Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2021, T. 107, № 12, стр. 1530-1541

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 30 белых крысах самках (n =15) и самцах (n = 15) линии Вистар в возрасте 2–3 мес. (молодые, n = 10), 1 год (взрослые, n = 10) и 2–2.5 года (старые, n = 10) после рождения с соблюдением “Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных” (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР), в соответствии с принципами Базельской декларации и рекомендациями этического комитета Ярославского государственного медицинского университета Минздрава РФ. Молодые самки находились в фазе диэструса, что определялось по влагалищному мазку с окраской метиленовым синим по Леффлеру.

После введения летальной дозы уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно), животных перфузировали транскардиально раствором стандартного фоcфатно-cолевого буфеpа (PBS; 0.01 М, pH 7.4) (БиолоТ, Россия). С целью проведения иммуногистохимических исследований, животных (n = 20) затем перфузировали 4%-ным pаcтвоpом паpафоpмальдегида (Sigma, США) на PBS. После перфузии головной мозг извлекали и иссекали участок гипоталамуса в области срединного возвышения согласно координатам атласа мозга крыс [16]. Серии коронарных срезов гипоталамуса толщиной 14 мкм изготовляли с помощью криотома Shandon E (Thermo Scientific, Великобритания).

С целью выявления нейронов, содержащих SOM, CB, nNOS, NPY применялось двойное мечение антителами. Срезы прединкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% ослиной сыворотки (“Jackson Immunoresearch”, США), 1% тритона X-100, 0.1% бычьего сывороточного альбумина, 0.05% тимерозола. Затем срезы инкубировали с первичными антителами (козьи против SOM, 1 : 200, Santa Cruz, sc-7819; кроличьи против CB, 1 : 500, Abcam, ab11426; кроличьи против nNOS, 1 : 200, Abcam, ab76067; кроличьи против NPY, 1 : 500, Abcam, ab30914) в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч. Вторичные антитела были конъюгированы с флуорохромами — флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC), дающим зеленую флуоресценцию и индокарбоцианином (Cy3), дающим красную флуоресценцию (разведение 1 : 150, Jackson Immunoresearch, США). После этого срезы снова отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлуоресценции (VectaShield, Vector Laboratories, США). Окраску клеток всей популяции нейронов проводили красителем, флуоресцирующим в зеленой области спектра, NeuroTrace Green Fluorescent Nissl Stains (Molecular Probes, США) – разведение 1 : 200. После этого срезы отмывали в PBS и заключали в среду для флуоресцентной микроскопии VectaShield (Vector Laboratories, США). Для исключения неспецифической реакции, часть срезов инкубировали без первичных и/или вторичных антител.

Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе Olympus BX43 (Токио, Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCD камерой Tucsen FL-20 c программным обеспечением Mosaic V2.1 (Китай). Для выявления меченых нейронов использовали каждый третий из серийных срезов. Число ИР нейронов определяли на изображениях срезов, полученных под объективом 20×/0.50. Площадь изображений составляла 0.14 мм². Долю SOM-ИР нейронов определяли как их отношение к общему количеству нейронов, выявленных NeuroTrace Fluorescent Nissl Stains, или суммарному количеству SOM-ИР и SOM-негативных нейронов, которое принимали за 100%. Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро с видимым ядрышком и с флуоресценцией, превышающей фоновое свечение. Процент ИР нейронов определяли с помощью программы Image J (NIH, США).

Математическая обработка данных и построение графиков выполнено с использованием программы Sigma Plot (Systat Software, США). Все величины представлены как средняя арифметическая ± ошибка среднего (М ± m). Достоверность различий средних величин определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с коррекцией Бонферрони. Достоверными считали различия при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В туберальной области SOM-иммунореактивные (ИР) нейроны выявлялись в AN, VMN, DMN, медиального туберального (MTu), перивентрикулярного (PeV) и перифорникального (PeF) ядер. В VMN SOM-ИР нейроны определялись в оболочке ядра (shell), вентролатеральной части ядра (VMNvl) и в дорсомедиальной части (VMNdm) (рис. 1).

Рис. 1.

Обзорная микрофотография SOM-ИР нейронов в ядрах туберальной области гипоталамуса крысы. AN – дугообразное ядро, VMNvl – вентролатеральная части вентромедиального ядра, VMNdm – дорсомедиальная часть вентромедиального ядра, VMN shell – оболочка вентромедиального ядра, DMN – дорсомедиальное ядро, MTu – медиальное туберальное ядро, PeV – перивентрикулярное ядро, PeF – перифорникальное ядро. Флуоресценция Сy3. Масштаб – 300 мкм.

У крыс всех возрастных групп наибольшее количество SOM-ИР нейронов выявлялось в области AN и VMNvl. Меньший процент наблюдался в DMN, MTu, VMN shell. Единичные нейроны обнаруживались в VMNdm, перивентрикулярного (PeV) и перифорникального (PeF) ядер (табл. 1).

В AN молодых крыс только в единичных SOM-ИР нейронах выявлялся CB, nNOS и NPY. Процент SOM/CB-ИР нейронов достоверно возрастал от молодого возраста к взрослому (p < 0.001), а также от взрослых к старым (p < 0.05), процент SOM/NPY-ИР достоверно был меньше у молодых крыс в сравнении с взрослыми и старыми животными обоего пола (p < 0.001, рис. 2, табл. 2–4). SOM/nNOS-ИР нейроны не выявлялись у молодых животных, но присутствовали у взрослых и старых крыс без достоверных различий между ними (p > 0.05).

Рис. 2.

Микрофотографии SOM-ИР нейронов, содержащих CB (a, b), nNOS (c, d), а также NPY (e, f) в AN молодых (a, c, e) и старых (b, d, f) крыс. Колокализация двух маркеров указана стрелкой. Флуоресценция Сy3 (красный, CB, nNOS, NPY), FITC (зеленый, SOM). Масштаб – 50 мкм.

Рис. 2.

Окончание

В VMN SOM-ИР нейроны VMN shell и VMNdm не содержали CB и nNOS, но часть из них была ИР к NPY. В VMNvl от трети до половины SOM-ИР нейронов экспрессировали nNOS, а ИР к CB и NPY была обнаружена у небольшого процента нейронов (от 7.9 до 18.6%) независимо от возраста и пола (рис. 3, табл. 2–4).

Рис. 3.

Микрофотографии SOM-ИР нейронов, содержащих CB (a, b), nNOS (c, d), а также NPY (e, f) в VMNvl молодых (a, c, e) и старых (b, d, f) крыс. Колокализация двух маркеров указана стрелкой. Флуоресценция Сy3 (красный, CB, nNOS, NPY), FITC (зеленый, SOM). Масштаб – 50 мкм.

В DMN до трети SOM-ИР нейронов экспрессировало CB, nNOS и NPY. При этом в DMN самцов наблюдался достоверно больший процент SOM-ИР нейронов, колокализующих NPY в сравнении с самками во всех возрастных группах (p < 0.001) (табл. 2–4).

В MTu процент SOM/CB-ИР нейронов варьировал от 15 до 20%, SOM/NPY-ИР нейронов – от 9 до 11%, и лишь небольшой процент SOM-ИР нейронов этой области содержал nNOS (рис. 4, табл. 2–4).

Рис. 4.

Микрофотографии SOM-ИР нейронов, содержащих CB (a, b), nNOS (c, d), а также NPY (e, f) в MTu молодых (a, c, e) и старых (b, d, f) крыс. Колокализация двух маркеров указана стрелкой. Флуоресценция Сy3 (красный, CB, nNOS, NPY), FITC (зеленый, SOM). Масштаб – 50 мкм.

Отдельные SOM-ИР нейроны выявлялись в PeV и PeF. В PeV треть SOM-ИР нейронов была также CB-ИР, 13–20% – nNOS-ИР, но NPY-негативной. В PeF от 20 до 42% нейронов были SOM/CB-ИР и не экспрессировали nNOS-ИР и NPY (табл. 2–4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты нашего исследования свидетельствуют, что SOM-ИР нейроны у крыс в туберальной области расположены в AN, DMN, VMN, MTu, PeV и PeF ядрах. Ранее наличие SOM было отмечено в AN, VMN, DMN, PeV ядрах взрослых крыс [1, 2, 5], туберальном ядре у взрослых мышей [17]. Мы впервые показали наличие SOM-ИР нейронов у крыс в MTu, PeF и оболочке VMN. В VMN SOM-ИР нейроны локализовались главным образом в области VMNvl. Количество SOM-ИР нейронов было небольшим по сравнению с общим числом клеток в этих ядрах. Наибольшее число SOM-ИР нейронов выявлялось в AN и VMNvl.

Нами впервые было установлено, что при старении локализация SOM-ИР нейронов в ядрах туберальной области гипоталамуса, а также их число не изменяется у самцов и у самок. Согласно данным литературы, уровень соматолиберина в срединном возвышении снижался у старых крыс, тогда как уровень соматостатина в срединном возвышении и уровни соматолиберина и соматостатина в телах клеток не изменялись. Было установлено, что соматостатин-индуцированное ингибирование соматотропина было сенсибилизировано у старых крыс, что указывает на возможную причину возрастного уменьшения уровня соматотропина в плазме [12].

Тем не менее, при старении в AN увеличивался процент SOM-ИР нейронов, колокализующих CB, nNOS и NPY. AN характеризуется отсутствием гематоэнцефалического барьера и является важным ядром-сенсором биохимических параметров крови [18]. В этом ядре перестройки нервных синапсов часто происходят во время различных изменений метаболических состояний, что с возрастом может приводить к накоплению “клеточного мусора” в межклеточном пространстве ядра и развитию нейровоспаления с возрастом [11]. При этом данные литературы также свидетельствуют в пользу того, что NO и NPY оказывают провоспалительный эффект в нервной системе [19, 20].

Согласно данным литературы, у мыши небольшая часть SOM-ИР нейронов колокализовала родственный белку Агути пептид (Aguti-related peptide, AgRP), но не проопиомеланокортин (POMC) [21]. AgRP/NPY являются орексигенными пептидами в отличие от POMC, метаболиты которого обладают анорексигенным эффектом [22]. SOM оказывает ингибирующее влияние на POMC-содержащие нейроны, которые экспрессируют рецепторы к SOM [1]. Можно предположить, что увеличение процента колокализации SOM с орексигенными пептидами (в частности с NPY) в AN нейронах способствует нарушению баланса между потреблением пищи и энергозатратами в сторону увеличения поглощения пищи и уменьшения расхода энергии, что приводит к развитию ожирения и метаболического синдрома в старости.

В наших предыдущих исследованиях мы обнаружили увеличение экспрессии nNOS при старении в DMN, VMN и AN [13]. Вероятно, с этим связано и отмеченное в настоящей работе увеличение процента нейронов, колокализующих SOM и nNOS в AN. Результаты наших предыдущих работ свидетельствуют о том, что доля CB-ИР нейронов в AN с возрастом не изменяется [14]. Можно предположить, что с возрастом в AN происходят разнонаправленные изменения экспрессии CB, при котором его экспрессия увеличивается в одних группах нейронов и уменьшается в других.

Данные литературы показывают, что SOM-ИР нейроны тесно связаны синаптическими контактами с нейронами, экспрессирующими кисспептин, в частности в преоптической области и AN. Тем не менее, лишь единичные нейроны содержат SOM и кисспептин [8].

VMNvl в основном отвечает за агрессию у самцов и самок, а также половое поведение у самок крыс и характеризуется присутствием нейронов, которые экспрессируют рецепторы эстрогена, в то время как дорсомедиальная часть VMNdm больше связана с регуляцией аппетита [23]. Мы обнаружили, что VMNvl от трети до половины SOM-ИР нейронов у всех крыс колокализовали nNOS, а ИР к CB и NPY – от 7.9 до 18.6%. Отсутствие половых различий связано с тем, что SOM-ИР нейроны VMNvl, вероятно, в большей степени связаны с регуляцией агрессивного, чем полового поведения.

Согласно данным литературы, SOM и nNOS колокализованы в 55% нейронов PeV и VMN [5]. По результатам нашей работы в PeV колокализация SOM и nNOS составляла лишь 15–20% и не изменялась при старении. Предположительно, SOM /nNOS-ИР нейроны PeV координируют выделение кисспептина, что играет важную роль в регуляции секреции половых гормонов. SOM-ИР /nNOS-негативные нейроны PeV могут участвовать в регулировании потребления пищи и расхода энергии [8].

Половые различия со стороны SOM-ИР нейронов нами отмечены в DMN. В DMN самцов наблюдался достоверно больший процент SOM-ИР нейронов, колокализующих NPY в сравнении с самками во всех возрастных группах. Данные литературы также подтверждают наличие половых различий со стороны NPY-ергической системы в DMN. Применение диеты с большим содержанием жира или систематическое введение лептина снижала экспрессию рецепторов Y1 к NPY у самцов, но не у самок мышей [24]. Клинические наблюдения демонстрируют увеличение активности симпатической нервной системы при ожирении в большей степени у мужчин, чем у женщин [25], что также может быть связано с NPY-содержащими нейронами DMN, проецирующимися к паравентрикулярному ядру и участвующими в регуляции пищевого поведения и косвенно – в модулировании активности симпатической нервной системы [26].

Таким образом, SOM-ИР нейроны туберальной области представляют собой гетерогенную популяцию нейронов. Небольшая часть SOM-ИР нейронов AN, вероятно, экспрессирующая AGRP, участвует в регуляции метаболизма. При этом функция основной популяции SOM-ИР клеток этого ядра в молодом возрасте, вероятно, связана с управлением выделения гормона роста и половых гормонов. С регуляцией полового поведения связаны и SOM-ИР нейроны VMNvl, содержащие nNOS. При старении происходят нарушение метаболизма и угасание половой функции, что может находить отражение в изменении нейрохимического состава AN.