Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 3, стр. 296-303

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальное исследование проведено на 54 беременных крысах массой 200–250 г, которые были разделены на три группы. Контрольная группа – беременные интактные крысы, первая опытная группа – беременные крысы с глубоким термическим ожогом кожи (3-и сутки беременности), вторая опытная группа – беременные крысы с глубоким термическим ожогом кожи, которым выполнялась ранняя некрэктомия (6-е сутки беременности). В соответствии с принципами Базельской декларации и с разрешения комитета по биомедицинской этике и деонтологии учреждения образования “Гродненский государственный медицинский университет” ожог наносили после введения тиопентала натрия (внутрибрюшинно, в дозе 50 мг/кг). Методика выполнения экспериментальной травмы предусматривала ожог III степени освобожденной от шерсти кожи спины. Ожог наносили на 3-и сутки беременности (первым днем беременности считался день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках) горячей жидкостью (вода) 99–100°C в течение 15 с специально разработанным устройством [9]. В результате воздействия термического агента создавались стандартные по площади (около 12 см²) ожоговые раны. После нанесения термического ожога на рану крепили предохранительную камеру. Некрэктомию выполняли через трое суток после моделирования термической травмы, под обезболиванием (тиопентал натрия внутрибрюшинно, в дозе 40 мг/кг). Далее на рану накладывали D4 повязку и крепили предохранительную камеру (рис. 1).

Рис. 1.

Иссечение ожогового струпа (a), вид термической раны после некрэктомии (b).

Под адекватным наркозом (50–60 мг/кг тиопентала натрия, интраперитонеально) на 13-е и 20-е сутки беременности животные выводились из эксперимента, производился забор смешанной венозной крови путем интракардиальной пункции.

В крови на газоанализаторе StatProfilepHOxplus L при 37°С определяли показатели кислородтранспортной функции (КТФ): парциальное давление кислорода (рО₂), степень оксигенации (SO₂). Сродство гемоглобина к кислороду (СГК) оценивали по показателю р50реал. (рО₂ крови при 50%-ном насыщении ее кислородом). По формулам Severinghaus [10] рассчитывали значение р50станд. Кислотно-основное состояние изучали по показателям: парциальное давление углекислого газа (рСО₂), стандартный бикарбонат (SBC), реальный/стандартный недостаток (избыток) буферных оснований (АВЕ/SBE), гидрокарбонат (${\text{HCO}}_{3}^{ - }$), концентрация водородных ионов (рН), общая углекислота плазмы крови (ТСО₂).

Активность свободнорадикальных процессов оценивали по содержанию первичных – диеновые конъюгаты (ДК) и промежуточных – малоновый диальдегид (МДА) продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Уровень ДК в плазме определяли по интенсивности поглощения липидным экстрактом монохроматического светового потока в области спектра 232–234 нм, характерного для конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов. Оптическую плотность измеряли на спектрофлуориметре СМ 2203 “СОЛАР” (Беларусь) при длине волны 233 нм по отношению к контролю. Концентрацию ДК выражали в ΔD₂₃₃/мл. Содержание МДА оценивали по взаимодействию с 2'-тиобарбитуровой кислотой, которая при нагревании в кислой среде приводит к образованию триметинового комплекса розового цвета. Интенсивность окраски измеряли спектрофотометрически на спектрофотометре PV1251C “СОЛАР” (Беларусь) при длине волны 535нм по отношению к контролю. Концентрацию МДА выражали в мкмоль/л. Для определения активности каталазы в плазме использовали метод Королюк [11], основанный на спектрофотометрической регистрации количества окрашенного продукта реакции Н₂О₂ с молибденовокислым аммонием, имеющим максимальное светопоглощение при длине волны 410 нм. Активность каталазы выражали в нмоль Н₂О₂/мин/мг белка. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 нмоль продукта за 1 мин в условиях испытания. Для определения содержания церулоплазмина в плазме крови использовали модифицированный метод Равина, принцип метода которого основан на окислении р-фенилендамина при участии церулоплазмина. Концентрацию α-токоферола и ретинола определяли по методу Taylor [12], основанному на определении интенсивности флуоресценции гексанового экстракта при длине волны возбуждения 286 нм и испускания 350 нм (для α-токоферола) и при длине волны возбуждения 325 нм и испускания 470 нм (для ретинола) на спектрофлуориметре СМ 2203 “СОЛАР” (Беларусь). В контрольную пробу вместо исследуемого материала вносили аликвоту бидистиллированной воды, а в стандартную – рабочего раствора, приготовленного из стандартов α-токоферола и ретинола (“Sigma”).

Все показатели проверяли на соответствие признака закону нормального распределения с использованием критерия Шапиро–Уилка. С учетом этого были использованы методы непараметрической статистики при помощи функций базового пакета “base” расширения языка программирования “R”. Сравнение трех независимых групп проводили с помощью критерия Крускела–Уоллиса с последующими апостериорными попарными сравнения по критерию Стила–Дваса–Кричлоу–Флинера (пакет “NSM3” расширения языка “R”). Достоверность полученных данных с учетом размеров малой выборки, множественных сравнений оценивалась с использованием U-критерия Манна–Уитни. Результаты представлены как медиана (Me), 25-й и 75-й процентиль. Уровень статистической значимости принимали при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рис. 2 представлены данные о характере изменения КТФ крови у беременных крыс после воспроизведения глубокого термического ожога кожи на 3-и сутки беременности и выполнения ранней некрэктомии. Термическая травма приводила к снижению значений рO₂ (на 24.8%, p < 0.01 в первой опытной группе и на 30.5%, p < 0.01 во второй опытной группе в сравнении с контролем) и SO₂ (на 18.2%, p < 0.01 в первой опытной группе и на 24.4%, p < 0.01 во второй опытной группе в сравнении с контрольной группой) на 13-е сутки беременности, которые достигали уровня контрольных цифр к 20-м суткам беременности, при этом в опытной группе животных, которым выполнялось оперативное лечение, отмечалось более выраженное снижение данных показателей. Показатель сродства гемоглобина к кислороду р50реал. был повышен в обеих опытных группах на 13-е сутки беременности (во второй опытной группе на 2 мм рт. ст. выше, чем в первой, p < 0.05), что свидетельствует о сдвиге кривой диссоциации оксигемоглобина вправо, соответственно большая степень сдвига фиксировалась после выполнения ранней некрэктомии. Схожая динамика изменений была и по показателю р50станд. Также на 13-е сутки беременности после хирургического удаления струпа было отмечено снижение уровня гемоглобина 109 (102; 114) г/л, p < 0.05 в сравнении с первой опытной группой 119 (114; 123) г/л, что может быть связано с кровопотерей во время операции.

Рис. 2.

Влияние ранней некрэктомии на кислородтранспортную функцию крови у беременных экспериментальных животных с глубоким термическим ожогом кожи. * – p < 0.05 изменения в сравнении с контролем, ** – p < 0.01 изменения в сравнении с контролем, # – p < 0.05 изменения в сравнении с группой “Ожог”.

Снижение таких показателей кислотно-основного состояния как рН, ${\text{HCO}}_{3}^{ - }$, ТСО₂, SBC, АВЕ/SBE указывает на развитие ацидоза у беременных крыс с глубоким термическим ожогом кожи, выраженный в большей степени после проведения ранней некрэктомии (табл. 1). Однако к 20-м суткам беременности статистически значимых различий между первой и второй опытными группами животных не определялось.

В табл. 2 представлены данные о характере изменения показателей процессов перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной защиты. На 13-е сутки беременности в результате моделирования термического ожога кожи у экспериментальных животных отмечался значительный подъем концентрации ДК в плазме крови – на 75% (р < 0.05), после проведения ранней некрэктомии на 116.7% (р < 0.05) в сравнении с контрольной группой. Уровень данного первичного продукта ПОЛ оставался увеличенным на 66,7% (p < 0.05) и на 20-е сутки беременности в обеих опытных группах в сравнении с контролем. Содержание МДА в обеих опытных группах на 13-е сутки беременности было повышено в сравнении с контрольной группой, на 20-е сутки не отличалось от контрольных значений. На фоне возросшей активности процессов ПОЛ отмечалось значительное угнетение механизмов антиоксидантной защиты в обеих опытных группах, проявляющееся уменьшением активности каталазы и уровня α-токоферола и ретинола. Более выраженным дисбаланс прооксидантно-антиоксидантного состояния наблюдался после выполнения ранней некрэктомии.

Прерывание беременности наблюдалось у 33.3% крыс как в первой, так и во второй опытной группе. Значения преимплантационной гибели плодов в первом и втором опыте составили 38.5% и 39.6% соответственно, постимплантационной гибели плодов – 25% и 28%, в контроле оба показателя равны 0%. У живых плодов опытных групп на 20-й день беременности масса тела была меньше (опыт 1 – 2 (1.6; 2.2) г, p < 0.05, опыт 2 – 2 (1.7; 2.3) г, p < 0.05) чем в контрольной группе (2.7 (2.3; 2.8) г). При осмотре плодов внешних аномалий в опытной группе не определялось.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одним из путей повышения эффективности лечения глубоких термических ожогов признается выполнение ранней некрэктомии уже в остром периоде ожоговой болезни [13]. Однако хирургическое вмешательство является операционной травмой и может повлечь за собой ухудшение тяжести состояния, прогрессирование воспалительной реакции и интоксикации, развитие гнойно-септических осложнений, приводящих к синдрому полиорганной недостаточности, т.е. вызвать эффект “второго удара” [14, 15]. В нашем исследовании на 13-е сутки беременности после проведения ранней некрэктомии наблюдались более выраженные нарушения кислородтранспортной функции крови (снижение рO₂, SO₂, р50реал., р50станд., Нb, рН, ${\text{HCO}}_{3}^{ - }$, ТСО₂, АВЕ) в сравнении с опытной группой крыс без хирургического лечения, это свидетельствовало об ухудшении кислородного снабжения организма беременных экспериментальных животных, включении анаэробного механизма метаболизма, что привело к образованию большого количества кислых продуктов и развитию ацидоза. Сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо можно расценивать как попытку компенсировать кислородную недостаточность, но в условиях, когда нарушена утилизация кислорода тканями и значительная его часть используется в свободнорадикальных процессах, увеличение потока кислорода в ткани может привести к развитию окислительного стресса [16–19]. Во второй опытной группе в сравнении с первой наблюдалось более выраженное угнетение антиоксидантной защиты, проявлявляющееся низкой активностью каталазы, снижением уровня α-токоферола и ретинола. При этом отмечалась высокая концентрация церулоплазмина в плазме крови экспериментальных животных после выполнения ранней некрэктомии. Известно, что церулоплазмин – это антиоксидант, который относится к позитивным белкам острой фазы, главной задачей которых является организация репаративных процессов в зоне повреждения [20]. К 20-м суткам беременности отмечалось улучшение состояния экспериментальных животных обеих опытных групп и статистически значимых отличий между первой и второй опытными группами не наблюдалось.

Определено влияние термической травмы и хирургического лечения на плод. Глубокий термический ожог кожи, полученный в раннем периоде беременности крыс, приводил к нарушению течения беременности, проявляющегося прерыванием беременности, преимплантационной и постимплантационной гибелью потомства, гипотрофией плодов. Дополнительного эмбриотоксического влияния ранней некрэктомии не выявлено.

Таким образом, ранняя некрэктомия у беременных крыс с глубокими термическими ожогами кожи, вызывая временное ухудшение кислородтранспортной функции крови (снижение рO₂, SO₂, а также уменьшение сродства гемоглобина к кислороду) и активацию свободнорадикальных процессов (увеличение содержания ДК и МДА в плазме крови) на фоне истощения антиоксидантной защиты (уменьшение активности каталазы и уровня α-токоферола и ретинола) в организме матери, не приводит к достоверному количественному росту преимплантационной и постимплантационной гибели плодов.