Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 2, стр. 170-182

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Исследование проведено на мышах линии BALB/c (возраст 52–62 дня, масса тела 17.0–23.0 г), родительское поколение которых было получено из филиала “Столбовая” ФГБУН “НЦБМТ ФМБА”. Мышей содержали в стандартных условиях вивария ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова” при регулируемом световом режиме 12 ч/12 ч (свет/темнота) и постоянной температуре (21–23°С) со свободным доступом к воде и гранулированному корму (ГОСТ Р 50258-92) в полипропиленовых клетках с решеткой из цинкохромовой стали, с обеспыленной подстилкой из деревянной стружки в соответствии с приказом МЗ РФ № 199н от 01.04.2016 г. “Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики” и санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)”, утвержденными 29.08.2014 г. № 51. Проведение экспериментов было одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова” (протокол № 1 от 31.01. 2020 г.).

Моделирование РАС и его коррекция. Животных для исследования получали от половозрелых виргинных самок мышей BALB/с, которых оплодотворяли на стадии проэструса или эструса, определяемой по цитологической картине влагалищного мазка. Самок мышей рассаживали по 2–3 особи в отдельные клетки в первой половине дня, а с 17 часов вечера до 9 утра следующего дня, который впоследствии принимали за “0” (E0) день развития плода, подсаживали к ним одного самца того же возраста и линии. Оплодотворенных самок содержали по 4–5 особей в одной клетке до появления видимых признаков беременности, после чего размещали в индивидуальные клетки. Для получения экспериментального РАС использовали модель фетального вальпроатного синдрома: самкам мышей BALB/с на 12.5-й день беременности (Е12.5) подкожно вводили вальпроат натрия (ВН) (Sigma-Aldrich Company) в дозе 400 мг/кг в объеме 0.1 мл на 10 г массы тела [9, 10]. Самкам, из потомства которых формировали группы “пассивного” контроля, в эти же сроки (Е12.5) подкожно вводили 0.9%-ный раствор хлорида натрия в эквивалентном объеме (0.1 мл на 10 г массы). День появления мышат принимали за “0” сутки постнатального развития (P0). Полученное потомство было разделено на 6 групп: две группы “Контроль” – самцы и самки, рожденные от мышей, которым в период беременности вводили 0.9%-ный раствор хлорида натрия; две группы “ВН” – самцы и самки с ФВС, рожденные от мышей, которым в период беременности вводили ВН; и две опытные группы “ВН + Аф” – самцы и самки с ФВС, которым начиная с P7 по Р62 ежедневно перорально (внутрь) вводили афобазол в дозе 10 мг/кг. Животные групп “Контроль” и “ВН” с P7 по Р62 перорально (внутрь) получали дистиллированную воду в эквивалентом объеме (0.1 мл на 10 г массы). Введение препаратов в тестовые дни осуществлялось в основном после проведения экспериментов за исключением дня теста “построение гнезда”, где животные получали препарат до посадки в индивидуальные клетки.

Изучение поведенческих изменений, играющих важную роль в спектре видового поведения животных, проводили у молодых взрослых мышей линии BALB/с с ФВС в возрасте 52–62 дня [11].

Тесты “социальное взаимодействие” и “социальное узнавание”. Дефицит социального взаимодействия, связанный с РАС, оценивали с помощью тестов на общительность, позволяющих оценить наличие социального предпочтения, а также дискриминации социальной новизны – “социальное взаимодействие” и “социальное узнавание” [12–16]. В этих тестах позитивные поведенческие реакции, измеряемые как увеличенное отношение подходов (длительности исследования) к препятствующей тактильному контакту емкости, содержащей социальный объект (незнакомую мышь-стимул), к пустой емкости, были опосредованы только обонятельными сигналами.

Тесты “социальное взаимодействие” и “социальное узнавание” последовательно проводили в специальной установке, представляющей собой камеру с прозрачными стенками длиной 60, шириной 25 и высотой 30 см, поделенной прозрачными перегородками с дверцами на три равных отсека. Тестируемое животное помещали в центральный отсек установки и в течение 10 мин позволяли свободно перемещаться по ней, затем животное блокировали в центральном отсеке, в один из крайних помещали животное, прикрытое цилиндром со стенками из металлической сетки (11 см в высоту и 9 см в диаметре), а в другой – новый несоциальный объект (аналогичный пустой цилиндр). В течение следующих 10 мин оценивали продолжительность пребывания тестируемого животного в отсеках, длительность обследования объектов, число заходов в отсеки и контактов с объектами. По окончании этапа тестируемое животное блокировали в центральном отсеке, несоциальный объект заменяли на 2-ю новую незнакомую мышь того же пола, линии и массы тела. В течение 10 следующих мин оценивали описанные ранее показатели.

Тест “построение гнезда”. Строительство гнезда – врожденное поведение грызунов, направленное на обеспечение терморегуляции, укрытия и содержание детенышей [17]. Мыши, как самцы, так и самки, строят гнезда одинакового размера. Для построения надлежащего гнезда, мышам необходимо выполнить комплекс актов, зависящий от функциональной целостности их сенсорных и моторных систем. Процесс гнездования нарушается поражениями головного мозга, в том числе гиппокампа и медиальной префронтальной коры, заболеваниями ЦНС, а также фармацевтическим вмешательством, например, введением селективных ингибиторов обратного захвата серотонина [18].

Тест “построение гнезда” [19] проводили в клетке формата Т/2А, наполненной кукурузными опилками высотой 5 см. За 3 ч до начала эксперимента животных рассаживали индивидуально по клеткам, по истечении этого срока в клетку помещали спрессованный ватный диск диаметром 5 см. Через 24 ч животных аккуратно вынимали из клеток. Результаты оценивали по пятибалльной шкале, в которой 1 балл – ватный диск почти не тронут (более 90% не тронуто), 2 балла – ватный диск умеренно измельчен (не тронуто 50–90% диска), 3 балла – ватный диск в основном измельчен, но разбросан по клетке, не сформирован в гнездо (не тронуто менее 50%, вата занимает более четверти площади пола клетки), 4 балла – идентифицируемое, но плоское гнездо (более 90% диска измельчено, материал собирается в гнездо в пределах четверти площади пола клетки, но гнездо плоское, со стенами ниже половины высоты тела мыши), 5 баллов – идеальное гнездо (более 90% диска измельчено, гнездо представляет собой кратер, стены которого превышают половину высоты тела мыши).

Тест “исследование аверсивного запаха” проводили в установке “Y-лабиринт”, (ООО НПК Открытая наука, Россия), выполненной из жесткого поливинилхлорида серого цвета и представляющей собой три одинаковых рукава, сходящихся в центре под углом 120°, длиной 32.5 см, шириной 8.5 см и высотой боковых стенок 15 см. В качестве источника страха, основанного на инстинктивном поведении, у мышей используют запах хищников, таких как лиса или кошка, типичным видовым поведением у грызунов при предъявлении данных запахов являются снижение двигательной активности, избегание источника запаха, фризинговые реакции [20, 21]. Мыши были предварительно адаптированы к условиям лабиринта за сутки до опыта. В день тестирования в дистальный конец одного из 3-х рукавов лабиринта помещали чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу размерами 1 × 1 см, на которую наносили 0.1 мл 1%-ного раствора натуральной мочи лисы (Minnesota Brand Red Fox Urine) [20]. Перед каждым тестированием фильтровальную бумагу сменяли, чашку Петри обрабатывали раствором этилового спирта и перемещали в следующий по часовой стрелке рукав. Мышь помещали в центр лабиринта и в течение 5 мин регистрировали количество заходов и время, проведенное в рукавах лабиринта, а также латентный период первого контактного подхода (на расстоянии менее 1 см) к источнику запаха, количество контактных подходов к источнику запаха и продолжительность нахождения около него.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью пакета программ GraphPad Prism v.8.4.3. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Различия между группами оценивали непараметрическими тестами Краскела–Уоллиса, и при наличии достоверных отличий в первом тесте использовали тест Манна–Уитни с применением поправки Бонферрони. Данные представлены как медиана и квартили 25 и 75% (Me(Q1; Q3)). Различия между группами считались статистически значимыми при p < 0.05 в случае теста Краскела–Уоллиса и теста Манна–Уитни при внутригрупповом сравнении, при p < 0.017 – в случае теста Манна–Уитни для парного сравнения трех групп.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Тест “социальное взаимодействие”. Оценка поведения самцов мышей BALB/c всех групп в тесте “Социальное взаимодействие” на Р52–55 не выявила различий по числу заходов животных в отсеки, содержащие разные по социальной значимости объекты, что свидетельствует о равной двигательной активности животных (табл. 1). Вместе с тем, самцы мышей группы “ВН” 36% времени наблюдения проводили в центральном отсеке, что, возможно, свидетельствует о наличии тревожного компонента, в то время как продолжительность нахождения в центре установки самцов мышей групп “Контроль” и “ВН + Аф” была значимо меньше и равнялась примерно 19% от всего времени наблюдения. Самцы мышей группы “ВН” достоверно меньше контактировали с несоциальным объектом, а продолжительность контактов как с социальным, так и с несоциальным объектом, была значимо ниже в сравнении с контрольными животными (табл. 1). У самцов групп “Контроль” и “ВН + Аф” продолжительность нахождения в отсеках с разными по социальной значимости объектами и контактов с ними как при межгрупповых, так и при внутригрупповых сравнениях, была сопоставима (табл. 1), что свидетельствует о сниженной способности данной линии мышей в распознавании социальных стимулов и о возможном предотвращении афобазолом усугубления социального дефицита, характерного для РАС.

Самки мышей BALB/c группы “ВН” в тесте “Социальное взаимодействие” демонстрировали повышение двигательной активности, достигавшей значимого различия по сравнению с группой “ВН + Аф”. При этом различий по числу посещений разных по социальной значимости отсеков у самок всех тестируемых групп, так же как и у самцов, не обнаружено (табл. 1).

Самки мышей группы “ВН”, так же, как и самцы, проводили в центральном отсеке больше времени (28% от всего времени наблюдения), чем животные групп “Контроль” и “ВН + Аф”, при этом длительность их нахождения в отсеке с социальным объектом, продолжительность и число контактов с ним было значимо меньше, чем у животных группы “Контроль”. Самки мышей группы “ВН” не оказывали предпочтения социальному объекту, что проявилось в значимом снижении длительности контактов с ним, а также продолжительности нахождения в отсеке с социальным объектом по сравнению с соответствующими данными, регистрируемыми относительно несоциального объекта (табл. 1). Полученные данные свидетельствует о выраженном дефиците социального взаимодействия у самок BALB/c с экспериментальным РАС.

Афобазол, при его хроническом введении, улучшил показатели социального взаимодействия у самок BALB/c с ФВС, что выразилось в увеличении на 34% (p < 0.05) длительности контакта с социальным объектом по сравнению с несоциальным (внутригрупповое сравнение), а также в увеличении на 65% длительности нахождения в отсеке с социальным объектом и на 55% – контакта с ним, по сравнению с группой “ВН” (табл. 1).

Таким образом, у самцов BALB/c с ФВС наблюдалось индифферентное поведение по отношению к новым объектам независимо от их социальной принадлежности, а также повышение тревожности, тогда как поведение самцов с ФВС, получавших афобазол, было тождественно поведению мышей группы “Контроль”. Социальное поведение самок BALB/c с ФВС отличалось от поведения самцов той же группы, более выраженным дефицитом социального взаимодействия. Афобазол уменьшал отмеченное нарушение, вызывая у самок BALB/c с ФВС стойкое предпочтение социального объекта. Таким образом, самки BALB/c с ФВС избегали социальных контактов, а введение афобазола приводило к улучшению социального взаимодействия до уровня контрольных животных.

В тесте “социальное узнавание” самцы BALB/c с ФВС продолжали оказывать предпочтение центральному отсеку по сравнению с другими группами мышей. При этом хотя у самцов мышей группы “ВН” количество контактов с незнакомой мышью и продолжительность нахождения в отсеке с ней была значимо больше соответствующих показателей для знакомой мыши, продолжительность контактов с обоими объектами была на 41 и 39% меньше, чем у животных групп “Контроль” и “ВН + Аф” соответственно (табл. 2). Продолжительность контактов самцов контрольной группы и группы, получавшей афобазол на фоне ФВС, с незнакомой мышью относительно знакомой была на 58 и 55% значимо выше соответственно, тогда как в группе “ВН” она равнялась 33%.

Самки BALB/c группы “Контроль” не оказывали предпочтения какому-либо из объектов, так же как и самки с ФВС, получавшие афобазол. Однако самки группы “ВН” проводили в отсеке с незнакомой мышью значимо больше времени, чаще и дольше контактировали с ней, чем со знакомой мышью (табл. 2). Возможно, полученные результаты являются гендерной особенностью самок линии BALB/c с ФВС, что требует дальнейшего изучения.

Известно, что грызуны, подвергшиеся пренатальному воздействию ВН, менее склонны к новизне, при этом предпочтение знакомого объекта не зависит от социального контекста, что согласуется с поведением, наблюдаемым у детей с РАС, которые часто чувствуют себя более комфортно со знакомыми предметами, а также с людьми [22].

Полученные данные свидетельствуют о снижении предпочтения к исследованию новизны у самцов мышей BALB/c с ФВС в тесте “социальное узнавание”, что выразилось в отсутствии различий в продолжительности контактов со знакомым и новым социальными объектами. Введение афобазола улучшало реакцию мышей BALB/c с ФВС на новизну до контрольных значений.

Одной из особенностей РАС является нарушение в системе обонятельного анализатора, которое рассматривается как отражение патологии нервных узлов, связанных с обонянием: обонятельной луковицы и вентральной височной обонятельной коры [23]. Кроме того, у детей с РАС обнаружена сниженная реакция на запахи при нормальном определении их наличия [24].

Видоспецифичным для грызунов, ведущих преимущественно ночной образ жизни, является превалирование использования обоняния наряду с тактильными и слуховыми ощущениями для определения социального и несоциального поведения и успешного выживания вида [25]. Сигнальные процессы передачи различной индивидуальной информации посредством запахов у грызунов опосредуются одним из гормонов, отвечающих за социальное поведение, окситоцином [26]. Показано, что назальное введение окситоцина мышам-стимуляторам в тесте “социального узнавания” увеличивало контактность мышей С57Вl/6, так же, как и системное введение буспирона (агониста 5-НТ1А), в то время как инфузия назального антагониста окситоцина с последующей системной инъекцией буспирона стимулирующим мышам блокировала этот процесс, это указывает, что путь 5-HT→окситоцин является основным модулятором социальных “дружественных” сигналов. При этом мыши BALB/с изменений в социальном поведении в данном эксперименте не обнаруживали, что свидетельствует как о наличии дефицита в распознавании социальных сигналов, так и об особенностях серотониновой и окситоциновой систем у мышей данной линии [27].

В целом, социальная дискриминация в тесте “социального узнавания” определяется не только показателями памяти (знакомство со стимулирующими животными), но и их обонятельными характеристиками, а также тягой к стабильным условиям существования, при росте тревожности в измененных условиях. Таким образом, пренатальное введение ВН самцам мышей BALB/с усилило характерные для линии проявления социальной дискриминации, а введение афобазола их корректировало, возвращая к контрольным показателям.

Тест “построение гнезда”. Мыши с ФВС (P56–57) в тесте “построение гнезда” независимо от пола демонстрировали снижение поведенческой видовой активности (тест Крускала–Уоллиса), направленной на обеспечение терморегуляции и процессов размножения (табл. 3), что выразилось в снижении числа полностью построенных гнезд на 39.5% у самцов и на 31.9% у самок в отличие от мышей контрольной группы соответствующего пола.

Мыши с ФВС, получавшие афобазол, строили идеальное гнездо (кратер со стенами), так же, как и животные контрольных групп (табл. 3).

В тесте “Y-образный лабиринт с предъявлением аверсивного запаха” поведение самцов мышей линии BALB/c с ФВС (P61–62) не отличалось от поведения животных без патологии. Данное обстоятельство может быть объяснено тем, что мыши линии BALB/c изначально обладают аутизм-релевантным фенотипом с нарушениями в обонятельной сфере, особенно проявляющимися при предъявлении социальных запахов [23].

Введение афобазола самцам мышей с ФВС вызывало улучшение регистрируемых показателей в тесте Y-образный лабиринт с запахом хищника. Так, в группе “ВН + Аф” отмечалось повышение в 2.7 раза латентного времени первого контактного подхода к источнику запаха хищника, тенденция к снижению в 1.3 раза числа заходов в рукав с запахом, а также уменьшение в 1.3 и 1.6 раз числа и продолжительности контактов с источником аверсивного запаха в сравнении с мышами BALB/c с ФВС (табл. 4).

Самки мышей BALB/c с ФВС проводили больше времени около источника аверсивного запаха по сравнению с контрольной группой, что сказалось в увеличении в 1.6 раза продолжительности контакта с ним и тенденции к уменьшению времени нахождения в свободных от аверсивного запаха (“чистых”) рукавах лабиринта.

Введение афобазола самкам с ФВС, как и в случае самцов, способствовало улучшению оборонительного поведения животных, что выразилось в уменьшении в 1.6 и в 1.3 раз числа заходов в рукав с запахом хищника и длительности нахождения в нем соответственно, а также в снижении в 1.4 и в 1.7 раз числа и длительности контакта с источником запаха соответственно, а также в увеличении времени нахождения в “чистых” рукавах лабиринта (табл. 4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что у мышей линии BALB/с с ФВС ярким проявлением РАС является снижение социального взаимодействия, особенно выраженное у самок, снижение предпочтения к исследованию новизны, наблюдаемое у самцов, нарушение типичных характеристик видового поведения, таких как гнездование, проявлявшееся в снижении числа полностью построенных гнезд у самцов и самок и в снижении оборонительного поведения при предъявлении запаха хищника, что было более характерно для самок.

Введение афобазола с раннего постнатального периода (Р7) до периода половой зрелости (Р52–62) нивелировало большинство обусловленных ФВС нарушений социального поведения, что выразилось в отсутствии различий в показателях, регистрируемых в тесте “социальное взаимодействие”, с данными контрольной группы (самцы) или в их улучшении (самки), повышении реакции самцов мышей BALB/c с ФВС на новизну до контрольных значений, усилении активности, направленной на обеспечение терморегуляции и процессов размножения – строительство идеального гнезда представителями обоих полов и в повышении реакции избегания на предъявление запаха хищника как у самцов, так и у самок.

Полученные данные свидетельствуют о том, что афобазол на модели ФВС у мышей линии BALB/с способствует ослаблению нарушений в социальной сфере, в том числе улучшению поведения, направленного на продолжение рода и его защиту.

ВН, противоэпилептическое средство, хорошо известно своими тератогенными побочными эффектами, включая дефекты нервной трубки, лицевые аномалии, снижение интеллекта и высокий риск развития РАС [10, 22]. Причинно-следственная связь между пренатальным воздействием ВН и развитием симптомов РАС подтверждается большим количеством исследований на животных [4, 5, 7, 9, 10, 13, 19, 22].

Механизмы действия ВН на развитие РАС включают ингибирование гистон-деацетилазы, чрезмерную пролиферацию нейральных клеток-предшественников, изменение синаптического развития, передачи и пластичности, нарушение возбудимости нейронов, активности или формирования нейронной сети, например, наличие локальной гиперконнектности в коре головного мозга, увеличение плотности глутаматергических нейронов, нарушение созревания серотонинергических нейронов и увеличение количества активных форм кислорода [5, 28, 29].

Афобазол является агонистом сигма1-рецепторов (σ1) – внутриклеточного белка с функциями шаперона, ингибитором регуляторных сайтов хинонредуктазы-2 (NQO2/QR2; МТ3-рецептор, Ki = 0.97 мкМ), обратимым и селективным ингибитором МАО-А (Ki = 3.6 мкМ), слабым агонистом мелатониновых рецепторов типа 1 (МТ1-Р, Ki = 16 мкМ) [30–33]. Активированные σ1-рецепторы способны восстанавливать укладку белковых молекул при эндоплазматическом стрессе, опосредуют регуляцию потенциалзависимых ионных каналов наружной мембраны, транспорт кальция, способствуют миграции липидных микродоменов к мембране клеток, уменьшая ее повреждения, модулируют процессы передачи сигнала за счет взаимодействия с рецепторными образованиями [31, 33]. Свойства σ1-рецепторов обуславливают широкий спектр фармакологической активности их агонистов, в том числе анксиолитической, нейропротекторной, прокогнитивной и антидепрессивной.

Афобазол, взаимодействуя с σ1-рецепторами, оказывает модулирующее влияние на нейромедиаторные системы мозга (ГАМК-, глутамат-, серотонин-, дофаминергическую и другие), снижает окислительный стресс, в том числе посредством ингибирования хинонредуктазы-2, обеспечивая цитопротекцию, что дает выраженный нейропротекторный эффект [34]. Данное положение подкрепляется результатами о способности афобазола повышать выживаемость нейронов в условиях оксидативного стресса и глутаматергической эксайтотоксичности [35]. Указанные выше мишени могут быть включены в механизм фармакологического действия афобазола в примененной экспериментальной модели. Так, например, в работе Kang и Kim показано, что повышенная активность глутаматных NMDA-рецепторов у крыс с ФВС сопровождается ростом социального дефицита, а фармакологическое подавление данной активности приводит к его уменьшению [5].

Таким образом, результаты настоящего исследования и ранее проведенные работы позволяют заключить, что афобазол по механизму действия и спектру фармакологических эффектов может оказаться перспективным препаратом для фармакотерапии РАС.