Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 12, стр. 1725-1732

ВВЕДЕНИЕ

Клеточные культуры в последние годы используются для множества различных научных и медицинских исследований. Культивирование стволовых клеток открывает широкие возможности для регенерации поврежденных тканей, восстановлению утраченных органов [1]. В научно-исследовательских целях культивирование клеток позволяет исследовать процессы онтогенеза и взаимодействие между клетками различных тканей [2, 3]. Культивирование различных линий раковых клеток позволяет увеличить эффективность поиска методов и подходов для борьбы с заболеванием раком, вести персонализированное лечение больных, проводить исследования новых лекарственных препаратов [4]. Также клеточные культуры позволяют исследовать взаимодействие наночастиц с клетками [5]. Клетки в культуре легко доступны для различных манипуляций и прижизненного наблюдения с помощью микроскопа. Для выращивания культур клеток используют биологические инкубаторы. Инкубаторы применяются в научных и медицинских лабораториях для культивирования бактерий и клеток различных тканей при контроле содержания углекислого газа, определенном значении температуры и при заданном уровне влажности в инкубаторе. Инкубаторы для бактериальных культур более простые и дешевые приборы и представляют собой простые термостатируемые шкафы. Существует множество конструкций подобных термостатов, и во многих лабораториях имеется подобное оборудование, которое широко применяется в лабораторной работе. Эти инкубаторы отлично подходят для выращивания и различных манипуляций с бактериями. Однако для работы с клетками млекопитающих (например, опухолевыми клетками человека, клетками мыши или крысы и т.д.), требуются инкубаторы, которые контролируют как температуру, так и содержание CO₂ в окружающем воздухе. Поддержание концентрации CO₂ на уровне 5% необходимо для поддержания pH обычных сред для культивирования клеток млекопитающих (например, ДМЕМ) [6]. Цена таких инкубаторов значительна. Задача данного исследования состояла в разработке простой системы контроля подачи CO₂, которая позволила бы превратить обычный термостат в инкубатор с автоматическим контролем уровня этого газа. Есть несколько публикаций, описывающих сравнительно простые СО₂-инкубаторы, но они описывают изготовление новых специализированных устройств [7–9]. Здесь мы предлагаем доработать уже имеющееся в лаборатории оборудование, что намного проще, дешевле и не займет много времени. Поскольку CO₂-инкубаторы являются важным научным оборудованием, представленная в статье информация о нашей разработке будет полезна широкому кругу исследователей.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработанная система контроля концентрации CO₂ реализована на базе промышленного CO₂-инкубатора ULAB модели UT-8050. В исходной комплектации в данной модели отсутствует датчик концентрации CO₂, а система подачи газа регулируется по определенному алгоритму, исходя из временных промежутков, на которые открывалась дверь инкубатора, без контроля содержания концентрации CO₂ в газовой смеси во внутренней камере инкубатора. Несмотря на установленный уплотнитель на двери инкубатора, в течение суток происходила утечка СО₂, которую не удавалось скомпенсировать. Это сказывалось на качестве роста клеточных культур. Было решено полностью заменить штатную систему подачи газа. Штатная система термостабилизации была оставлена без изменений, так как она неплохо справлялась со своей задачей.

Основные компоненты системы контроля подачи представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Общая схема инкубатора с регулятором концентрации CO₂. Аппаратно-программная платформа (Arduino Uno), камера инкубатора (Incubator), жидкокристаллический дисплей (LCD), сенсор CO₂ (CO₂ sensor), адаптер сенсора CO₂ (I2C/UART adapter), электромагнитный клапан (solenoid valve), баллон CO₂ c редуктором.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Известно, что оптимальные показатели pH среды для выращивания культивируемых клеток составляют 7.2–7.4 [11]. Повышение или понижение уровня кислотности крайне нежелательно. Для нейтрализации избытка ионов водорода и поддержания оптимального уровня кислотности среды культивирования принято использовать буферную систему на основе бикарбоната натрия. Для поддержания правильного баланса в данной системе необходим СО₂ в концентрации 5–10%.

Бикарбонатная буферная система обеспечивает постоянный уровень рН равновесным соотношением между бикарбонатом натрия (NaHCO₃) в культуральной среде и CO₂ в инкубаторе, при этом она является недорогой и нетоксичной для клеток. В результате повышения концентрации CO₂ в газовой фазе увеличивается количество CO₂, растворенного в питательной среде, что ведет к росту концентрации H₂CO₃ и понижению рН. Напротив, если концентрация CO₂ газовой фазы снижена, то рН повышается за счет обратной реакции [12, 13]

Для отслеживания изменений рН в процессе культивирования используют феноловый красный – кислотно-основный индикатор, добавляемый в питательные среды. При низком уровне рН феноловый красный приобретает желтую окраску, тогда как при высоких уровнях рН он имеет пурпурный цвет, ярко-красный цвет среды соответствует рН 7.4, оптимальному для культивирования клеток животных [11].

При работе с культивируемыми клетками снижение уровня СО₂ в инкубаторе связано не только с его расходованием в ходе вышеупомянутой реакции при активации клеточного метаболизма, но и с его выходом из камеры при открывании дверцы инкубатора. По нашим данным, открытие дверцы на 30 с приводит к снижению содержания CO₂ с исходных 5% до 1.2 ± 0.1%. При установленных настройках регулятора СО₂ восстановление базового уровня CO₂ происходит в среднем за 25 мин (рис. 2a). При дальнейшей работе без открывания дверцы инкубатора базовый уровень поддерживается длительное время (рис. 2b). Процесс восстановления концентрации CO₂ после открытия дверцы можно ускорить программным методом, увеличивая время открывания клапана. В нашем случае 25 мин являлось достаточным временем для установления стационарных условий и точности концентрации CO₂.

Рис. 2.

Динамика содержания СО₂ в инкубаторе. (a) – после снижения содержания СО₂ при открывании дверцы инкубатора. (b) – в течение трех суток без открывания дверцы инкубатора.

Для проверки работоспособности регулятора СО₂ нами был проведен ряд контрольных экспериментов.

Инкубирование питательных сред в термостате в течение 12 ч при отключенном регуляторе СО₂ не вызывало изменения цвета индикатора (рис. 3a), тогда как при подключенном регуляторе СО₂ наблюдали изменение окрашивания раствора с пурпурного до бледно-розового (рис. 3b). Анализ рН показал, что пурпурный цвет соответствовал значению 8.7, тогда как бледно-розовый – 7.0.

Рис. 3.

Изменение цвета питательной среды, содержащей индикатор уровня рН, через 12 ч инкубации в термостате с выключенным (a) и включенным (b) регулятором CO₂.

Далее эксперимент был повторен с первичной культурой мотонейронов. Инкубирование клеток в термостате в течение 12 ч при подключенном регуляторе СО₂ способствовало сохранению плотности и уровня жизнеспособности культуры (рис. 4a), тогда как отключение регулятора СО₂ приводило к гибели клеток и отрыванию их от субстрата (рис. 4b).

Рис. 4.

Первичная культура мотонейронов крысы через 12 ч инкубации в термостате с включенным (a) и выключенным (b) регулятором CO₂. Размер шкалы – 20 мкМ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе мы предложили простую систему для автоматизации контроля концентрации СО₂, которую можно использовать для изготовления простого и недорогого СО₂-инкубатора для выращивания клеточных культур. Регулятор концентрации СО₂ реализован на доступной платформе Arduino, легко настраивается и может использоваться в лабораторной практике в учебных заведениях и исследовательских лабораториях. В отличие от уже описанных устройств, наш инкубатор отличается более простой и гибкой конструкцией за счет того, что мы предлагаем усовершенствование уже имеющегося в лаборатории оборудования [7–9]. Стоит отметить, что для стабильной работы инкубатора клеток необходимо обеспечить равномерный нагрев и распределение газа по всему объему камеры. Это обеспечивается наличием вентилятора, им обычно оборудуются стандартные термостаты. При этом необходимо следить за герметичностью камеры инкубатора. Обычно термостаты имеют стеклянную дверь с уплотнителем. Наличие утечек газовой смеси будет компенсироваться автоматически, но повлияет на расход CO₂. Если необходимо поддерживать определенную влажность в камере инкубатора, можно использовать естественное испарение. Для этого расположить на нижней полке камеры открытую емкость с водой и, изменяя площадь испарения, регулировать влажность. Мы протестировали собранный СО₂-инкубатор и продемонстрировали эффективность его работы на примере выращивания первичной культуры мотонейронов. При помощи разработанного регулятора возможно поддерживать необходимую концентрацию СО₂ в инкубаторе в автоматическом режиме в течение длительного времени. Система позволяет регулировать подачу газа за счет перепрограммирования контроллера и адаптировать ее для различных экспериментальных задач. Например, процесс восстановления концентрации CO₂ после открытия дверцы можно ускорить программным методом, увеличивая время открывания клапана. Было показано, что в инкубаторе с 5% СО₂ первичная культура мотонейронов нормально развивается, в то время как та же культура не продемонстрировала рост в обычном инкубаторе без регулятора содержания СО₂. Таким образом, предлагаемый нами подход позволяет изготовить недорогой СО₂-инкубатор для выращивания клеточных культур и существенно сэкономить бюджет исследований.