рыб-фугу отличались в большую сторону по сравнению со средними для других рыб (520 ± 5, 553 ± 8 нм) [28]. Почти все зрительные пигменты рыб-фугу являются исключительно порфиропсинами (особенно в колбочках), либо представлены смесью порфиропсина и родопсина в разной пропорции (табл. 1). Наличие А2 хромофора в сетчатке T. rubripes было подтверждено также с помощью хроматографии [30].

Пигментные фильтры роговицы этих рыб в состоянии максимальной плотности лишь частично ограничивают уровень средневолнового излучения. Во всяком случае, “cинечувствительные” одиночные колбочки у этих рыб могут быть функционально значимыми в диапазоне 440–500 нм даже при полной световой адаптации роговичного фильтра. Здесь мы находим аналогию с некоторыми видами терпугов в случаях, когда при неполной световой адаптации плотность роговицы мала [13].

Зрительные пигменты колбочек спинорога Thamnaconus modestus имеют на 35–45 нм меньшие величины λ_макс по сравнению с пигментами рыб-фугу (табл. 1, рис. 1C). Это согласуется со свойствами пигментов других видов спинорогов и многих рыб с коралловых рифов, где вода более чистая [18]. Судя по результатам аппроксимации, разные членики двойных колбочек спинорога содержат равное количество порфиропсина. Примечателен коротковолновый спектр поглощения одиночных колбочек у этого вида (λ_макс = 409 нм), хотя судить о природе хромофора в них затруднительно. Оптические среды глаза, включая роговицу, у спинорога совершенно бесцветны и, по-видимому, не ограничивают доступ света с длиной волны >400 нм к сетчатке.

Фоторецепторы иглобрюхов содержат чистый порфиропсин (рис. 1D), что типично для многих пресноводных рыб. Обращает на себя внимание большое сходство набора порфиропсинов в колбочках у пресноводного P. leiurus и типичной морской рыбы, бурого терпуга, летом или при длительной адаптации к свету [9]: λ_макс = 530 и 525 нм, 570 и 562 нм, 630 и 625 нм соответственно и отсутствие “обычных” для прибрежных морских рыб синечувствительных колбочек с максимумом поглощения около 450 нм. Такое сходство систематически и экологически очень далеких видов можно объяснить наличием очень плотных желто-оранжевых фильтров роговицы, делающих такие фоторецепторы неэффективными при почти полной “блокаде” сине-зеленой части спектра при дневном освещении [9, 13]. Остается неясным, однако, почему в сетчатке близкородственного вида D. fluviatilis имеются колбочки с λ_макс = 463 нм, попадающими в область минимального пропускания этого плотно окрашенного фильтра (рис. 1D)? Возможно, это можно объяснить особенностями экологии (выбор местообитания, суточная активность при разных световых условиях и др.) когда пигментный фильтр в роговице находится преимущественно в неполном светоадаптированном состоянии.

Типы зрительных пигментов

Результаты, полученные с помощью ионохромного эффекта, как и микроспектрофотометрические данные, не могут служить окончательных указанием на молекулярный тип зрительных пигментов. Для этого необходимы дополнительные молекулярно-генетические и иммунологические исследования. Способ определения λ_макс аппроксимацией стандартными кривыми для пигментов A1 и A2 имеет известные ограничения по точности [27], поэтому более точные сведения о наличии пигментов с разными хромофорами обычно получают с помощью хроматографии [30]. Принятие во внимание только максимума поглощения может привести к ошибкам, так как нередко в одном наружном сегменте содержится смесь нескольких пигментов [31], а спектральные диапазоны для разных молекулярных типов пигментов перекрываются. Например, известны случаи нахождения весьма “коротковолновых” LWS-пигментов (λ_макс = 509–516 нм у некоторых млекопитающих [32]; λ_макс = 512 нм у японского анчоуса [33]).

Тем не менее в отношении изученных нами объектов можно сделать определенные заключения, сопоставив наши данные с немногочисленными результатами молекулярно-генетических исследований опсинов у тетрадонтов.

Поскольку ионохромное смещение характерно лишь для LWS-пигментов и наблюдалось только у одного членика двойных колбочек T. xantopterus, имеющего в норме λ_макс = 567 нм (рис. 1B), то можно полагать, что у фугу имеется всего один пигмент LWS-типа. Так как все виды рыбы-фугу имели практически идентичный набор пигментов, то этот вывод можно отнести и к ним. Это соответствует результатам молекулярно-генетических исследований рыбы-фугу T. rubripes, одного из объектов нашего исследования, у которой показано наличие всего одной копии гена LWS-опсина [22]. Эти же авторы не нашли гена SWS1 ни у рыбы-фугу, ни у иглобрюха Tetraodon nigroviridis, что подтверждается нашими результатами об отсутствии ультрафиолетовых зрительных пигментов. Пигменты MW-членика двойных колбочек c λ_макс = A1_520 и A2_555 нм, построенные на одном и том же опсине, очевидно, соответствуют единственному функциональному гену RH2, установленному для фугу и иглобрюха [22].

У бурого терпуга мы имеем более сложное проявление ионохромного эффекта в связи с тем, что колбочки содержат смесь двух пигментов. В отсутствие данных о типах опсинов терпуга мы изначально предполагали, что в каждом из члеников двойных колбочек терпуга пигменты построены на основе одного опсина, но имеют разные хромофоры. Результаты, опубликованные ранее, этому не противоречат [9, 10, 13]. В литературе имеются сведения о ко-экспресии разных молекулярных типов пигментов в одной колбочке: например, у японского анчоуса [10], гуппи и мыши [32]. Однако мы не рассматриваем такую возможность для терпуга ввиду отсутствия в настоящее время надежных молекулярно-генетических данных.

Сдвиг λ_макс длинноволнового членика двойных колбочек на 35 нм (рис. 2А) можно объяснить только тем, что применение NaNO₃ в бесхлорной среде привело к смещению максимума поглощения каждого из компонентов смеси в коротковолновую сторону (обычно от 18 до 44 нм для разных пигментов [23]). Если бы в этой смеси из двух пигментов был только один LWS-пигмент с λ_макс = 625 нм, то при примерно равной доле содержания компонентов (табл. 1) следовало бы ожидать смещение максимума поглощения смеси до значения более чем 560 нм. Однако мы имеем смещенный спектр с максимумом около 540 нм, что указывает на то, что и второй компонент с λ_макс = 560 нм также проявляет ионохромные свойства и, следовательно, является пигментом LWS-типа.

Этот вывод дополнительно подтверждается результатами эксперимента после длительного содержания рыбы в темноте (около одного месяца) в параллельной серии экспериментов [10]. В этих условиях в LW-члениках содержался преимущественно пигмент A1_560, что привело к сдвигу максимума поглощения смеси пигментов на 45 нм (рис. 2B).

Менее определенно можно судить о молекулярных типах пигментов в MW-членике двойных колбочек бурого терпуга. Ионохромный сдвиг происходит, но он меньше (20 нм) по сравнению с результатом для LW-члеников. Это можно объяснить тем, что, как было отмечено в предыдущем абзаце, для разных пигментов величина сдвига может различаться. После длительной темновой адаптации, при уменьшении содержания A2_562 в MW-членике до 40% (табл. 1) был зафиксирован еще меньший сдвиг – всего 10 нм, что приближается к точности определения максимума поглощения на спектральной кривой.

При этом экспериментальные данные для LW- и MW-членика в бесхлорной среде неразличимы и практически совпадают с длинноволновым плечом спектральной кривой поглощения для MW-членика в нормальном растворе (рис. 2B).

Если предположить, что в бесхлорной среде максимумы поглощения каждого из пигментов-компонентов смеси в MW-членике сдвигаются, как и в LW-членике, примерно на 40 нм, то следовало бы предположить, что ионохромный сдвиг происходит только для пигмента с λ_макс = A2_562 нм. Но это означало бы, что другой компонент смеси принадлежит к другому молекулярному типу. Это возможно, но требует дополнительных весомых доказательств. Таким образом, учитывая довольно противоречивые данные, у нас нет уверенности в том, что какой-либо из зрительных пигментов сетчатки бурого терпуга из MW-членика относится к LWS-типу.

Физиологическая роль фильтров роговицы

Возможная физиологическая роль каротиноидных фильтров роговицы обсуждалась неоднократно, однако до сих пор нет надежных экспериментальных данных, подтверждающих какую-либо из гипотез [16, 34, 35]. Несомненно, что привлечение максимума сведений о свойствах зрительных пигментов и спектральных характеристиках роговицы в сочетании с данными по зрительной экологии многих видов рыб будут способствовать прояснению этой проблемы. Можно предположить, что, как у для терпугов, переменные фильтры роговицы у мелководных дневных представителей тетрадонтов выполняют роль защиты от яркого света [13], в особенности – от влияния ультрафиолета. В то же время у рыб-фугу сдвиг максимумов поглощения пигментов в длинноволновую часть спектра из-за наличия фильтров роговицы, “компенсирующее” потерю общей чувствительности сетчатки, оказалось меньше, чем у терпугов. Оно было выражено только у двойных колбочек, очевидно из-за сравнительно невысокой оптической плотности роговицы.

Присутствие порфиропсина в сетчатке делает более эффективным поглощение длинноволнового излучения, поэтому этот факт считается адаптацией к освоению рыбами пресных и солоноватых водоемов, имещих иной спектр распределения энергии света по сравнению с морем [30]. Таким образом, с одной стороны, наличие порфиропсина в фоторецепторах большинства видов рыб с желто-оранжевыми роговицами [9, 13] можно считать адаптацией к изменению спектрального состава света, попадающего на сетчатку. С другой стороны неясно, какое преимущество могут дать колбочки с порфиропсином при λ_макс = 523 нм у спинорога – типичной морской рыбы (рис. 1C)? Интересно отметить, что у 4х других видов спинорогов из того же семейства, обитающих на коралловых рифах, имеется желтая роговица c переменной окраской [14, 16, 18, 20], однако диапазоны значений спектральной чувствительности их колбочек совпадают с положением λ_макс колбочек спинорога, описанных нами (λ_макс = (398–407) и (476–492)/(510–522) нм против 409 и 486/523 нм). Очевидно, это объясняется близостью систематического положения видов, а также незначительным влиянием фильтров низкой плотности на результирующие эффективные спектры зрительных пигментов. Расчет для спинорога Rhinecanthus aculeatus показал, что роговица лишь слегка модифицирует поглощение, “срезая” в основном бета-полосы спектров зрительных пигментов, и не влияет на способность рыб использовать цветовое зрение в поведенческих опытах [20].

Несмотря на хорошее качество регистрируемых спектров, микроспектрофотометрические данные необходимо в будущем подкрепить с помощью хроматографии и других методов. Если порфиропсины (включая коротковолновые) у морских Tetraodontoidei действительносуществуют, то не есть ли это следствие каких-то более глубоких, родственных (генетических) связей между видами этого отряда, лежащих в основе общих биохимических и физиологических механизмов, адаптивность которых не всегда ясна? Можно надеяться, что эта группа рыб, благодаря уникальным свойствам их генома, будет успешно использоваться в качестве перспективной модели для исследований по эволюции сенсорных систем и физиологии адаптаций [22, 36].