Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 2, стр. 249-261

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 37 кроликах массой 3.0–4.0 кг (питомник “Рапполово”, Ленинградская область) в условиях общей анестезии (уретан + хлоралоза (Sigma Chemical Co., США) 500 и 50 мг/кг соответственно, внутрибрюшинно) при искусственной вентиляции легких (частота дыхания 30–40 циклов/мин, дыхательный объем 15–20 см³/кг) с помощью аппарата “Фаза-9” (Россия) и вскрытой грудной клетке. Контроль газового состава и кислотно-щелочного состояния крови осуществляли газоанализатором ABL-50 (Radiometer, Дания) [10]. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям биоэтического комитета Института экспериментальной медицины.

В исследовании проведено 5 серий опытов на перфузируемых изолированных легких in situ двухканальным насосом постоянного расхода (136 мл/мин) производства ФГБНУ “ИЭМ”. Капиллярное гидростатическое давление и коэффициент капиллярной фильтрации определяли с помощью методики волюмометрии экстракорпорально циркулирующей крови [10]. Величины перфузионного давления в легочной артерии, левом предсердии и экстракорпоральном резервуаре измеряли тензодатчиками MLT0699 (AD Instruments, Австралия).

В первой серии экспериментов (7 кроликов, группа сравнения) для моделирования тромбоэмболии легочной артерии в нее через Т-образный тройник, соединенный с перфузионным насосом, вводили 10–15 аутологичных эмболов цилиндрической формы диаметром 0.8 мм и длиной 1–1.5 мм, приготовленных по методике [10]. Во второй и третьей сериях опытов (7 и 8 кроликов соответственно) легочная тромбоэмболия моделировалась после предварительного применения неселективного блокатора М-холинорецепторов атропина (0.01 мг/кг) и блокатора N-холинорецепторов вегетативных ганглиев пентамина (1 мг/кг) [11]. В четвертой серии опытов (8 кроликов) эмболы вводили в легочную артерию в условиях инфузии ацетилхолина (0.001 мкг/кг/мин) в физиологическом растворе (0.9%-ный раствор хлорида натрия) при помощи микродозатора (ФБГНУ “ИЭМ”) на фоне блокады М1-холинорецепторов пирензепином (гастроцепин, Boehringer Ingelheim, ФРГ) (1 мг/кг) [11]. В пятой серии опытов (7 кроликов) тромбоэмболию моделировали в условиях инфузии N-миметика цитизина (цититон, 0.02 мг/кг/мин) в физиологическом растворе после блокады альфа-адренорецепторов фентоламином (1.5–2 мг/кг) и атропином (0.01 мг/кг) [11] с целью исключения активации констрикторных адренергических и М-холинергических механизмов. Все препараты, как и эмболы, вводили непосредственно в легочную артерию. Ацетилхолин, цититон, фентоламин и атропин произведены в России. В конце опытов на электронных весах МАССА-К BK-300 (Россия) измеряли массу легких кроликов, которая составила 25 ± 3 г.

Концентрацию катехоламинов в плазме крови, оттекающей от легких, определяли методом Фолина–Чокалтеу [4, 12]. Для отделения плазмы 3 мл гепаринизированной крови центрифугировали (центрифуга LMC-3000 (Латвия), 1000 об./мин) в течение 20 мин. Для осаждения белков 0.1 мл плазмы добавляли к 1 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и снова центрифугировали (2000 об./мин) в течение 10 мин. Затем к супернатанту добавляли 4 мл 10%-ного раствора карбоната натрия и 0.5 мл реактива Фолина–Чокалтеу. Через 5–10 мин определяли концентрацию катехоламинов на фотометре КФК-3-01 (Россия) при длине волны 650 нм после предварительной калибровки фотометра стандартным 0.1%-ным раствором адреналина (Россия). Реактив Фолина–Чокалтеу, трихлоруксусная кислота и карбонат натрия были приобретены в “Ленреактив” (Россия).

Электрические сигналы измеряемых показателей записывали на жесткий диск компьютера IBM PC Pentium после аналого-цифрового преобразования платой L-Сard L-783 с последующим определением расчетных гемодинамических параметров и анализом по программе АСТest (версия 1.6.59, ООО “Лаборатория автоматизированных систем”, Россия). Изменения исследуемых показателей микроциркуляции легких и концентрацию катехоламинов сравнивали на 5-й минуте после применения указанных выше препаратов и эмболов при достижении максимальных сдвигов давления в легочной артерии. Для статистической обработки результатов опытов с помощью программы Axum 5.0 (Math Soft Inc., США) при проверке гипотезы отличий сдвигов исследуемых показателей от нуля применяли t-критерий Стьюдента. Достоверными считали отличия при p < 0.05; проверка экспериментальных данных на нормальное распределение проводилась с использованием критерия Колмогорова–Смирнова.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходные значения исследуемых показателей микроциркуляции легких, а также концентрация катехоламинов в проведенных сериях экспериментов представлены в табл. 1.

Данные этой таблицы свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий между исходными значениями исследуемых показателей микрогемодинамики легких кроликов в проведенных опытах.

В ответ на применение блокатора М-холинорецепторов атропина большинство исследуемых показателей легочной микроциркуляции возрастало, что могло явиться результатом усиления высвобождения катехоламинов из симпатических нервных окончаний в результате блокады атропином тормозных пресинаптических М2-холинорецепторов [13]. Об этом свидетельствовало повышение концентрации катехоламинов на 9 ± 3% (p < 0.05) (табл. 2). Применение блокатора N-холинорецепторов вегетативных ганглиев пентамина в условиях перфузии изолированных легких сопровождалось снижением большинства исследуемых показателей микроциркуляции легких и концентрации катехоламинов на 12 ± 3% (p < 0.01) (табл. 2). При этом прекапиллярное сопротивление уменьшалось в большей степени, чем посткапиллярное (соответственно 28 ± 4% (p < 0.01) и 6 ± 2% (p < 0.05)), что свидетельствует о преимущественном влиянии нейрогенных констрикторных механизмов на легочные артериальные сосуды.

Результаты проведенных экспериментов позволяют также полагать о сохранении нейрогенного компонента регуляции тонуса легочных сосудов в условиях перфузии изолированных легких in situ.

В опытах отмечено, что коэффициент капиллярной фильтрации в случае применения атропина возрастал, а в ответ на введение пентамина – снижался. Однако оставалось неясным, обусловлено ли это разнонаправленными сдвигами показателей легочной микроциркуляции или изменениями проницаемости эндотелия легочных сосудов.

Для ответа на этот вопрос нами были проведены опыты с активацией М- и N-холинорецепторов. Как отмечено выше, в четвертой серии опытов осуществляли инфузию ацетилхолина на фоне блокады M1-холинорецепторов пирензепином, поскольку констрикция легочных сосудов в случае применения ацетилхолина обусловлена преимущественно активацией М1-холинорецепторов [13]. В пятой серии опытов проводили инфузию N-миметика цитизина после блокады альфа-адренорецепторов фентоламином и М-холинорецепторов атропином с целью исключения активации констрикторных адренергических и М-холинергических механизмов в ответ на возбуждение цитизином N-холинорецепторов вегетативных ганглиев.

Инфузия ацетилхолина на фоне блокады М1-холинорецепторов приводила к снижению большинства параметров микроциркуляции легких. При этом коэффициент капиллярной фильтрации уменьшался на 16 ± 6% (p < 0.05). В условиях инфузии N-миметика цитизина после блокады альфа-адренорецепторов и М-холинорецепторов коэффициент капиллярной фильтрации снижался на 38 ± 9% (p < 0.01), т.е. в большей степени, хотя в обоих случаях показатели легочной микроциркуляции уменьшались примерно одинаково (табл. 2). Следовательно, активация N-холинорецепторов эндотелия способствует снижению проницаемости легочных сосудов, что может иметь значение в условиях легочной тромбоэмболии. Для проверки этого предположения нами были проведены эксперименты, в которых указанную патологию моделировали на фоне инфузии ацетилхолина в условиях блокады М1-холинорецепторов или при инфузии цитизина в сочетании с применением фентоламина и атропина. Результаты этих опытов представлены в табл. 3.

У животных в группе сравнения тромбоэмболия легочной артерии вызывала повышение давления в ней, увеличение пре- и посткапиллярного сопротивлений, легочного сосудистого сопротивления, капиллярного гидростатического давления и коэффициента капиллярной фильтрации.

При легочной эмболии у кроликов на фоне применения атропина давление в легочной артерии, а также легочное сосудистое и прекапиллярное сопротивление возрастали в большей степени, чем в группе сравнения (табл. 3).

Однако сдвиги капиллярного гидростатического давления и посткапиллярного сопротивления в обоих случаях были близкими, что свидетельствует о превалировании констрикторных нейрогенных и гуморальных влияний на артериальные сосуды легких.

При эмболизации легочной артерии в условиях блокады N-холинорецепторов пентамином все исследуемые параметры микроциркуляции легких возрастали в большей степени по сравнению с группой сравнения. В опытах также отмечено, что коэффициент капиллярной фильтрации увеличивался более выражено, чем при указанном воздействии на фоне применения атропина и практически в два раза больше, чем в группе сравнения (табл. 3).

При моделировании легочной тромбоэмболии в условиях инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов прирост давления в легочной артерии был меньше, чем на фоне действия атропина, но близок к таковому в группе сравнения. Вместе с тем, капиллярное гидростатическое давление и посткапиллярное сопротивление не изменялись, а концентрация катехоламинов не повышалась. Однако коэффициент капиллярной фильтрации возрастал на 67 ± 12% (p < 0.01), т.е. в большей степени, чем в группе сравнения (25 ± 4% (p < 0.01)), что могло свидетельствовать о повышении проницаемости эндотелия сосудов легких.

В условиях же эмболизации легочной артерии на фоне активации N-холинорецепторов цитизином в сочетании с применением фентоламина и атропина давление в легочной артерии возрастало меньше, чем при инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов, а капиллярное гидростатическое давление и посткапиллярное сопротивление возрастали (табл. 3). При этом коэффициент капиллярной фильтрации увеличивался на 33 ± 8% (p < 0.01), т.е. практически в 2 раза меньше, чем при легочной тромбоэмболии в условиях инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов. Можно поэтому полагать, что активация N-холинорецепторов эндотелия способствует снижению проницаемости легочных сосудов при указанной патологии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для выяснения возможности активации холинергических механизмов с целью уменьшения констрикторных реакций сосудов легких и проницаемости эндотелия в условиях тромбоэмболии легочной артерии в проведенном исследовании изучали изменения микроциркуляции легких при моделировании легочной тромбоэмболии на перфузируемых изолированных легких кроликов в условиях блокады или активации M- и N-холинорецепторов.

В ответ на применение М-блокатора атропина и N-блокатора пентамина показатели легочной гемодинамики изменялись разнонаправленно: они повышались в случае применения атропина и уменьшались на фоне блокады N-холинорецепторов пентамином, что коррелировало со сдвигами концентрации катехоламинов в плазме крови, оттекающей от легких (табл. 2). Как отмечено выше, возрастание исследуемых показателей легочной микроциркуляции в случае применения атропина могло явиться результатом усиления высвобождения катехоламинов из симпатических нервных окончаний в результате блокады атропином тормозных пресинаптических М2-холинорецепторов [13]. В ответ на применение пентамина в результате блокады N-холинорецепторов вегетативных ганглиев уменьшались симпатические констрикторные влияния преимущественно на легочные артериальные сосуды, о чем свидетельствовало более выраженное уменьшение прекапиллярного сопротивления по сравнению с посткапиллярным (табл. 2).

Таким образом, разнонаправленный характер сдвигов показателей легочной микрогемодинамики в случае применения М-блокатора атропина и N-блокатора пентамина свидетельствует о реципрокных взаимоотношениях М- и N-холинергических механизмов в нейрогенной регуляции легочного микроциркуляторного русла, что было отмечено нами в ранее проведенных исследованиях для показателей системного кровообращения у кошек [14] и легочной макрогемодинамики у кроликов [15].

Для ответа на вопрос о роли холинергических механизмов в регуляции проницаемости эндотелия легочных сосудов нами были проведены опыты с активацией М- и N-холинорецепторов. С этой целью применяли инфузию ацетилхолина на фоне блокады M1-холинорецепторов пирензепином и инфузию N-миметика цитизина после блокады альфа-адренорецепторов фентоламином и М-холинорецепторов атропином. Указанные способы активации холинорецепторов позволили исключить констрикторные реакции легочных сосудов в ответ на возбуждение ацетилхолином М1-холинорецепторов, равно как и активацию цитизином N-холинорецепторов вегетативных ганглиев и в результате – адренергических и М-холинергических механизмов.

Инфузия ацетилхолина на фоне блокады М1-холинорецепторов вызывала снижение большинства параметров микроциркуляции легких, что могло быть обусловлено активацией М-холинорецепторов других подтипов (M2–M5) и усилением синтеза оксида азота [16, 17]. В ответ на инфузию цитизина в сочетании с блокадой альфа-адренорецепторов и М-холинорецепторов показатели легочной микрогемодинамики уменьшались примерно так же, как и при инфузии ацетилхолина в условиях блокады М1-холинорецепторов (табл. 2).

В опытах было отмечено, что при инфузии цитизина на фоне блокады альфа-адренорецепторов фентоламином и М-холинорецепторов атропином параметры микроциркуляции легких снижались в меньшей степени, чем в ответ на применение только фентоламина. Ранее при перфузии изолированных легких кроликов нами было показано [18], что в случае применения этого препарата давление в легочной артерии уменьшалось на 21 ± 6%, а легочное сосудистое сопротивление – на 17 ± 6%, тогда как в условиях инфузии цититона в сочетании с блокадой альфа-адренорецепторов и М-холинорецепторов указанные показатели уменьшались соответственно на 10 ± 2% и 13 ± 4%. Это можно объяснить тем, что цитизин мог активировать N-холинорецепторы легочных нейроэндокринных клеток и усиливать высвобождение из них серотонина, т.е. способствовать легочной вазоконстрикции [19]. В литературе также представлены работы, касающиеся значимости нейроэндокринной системы легких в развитии легочной гипертензии [20].

Коэффициент капиллярной фильтрации в случае инфузии ацетилхолина на фоне блокады M1-холинорецепторов уменьшался на 16 ± 6% (p < 0.05), тогда как при инфузии N-миметика цитизина в сочетании с блокадой альфа-адренорецепторов и М-холинорецепторов указанный показатель уменьшался на 38 ± 9% (p < 0.01), т.е. в большей степени (табл. 2).

При эмболизации легочной артерии после применения N-блокатора пентамина коэффициент капиллярной фильтрации возрастал более выражено, чем при тромбоэмболии на фоне действия M-блокатора атропина и практически в два раза больше, чем в группе сравнения (табл. 3). Полученные данные позволяют полагать, что активация N-холинорецепторов эндотелия в условиях указанной патологии может способствовать снижению проницаемости легочных сосудов.

Для проверки этого предположения нами были проведены эксперименты, в которых легочную тромбоэмболию моделировали на фоне активации М- и N-холинорецепторов. Результаты опытов показали, что при эмболизации легочной артерии на фоне инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов пирензепином прирост давления в легочной артерии был близок к таковому у животных в группе сравнения, но меньше, чем на фоне действия атропина. Вместе с тем, капиллярное гидростатическое давление и посткапиллярное сопротивление не изменялись, а концентрация катехоламинов не повышалась (табл. 3). Результаты этих экспериментов согласуются с ранее проведенными нами исследованиями, в которых показано, что активация тормозных пресинаптических М2-холинорецепторов в условиях тромбоэмболии легочной артерии способствует уменьшению симпатических вазоконстрикторных влияний преимущественно на легочные венозные сосуды [4].

Однако в ответ на эмболизацию легочной артерии в условиях инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов коэффициент капиллярной фильтрации увеличивался на 67 ± 12% (p < 0.01), т.е. в большей степени, чем у кроликов в группе сравнения (25 ± 4%, p < 0.01). Это могло быть обусловлено как большим возрастанием соотношения пре- к посткапиллярному сопротивлению, так и повышением проницаемости эндотелия. В работе [21] на перфузируемых легких кроликов показано, что при введении ацетилхолина в легочную артерию увеличивается синтез эндотелина-I и тромбоксана А₂, которые способствуют повышению проницаемости эндотелия [22, 23].

При легочной тромбоэмболии на фоне активации N-холинорецепторов цитизином в сочетании с применением фентоламина и атропина давление в легочной артерии возрастало меньше, чем в группе сравнения и в условиях инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов.

Как отмечено выше, в ответ на эмболизацию легочной артерии в условиях применения цитизина в сочетании с фентоламином и атропином капиллярное гидростатическое давление и посткапиллярное сопротивление возрастали. Однако коэффициент капиллярной фильтрации увеличивался на 33 ± 8% (p < 0.01), т.е. практически в 2 раза меньше, чем при легочной тромбоэмболии в условиях инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов (табл. 3). Из данных этих опытов следует, что активация N-холинорецепторов эндотелия может способствовать снижению проницаемости легочных сосудов при указанной патологии.

В литературе представлены сведения об участии N-холинорецепторов в регуляции проницаемости эндотелия коронарных и мозговых сосудов [24–26]. Так, в работе [25] показано, что активация указанных рецепторов способствует увеличению проницаемости эндотелия, а в работе [26] – напротив, – уменьшению, т.е. данные литературы являются противоречивыми. В исследовании [27] установлено, что активация N-холинорецепторов эндотелия легочных сосудов снижает его проницаемость в условиях реперфузионного повреждения тонкой кишки.

Вместе с тем, наряду с проницаемостью эндотелия, сдвиги коэффициента капиллярной фильтрации определяются рядом показателей: величиной капиллярного гидростатического давления, количеством функционирующих капилляров, а также соотношением прекапиллярного сопротивления к посткапиллярному. Нами поэтому был проведен корреляционный анализ взаимосвязи между сдвигами соотношения пре- к посткапиллярному сопротивлению и коэффициента капиллярной фильтрации при всех указанных воздействиях (табл. 2 и 3), результаты которого представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Зависимость изменений коэффициента капиллярной фильтрации от сдвигов соотношения пре- к посткапиллярному сопротивлению при блокаде и активации M- и N-холинорецепторов, а также легочной тромбоэмболии в группе сравнения и на фоне блокады или активации холинергических механизмов.

Проведенный анализ выявил высокую степень зависимости (коэффициент корреляции 0.88 ± 0.01) между изменениями соотношения пре- к посткапиллярному сопротивлению и коэффициента капиллярной фильтрации. Поэтому можно было полагать, что сдвиги этого соотношения являются определяющими в изменениях указанного показателя. Так, при тромбоэмболии легочной артерии на фоне инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов соотношение пре- к посткапиллярному сопротивлению возрастало на 142 ± 16% (p < 0.01), а коэффициент капиллярной фильтрации – на 67 ± 12% (p < 0.01). В случае же эмболизации легочной артерии в условиях применения цитизина на фоне блокады альфа-адренорецепторов и М-холинорецепторов указанные показатели возрастали соответственно на 43 ± 14% (p < 0.01) и 33 ± 8% (p < 0.01), т.е. в меньшей степени и практически так же как в контроле (табл. 3). Однако сопоставление данных этих опытов с ранее проведенными экспериментами, в которых тромбоэмболия моделировалась на фоне только блокады альфа-адренорецепторов фентоламином [18], показало, что в последнем случае соотношение пре- к посткапиллярному сопротивлению возрастало на 44 ± 10%, а коэффициент капиллярной фильтрации – на 50 ± 12%, т.е. в большей степени, чем при тромбоэмболии легочной артерии в условиях применения цитизина на фоне блокады альфа-адренорецепторов и М‑холинорецепторов (33 ± 8%). Таким образом, при равных сдвигах соотношения пре- к посткапиллярному сопротивлению в обоих случаях при тромбоэмболии легочной артерии в условиях применения цитизина на фоне блокады альфа-адренорецепторов и М-холинорецепторов коэффициент капиллярной фильтрации возрастал меньше, чем при легочной тромбоэмболии после блокады только альфа-адренорецепторов. Эти данные позволяют полагать, что активация N-холинорецепторов эндотелия легочных сосудов приводит к снижению проницаемости сосудов легких. Следовательно, существует реципрокный характер взаимодействия M- и N-холинергических механизмов регуляции проницаемости легочных сосудов: активация М-холинорецепторов способствует повышению коэффициента капиллярной фильтрации, тогда как активация N-холинорецепторов – его уменьшению.

Итак, результаты проведенных экспериментов показали, что при тромбоэмболии легочной артерии в условиях инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов пирензепином прирост давления в легочной артерии был близок к таковому у животных в группе сравнения. Вместе с тем, капиллярное гидростатическое давление и посткапиллярное сопротивление не изменялись, что свидетельствует об уменьшении симпатических констрикторных влияний преимущественно на легочные венозные сосуды. При этом коэффициент капиллярной фильтрации возрастал в большей степени, чем у кроликов в группе сравнения, что можно объяснить повышением проницаемости эндотелия сосудов легких.

В ответ на указанное воздействие в условиях инфузии N-миметика цитизина в сочетании с блокадой альфа-адренорецепторов фентоламином и М-холинорецепторов атропином прирост давления в легочной артерии и прекапиллярного сопротивления был менее выражен, чем при инфузии ацетилхолина на фоне блокады М1-холинорецепторов и в группе сравнения. Это свидетельствует о преимущественном дилататорном влиянии активации N-холинорецепторов эндотелия на легочные артериальные сосуды. В указанных условиях капиллярное гидростатическое давление и посткапиллярное сопротивление возрастали, однако коэффициент капиллярной фильтрации увеличивался в меньшей степени, чем при тромбоэмболии легочной артерии в условиях инфузии ацетилхолина в сочетании с блокадой М1-холинорецепторов. Следовательно, реципрокный характер взаимодействия M- и N-холинергических механизмов проявляется не только в регуляции тонуса сосудов легких, но и проницаемости эндотелия: активация М-холинорецепторов эндотелия в условиях легочной тромбоэмболии способствует увеличению коэффициента капиллярной фильтрации, тогда как активация N-холинорецепторов – его уменьшению.