Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 9, стр. 1122-1131

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 30 белых беспородных крысах обоего пола массой 120–180 г, костный мозг которых использовался для культивирования, и 30 белых беспородных крысах массой 200–350 г, из крови которых получали эритроциты. Исследование проведено в соответствии с принципами Базельской декларации и рекомендациями о соблюдении биоэтических норм этического комитета ФГБОУ ВО “Южно-Уральский государственный медицинский университет” Минздрава России. Животные содержались в экспериментально-биологической клинике Южно-Уральского государственного медицинского университета в соответствии с правилами СП 2.2.1.3218 и Директивой 2010/63/EU по охране животных, используемых в научных целях. Все манипуляции с животными производили под эфирным наркозом, эвтаназию грызунов осуществляли путем цервикальной дислокации, также проводимой под эфирным наркозом.

ЭО выделяли из костного мозга бедренных костей здоровых интактных крыс и далее культивировали по методике, разработанной и используемой в нашей лаборатории [9, 10]. Костный мозг получали в результате промывания канала бедренной кости 1.5 мл препаративной среды, аналогичной по составу среде для культивирования, но без 2-меркаптоэтанола и эритропоэтина. В суспензии костного мозга, разведенной в 2 раза препаративной средой, с помощью камеры Горяева подсчитывали количество ЭО. Суспензию разливали в отдельные стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм (Corning-Costar, США) из расчета 3500 ЭО/чашку. Для отделения взвеси костномозговых клеток чашки Петри на 30 мин помещали в мультигазовый инкубатор (МСО-18М, SANYO, Япония) при температуре 37°С, относительной влажности 95% и содержании СО₂ 4.5%. По окончании инкубации с помощью шприца монослой островков отмывали от неадгезировавшихся клеток, используя для этого среду RPMI-1640. Каждую чашку Петри с адгезировавшимися ЭО заполняли 3 мл культуральной среды. 100 мл готовой культуральной среды содержали: среду RPMI-1640 – 62 мл, эмбриональную телячью сыворотку – 30 мл, гепарина – 1.3 мл (6500 ЕД), бензилпенициллина калиевую соль – 1 мл (5000 ЕД), стрептомицина – 1 мл (5 мг), 2-меркаптоэтанола – 1 мл маточного раствора, L-глютамина – 1 мл (14.6 мг), бикарбоната натрия – 2.7 мл 7.5% раствора. Перед добавлением в чашки культуральную среду пропускали через стерильные шприцевые насадки с диаметром пор 0.22 мкм.

Перед началом культивирования в каждую чашку Петри вносили рекомбинантный ЭПО (Рекормон, Рош Диагностикс ГмбХ, Германия) в дозе 500 мЕ/мл, поскольку ранее было установлено, что именно эта доза ЭПО поддерживает эритропоэз в культуре ЭО на физиологическом уровне [11]. Культивирование ЭО производилось в мультигазовом инкубаторе при температуре 37°С, относительной влажности 95% и содержании СО₂ 4.5%.

Для моделирования в системе in vitro двух разных состояний периферического и центрального звеньев эритрона перед началом культивирования в опытные чашки Петри добавляли эритроциты разной степени зрелости.

Модель 1 – гиперрегенерация эритрона. Эритроцитарная взвесь, состоящая преимущественно из ретикулоцитов и молодых эритроцитов, была получена у крыс, которым внутрибрюшинно вводили солянокислый фенилгидразин в дозе 60 мг/кг. Кровь у этих анемизированных животных забирали на 5-е сутки после введения гемолитика, когда количество ретикулоцитов в их крови составляло не менее 65 × 10⁹/л.

Модель 2 – гипорегенерация эритрона. Эритроцитарная взвесь, состоящая преимущественно из зрелых и старых эритроцитов, была получена у крыс с экспериментальной посттрансфузионной полицитемией, для создания которой животным-реципиентам внутрибрюшинно в объеме 7% от массы тела была произведена однократная трансфузия 80%-ной взвеси отмытых эритроцитов крыс-доноров. Кровь у этих полицитемичных крыс-реципиентов забирали на 5-сутки после трансфузии, когда количество ретикулоцитов в их крови не превышало 1 × 10⁹/л.

Кровь забирали из задней полой вены и стабилизировали гепарином, после чего эритроциты трижды отмывали стерильным 9%-ным раствором NaCl. Все манипуляции производились в стерильных условиях. Отмытые эритроциты с помощью микродозатора вносили в культуральные сосуды с адгезированными ЭО из расчета 30, 60 или 120 клеток на 1 ЭО. Указанные дозы были выбраны неслучайно. В физиологических условиях в здоровом организме 1 ЭО за один свой цикл продуцирует примерно 30 эритроцитов, при компенсационном эритропоэзе (после кровопотери) – в 2 раза больше (60 эритроцитов). Доза 120 клеток/1 ЭО моделировала избыточное количество эритроцитов, находящееся в кровотоке при миелопролиферации эритроидного ростка кроветворения, например, при истинной полицитемии.

ЭО культивировали в течение 24, 48 или 72 ч. Контролем служили 24-, 48- и 72-часовые культуры ЭО без добавления эритроцитов. По окончании культивирования клетки фиксировали и окрашивали по Паппенгейму (фиксатор-краситель Май–Грюнвальда и краситель Романовского). Всего в работе было проанализировано 126 культур. Количество ЭО на поверхности чашек Петри подсчитывали по методу Автандилова с помощью морфометрической сетки. Содержание ЭПО в культуральной среде определяли методом двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа с помощью набора реактивов Biomerica EPO ELISA (Германия), включающего биотинилированные и конъюгированные с пероксидазой хрена мышиные моноклональные антитела к определенным участкам человеческого ЭПО. Поскольку в ходе эксперимента по мере созревания ЭО их число в культурах уменьшалось, нами было рассчитано удельное содержание ЭПО, т.е. количество мЕ ЭПО в пересчете на 1 ЭО (удельное содержание = количество ЭПО в 3 мл культуральной среды/число ЭО в культуре).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием программы STATISTICA 6.0. Рассчитывали среднее значение (М), стандартную ошибку (m). Для проверки гипотезы о наличии или отсутствии различий между опытными и контрольными группами использовали непараметрический критерий интегральных различий Колмогорова–Смирнова. Различия считались достоверными при 95%-м уровне значимости (p < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При изучении динамики концентрации ЭПО в контрольных культурах были получены данные, аналогичные представленным ранее результатам [12]. Если перед началом культивирования содержание ЭПО в культуральной среде составляло 500 мЕ/мл, то через 24 ч данный показатель достоверно снизился более чем в 3 раза (табл. 1) за счет интенсивного связывания молекул гормона рецепторами эритроидных клеток островков. Через 48 ч концентрация гормона в культуральной среде возросла на 82% и сохранилась на этом уровне до 72 ч. Поскольку рекомбинантный ЭПО был добавлен в культуральную среду только в начале эксперимента, выявленный рост содержания гормона в ходе развития ЭО, несомненно, был обусловлен продукцией эндогенного ЭПО клетками островков.

При добавлении в культуру ЭО ретикулоцитов/молодых эритроцитов (модель гиперрегенерации эритрона) в дозе 30 или 60 клеток/1 ЭО концентрация эритропоэтина в культуральной среде через 24 ч увеличилась на 37% по сравнению с контрольными культурами (табл. 1). Однако, когда количество внесенных в чашку Петри молодых эритроидных клеток в 4 раза (120 клеток/1 ЭО) превышало число эритроцитов, формируемых одним островком в физиологических условиях, концентрация ЭПО в культуральной среде через 24 ч не изменилась, а через 48 ч снизилась на 25%. К 72 ч достоверно меньше ЭПО регистрировалось не только в культурах, содержащих 120 клеток/1 ЭО, но и в культурах, к которым добавляли 60 клеток/1 ЭО. Таким образом, относительно небольшая ретикулоцитарная нагрузка на культуру (30 или 60 клеток/1 ЭО) к концу первых суток вызывала увеличение продукции ЭПО в островках. В то же время присутствие в культуре избыточного количества молодых эритроцитов/ретикулоцитов, так же как и увеличение длительности сокультивирования, приводили к снижению синтеза ЭПО клетками ЭО.

Присутствие в микроокружении ЭО зрелых эритроцитов (модель гипорегенерации эритрона) сопровождалось явным торможением эритропоэтиновой продуктивности клеток островков (табл. 2). Если через 24 ч синтез ЭПО оставался на исходном уровне, то к 48 ч содержание гормона в культуральной среде достоверно уменьшилось во всех сериях эксперимента: в культурах с малым количеством внесенных зрелых эритроцитов (30 клеток/1 ЭО) – на 18%, а в культурах с большой эритроцитарной нагрузкой – на 28%. В 72-часовых культурах, содержащих 30, 60 или 120 эритроцитов/1 ЭО, количество ЭПО оказалось меньше контрольных значений на 26, 40 и 53% соответственно. Таким образом, в присутствии зрелых эритроидных клеток, выделенных из крови полицитемичных животных, культивируемые ЭО снижали продукцию эндогенного ЭПО тем заметнее, чем больше эритроцитов их окружало.

Поскольку формирование ЭО происходит на основе контактов макрофагов с уже коммитированными клетками, островки фактически представляют собой конечную стадию в развитии центрального звена эритрона. Эритроидные клетки, теряя ядро, дифференцируются до состояния ретикулоцитов и деадгезируются. Если центральный макрофаг в этот момент не присоединяет к себе новую КОЕ-Э или проэритробласты, то этот ЭО прекращает свое существование. В условиях in vitro островки также созревают, и ассоциации клеток распадаются, поэтому число ЭО в культуре неуклонно уменьшается. По этой причине мы сочли целесообразным оценить удельное содержание ЭПО, то есть рассчитать, сколько мЕ ЭПО приходится на 1 ЭО.

При анализе динамики удельного содержания ЭПО стало очевидным, что через 24 ч после внесения в культуру ретикулоцитов/молодых эритроцитов (модель гиперрегенерации эритрона) каждый ЭО начал продуцировать больше ЭПО, чем 1 островок контрольных культур (рис. 1). Через 48 ч продукция ЭПО в культурах, получивших 30 или 60 молодых эритроцитов/1 ЭО, была на уровне контрольных значений, но в культурах с избыточной эритроцитарной нагрузкой синтез ЭПО достоверно снизился. К 72 ч торможение синтеза ЭПО наблюдалось не только в указанной серии чашек Петри, но и в культурах, получивших по 60 эритроцитов/1 ЭО.

Рис. 1.

Удельное содержание эритропоэтина (мЕ/1 ЭО) в модели гиперрегенерации эритрона in vitro (*отмечено наличие достоверных различий между контрольными и опытными показателями, p < 0.05). Fig. 1. The specific content of erythropoietin (mU/1 EI) in an in vitro erythron hyporegeneration model (*the presence of significant differences between the control and experimental results, p < 0.05).

Островки, нагруженные эритроцитами полицитемичных животных (модель гипорегенерации эритрона), независимо от количества добавленных клеток достоверно снизили продукцию ЭПО через 48 ч культивирования (рис. 2). К 72 ч эксперимента наблюдалась отчетливая зависимость между удельным содержанием гормона и количеством добавленных в культуру клеток: чем больше зрелых эритроцитов находилось в культуре, тем меньше ЭПО синтезировал каждый островок.

Рис. 2.

Удельное содержание эритропоэтина (мЕ/1 ЭО) в модели гипорегенерации эритрона in vitro (*отмечено наличие достоверных различий между контрольными и опытными показателями, p < 0.05). Fig. 2. The specific content of erythropoietin (mU/1 EI) in an in vitro erythron hyporegeneration model (* the presence of significant differences between the control and experimental results, p < 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Несмотря на то, что ЭПО могут синтезировать и сами эритроидные клетки [13], несомненно, что в костном мозге основным источником этого гормона являются макрофаги, ЭПО-продуктивность которых была доказана многими авторами [14–16]. Rich с соавт. [14] обнаружил, что в супернатантах первичных культур эмбриональных печеночных макрофагов мыши в первые 7 сут. заметно нарастает продукция ЭПО: общая эритропоэтическая активность клеток каждые сутки увеличивалась на 25 мЕ/мл культуральной среды. Присутствие в макрофагальном микроокружении других клеток, например, апоптотических нейтрофилов, в условиях in vitro стимулировало продукцию ЭПО в 2–11 раз [17].

Способность клеток ЭО секретировать ЭПО имеет большое значение для поддержания костномозгового эритропоэза после кровопотери и при некоторых гематологических заболеваниях. Увеличение функциональной активности центральных макрофагов ЭО (повышение их эритропоэтических и фагоцитарных свойств, усиление способности формировать гемопоэтическое микроокружение) [18] обеспечивает высокий темп пролиферации и дифференцировки эритроидных клеток как в условиях in vivo (в поздние сроки после кровопотери), так и в услових in vitro (при длительном культивировании ЭО). По всей видимости, эти же механизмы поддерживают эритропоэз при эритропоэтиндефицитной анемии и при анемии, сопровождающей многие онкологические процессы, поскольку в указанных случаях наблюдается чрезвычайно низкая продукция почечного ЭПО, неадекватная тяжести анемического синдрома [19].

Наши исследования показали, что продукция ЭПО культурой ЭО зависит от количества и степени зрелости эритроцитов, находящихся в окружении островков, а также от длительности их совместного культивирования. Небольшие дозы (30 или 60 клеток/1 ЭО) молодых эритроцитов/ретикулоцитов стимулируют синтез эндогенного ЭПО, что доказывается увеличением концентрации гормона в культуральной среде, особенно через 24 ч эксперимента. Дальнейшее увеличение числа внесенных в культуру клеток, а также увеличение длительности контакта молодых эритроцитов/ретикулоцитов с ЭО приводит к достоверному снижению продукции ЭПО клетками ЭО. Эритроциты полицитемичных крыс тормозят продукцию ЭПО клетками островков, и этот эффект усиливается пропорционально количеству зрелых эритроцитов в культуре.

Ранее нами была высказана гипотеза о существовании механизмов положительной и отрицательной обратной связи в регуляции эритропоэза. Эта гипотеза основана на выявленной способности молодых эритроцитов/ретикулоцитов ускорять формирование новых ЭО, а зрелых и старых – подавлять процесс присоединения колониеобразующих единиц эритроцитарных (КОЕ-Э) к центральным макрофагам ЭО [7]. До недавнего времени было неясно, с чем связаны такие функциональные различия между клетками, по сути являющимися одними и теми же представителями заключительной стадии развития эритроидного ряда. Однако после открытия механизма экзосомного транспорта стало очевидно, что они по-разному могут участвовать в информационном межклеточном обмене [20]. Экзосомы ретикулоцитов содержат регуляторные не кодирующие белок молекулы – микроРНК, среди которых находится микроРНК-451. Вероятно, именно с этой микроРНК связан стимулирующий эритропоэз эффект, возникающий при добавлении ретикулоцитов в культуру ЭО. Показано, что в процессе дифференцировки CD34+ клеток уровень экспрессии данной микроРНК в развивающихся эритроидных клетках к 7-м суткам культивирования увеличивался в 3 раза, а к 21-м суткам – в 35 раз по сравнению с исходными значениями [21]. Кроме того, доказана связь экспрессии микроРНК-451 с продукцией макрофагальными клетками интерлейкина-6 [22], который стимулирует пролиферацию эритроидных клеток-предшественниц и усиливает адгезивные свойства центральных макрофагов в ЭО.

В экзосомах зрелых эритроцитов были обнаружены микроРНК, имеющие отношение к процессу торможения эритропоэза: микроРНК-221 и микроРНК-222 [23]. В физиологических условиях эти микромолекулы подавляют пролиферацию и дифференцировку эритроидных клеток-предшественниц, одновременно ускоряя созревание эритробластов [24]. Кроме того, экзосомы зрелых эритроцитов индуцируют секрецию фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) в клетках моноцитарного ряда [25], что, несомненно, может иметь место и в костномозговых макрофагах, формирующих вокруг себя эритроидную “корону”. Роль ФНО-α в регуляции эритропоэза доказана достаточно давно: связывание этого цитокина со специфическим рецептором на молодых эритроидных клетках приводит к торможению их выхода из фазы G0 в S-фазу клеточного цикла [26], а увеличение концентрации ФНО-α тормозит эритропоэз в культуре ЭО [27].

Не исключено также, что микроРНК ретикулоцитов и зрелых эритроцитов модулируют функциональные (в том числе и эритропоэтические) свойства макрофагальных и эритроидных клеток ЭО не напрямую, а опосредованно через лимфоциты, входящие в состав островков [20, 28]. В частности, было показано, что РНК лимфоидных клеток здоровых доноров и больных истинной полицитемией стимулирует эритропоэз в культурах ЭО костного мозга интактных крыс и крыс с угнетенным красным ростком кроветворения [29].

Таким образом, в настоящей работе мы установили, что локальная регуляция эритропоэза напрямую связана с синтезом тканевого ЭПО в ЭО и зависит от количества и степени зрелости эритроцитов, продуцируемых красным костным мозгом. Полученные результаты позволяют утверждать, что именно тканевой, локально синтезирующийся в эритроидной ткани ЭПО, является важнейшим звеном в реализации механизмов обратной связи, обеспечивающих адекватный ответ центрального звена эритрона на кислородный запрос в физиологических условиях и поддерживающих эритропоэз при патологических состояниях, сопровождающихся недостаточной продукцией эритропоэтина в почках.