Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 5, стр. 649-666

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 33 пациента (22 мужчины и 11 женщин; средний возраст 65 ± 8.6 лет) с атеростенозом каротидного синуса (КС) ≥ 60% (84% ± 9%) по данным дооперационного дуплексного сканирования ветвей дуги аорты, которым была выполнена операция каротидной эндартерэктомии с последующим патоморфологическим исследованием удаленных атеросклеротических бляшек на всем их протяжении. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствовали этическим стандартам Национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Бляшки в зависимости от длины разрезали на 4–9 поперечных блоков толщиной 0.3 см, которые фиксировали в 10%-ном забуференном растворе формалина по стандартной гистологической методике и заливали в парафин. С каждого парафинового блока делали серийные срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, по методам ван Гизона и Вейгерта для оценки структуры бляшки и выявления коллагеновых и эластических волокон соответственно, а также иммуногистохимически с использованием антител к CD34 (выявление кровеносных сосудов), CD68 (оценка общей макрофагальной реакции), сосудистым эндотелиальным факторам роста (VEGFA, VEGFB, VEGFC и VEGFD) и их рецепторам (VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3), FGF2, PDGF-B и TSP-1.

Для визуализации иммунопероксидазной реакции использовали систему детекции Ultravision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией следующим образом. Срезы депарафинировали, дегидратировали в ряду спиртов нисходящей концентрации, промывали в дистиллированной воде, обрабатывали раствором UltraVision Peroxide Block (Thermo Fisher Scientific, США) для инактивации тканевых пероксидаз, после чего демаскировали антиген в цитратном буфере с рН 6 (Abcam, США) на водяной бане при температуре 80°С в течение 20 мин. После остывания раствора (около 30 мин) препараты выдерживали в трис-буферном солевом растворе (TBS) c добавлением 0.1%-ного раствора Triton x100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 20 мин, блокировали неспецифическое связывание раствором UltraVision Protein Block (Thermo Fisher Scientific, США) и инкубировали срезы с раствором антител во влажной камере. Разведения антител, время и условия инкубации представлены в табл. 1.

После инкубации с антителами препараты промывали раствором TBST (трис-буфер с NaCl и Твин 20), помещали в раствор усилителя первичных антител Primary Antibody Amplifier Quanto (Thermo Fisher Scientific, США) на 10 мин, повторно промывали TBST, выдерживали 10 мин в конъюгированной с полимером пероксидазе хрена HRP polymer Quanto (Thermo Fisher Scientific, США), промывали в дистиллированной воде, окрашивали в течение 5 мин 3-3-диаминобензидином (DAB) в составе приготовленной согласно инструкции смеси DAB Quanto Substrate и DAB Quanto Chromogen (Thermo Fisher Scientific, США), после чего докрашивали гематоксилином. В качестве отрицательного контроля проводилась иммуногистохимическая реакция без первичных антител.

Окрашенные срезы переводили в цифровую форму с помощью сканера гистологических препаратов Pannoramic MIDI II (3DHISTECH Ltd., Венгрия) при 400-кратном увеличении изображения и анализировали в программе CaseViewer (3DHISTECH Ltd., Венгрия). Оценивали объемную долю атероматоза (%), объемную долю кальцификатов (%), степень выраженности в бляшке пылевидного обызвествления (включая мелкие кальцификаты), свежих и организованных кровоизлияний, а также макрофагальной реакции.

Степень выраженности пылевидного обызвествления и кровоизлияний оценивали полуколичественно по 5-бальной шкале: 0 – компонент отсутствует, 1 – компонент присутствует в следовых количествах, 2 – компонент занимает до 25% площади среза, 3 – от 25 до 50% площади среза, 4 – более 50% площади среза.

Макрофагальную реакцию, а также экспрессию ангиогенных факторов и их рецепторов в бляшке также оценивали полуколичественно по 5-бальной шкале: 0 – отсутствие экспрессии или отдельные иммунореактивные клетки; 1 – единичные небольшие скопления иммунореактивных клеток; 2 – скопления иммунореактивных клеток занимают в совокупности до 15% площади среза; 3 – скопления иммунореактивных клеток занимают в совокупности от 15 до 30% площади среза; 4 – скопления иммунореактивных клеток занимают в совокупности более 30% площади среза. Интенсивность экспрессии маркеров оценивали полуколичественно: + слабая экспрессия; ++ умеренная экспрессия; +++ выраженная экспрессия.

С учетом крайне неравномерного расположения сосудов в бляшке, количество новообразованных сосудов (CD34⁺) анализировали во всех поперечных срезах бляшки и рассчитывали усредненную величину “количество сосудов в 1 см² бляшки” (сумма всех сосудов во всех срезах, разделенная на сумму площадей всех срезов в см²).

Статистическую обработку проводили в программе Statistica (StatSoft Inc., США) версии 13.3. Для выявления различий между независимыми группами применяли непараметрический критерий Манна–Уитни, анализа парных измерений – критерий Вилкоксона, зависимости – коэффициент корреляции Спирмена. Результаты статистического анализа считали значимыми при уровне р < 0.05. Результаты представлены в виде медианы [квартиль 1; квартиль 3] (Ме [Q1; Q3]).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проанализирована структура 33 атеросклеротических бляшек. Результаты гистологического исследования бляшек представлены в табл. 2. В соответствии с международной классификацией [14], 13 бляшек отнесено к типу V (атероматозные бляшки), 12 – к типу VI (осложненные атеросклеротические поражения с изъязвлением покрышки и/или массивным кровоизлиянием в бляшку), 6 – к типу Vb или VII (кальцинозные бляшки) и 2 – к типу Vc или VIII (фиброзные бляшки).

Новообразованные сосуды обнаружены во всех бляшках. Количество сосудов варьировало в широких пределах, составив от 15 до 1320 в 1см². Большинство из них имели незрелую структуру – тонкую стенку, представленную только слоем эндотелиальных клеток (ЭК), при этом слой перицитов, как правило, отсутствовал; целостность эндотелиального слоя во многих случаях была нарушена, между эндотелиоцитами наблюдались щели; отмечались признаки нарушения проницаемости – в 73% бляшек выявлены периваскулярные скопления эритроцитов, сидерофагов и/или глыбок гемосидерина (рис. 1).

Рис. 1.

Новообразованные сосуды (V) бляшки каротидного синуса человека с участками нарушения целостности эндотелиального слоя (указаны стрелками) и периваскулярными кровоизлияниями (скопления эритроцитов (E) и сидерофагов (S)). a – иммуногистохимическая реакция с антителами к CD34; b‒d – окраска гематоксилином и эозином. Масштабный отрезок соответствует 25 мкм.

Оценена экспрессия 4-х классических стимуляторов ангиогенеза – сосудистых эндотелиальных факторов роста (VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD) и рецепторов к ним (VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3), альтернативного активатора ангиогенеза (FGF2), ингибитора ангиогенеза (TSP-1) и стабилизатора новообразованной сосудистой сети (PDGF-B). Сводные данные по интенсивности и распространенности экспрессии ангиогенных факторов представлены в табл. 3 и 4.

Анализ экспрессии ангиогенных факторов продемонстрировал отчетливое преобладание экспрессии VEGFD над прочими оцененными факторами роста (р < 0.001). Выраженная иммунореактивность к VEGFD наблюдалась во всех типах клеток, включая макрофаги и гигантские многоядерные клетки, ГМК/миофибробласты бляшки и ГМК средней оболочки, ЭК каротидного синуса и новообразованных сосудов бляшки (табл. 3). Следует также подчеркнуть распространенный характер иммунореактивности – в подавляющем большинстве бляшек наблюдалась субтотальная экспрессия маркера клеточными популяциями бляшки (табл. 4, рис. 2d).

Рис. 2.

Экспрессия ангиогенных факторов и их рецепторов в кальцинозной атеросклеротической бляшке каротидного синуса (тип VII). Масштабный отрезок соответствует 20 мкм.

В меньшей по сравнению с VEGFD, но также в значительной степени была выражена экспрессия VEGFA, FGF2 и PDGF-B (рис. 2a, 2e и 2f соответственно). Распространенность и интенсивность экспрессии данных факторов роста значимо между собой не различались (р < 0.05). Положительная цитоплазматическая иммунореактивность, как и в случае VEGFD, наблюдалась в макрофагах и гигантских многоядерных клетках, ГМК/миофибробластах бляшки и средней оболочки, ЭК новообразованных сосудов бляшки и каротидного синуса. При этом экспрессия маркеров наиболее стабильно выявлялась в макрофагах, тогда как в ГМК и ЭК значительно варьировала в разных бляшках – от отдельных иммунореактивных клеток и небольших их очаговых скоплений до субтотальной экспрессии клеточными популяциями бляшки. Наиболее выраженная экспрессия VEGFA, FGF2 и PDGF-B в ГМК и ЭК отмечалась в бляшках с многочисленными крупными скоплениями макрофагов, также экспрессирующих данные маркеры. Кроме того, при иммуногистохимической реакции наблюдалось окрашивание волокнистого компонента бляшки – преимущественно слабое очаговое в случае VEGFA, выраженное и распространенное в случае FGF2, а также выраженное и распространенное, но ассоциированное в наибольшей степени с эластическими волокнами, в случае PDGF-B.

Содержание в бляшке VEGFA, VEGFD и FGF2 прямо коррелировало между собой (р < 0.05), в особенности VEGFA с двумя другими факторами (p < 0.01). Кроме того, экспрессия PDGF-B слабо коррелировала с экспрессией FGF2 (p < 0.05), при этом в бляшках с многочисленными скоплениями PDGF-B⁺ клеток было значимо больше FGF2 иммунопозитивных клеток (р < 0.05). Результаты корреляционного анализа представлены в табл. 5.

В наименьшей степени среди активаторов ангиогенеза в бляшке экспрессировались VEGFB и VEGFC (p < 0.001). Слабая или умеренная иммунореактивность к VEGFB (рис. 2b) отмечалась главным образом в макрофагах и отдельных ЭК или ГМК. Среди иммунореактивных к VEGFC клеток также преобладали макрофаги, однако экспрессия в ЭК и ГМК встречалась чаще и имела более выраженную интенсивность (табл. 3, рис. 2c), а доля иммунореактивных клеток больше, хотя различие в выраженности экспрессии данных факторов не достигало статистической значимости.

Экспрессия TSP-1 оценена только в 17 бляшках. Среди иммунореактивных клеток преобладали макрофаги, как правило формирующие немногочисленные небольшие скопления (табл. 4). Слабая экспрессия также наблюдалась в единичных ГМК и ЭК (табл. 3). Количество TSP-1 в бляшках было значимо ниже, чем прочих проанализированных регуляторов ангиогенеза (p < 0.001 в случае VEGFA, VEGFD, FGF2 и PDGF-B; р < 0.05 в случае VEGFC), за исключением VEGFB (p = 0.5), и коррелировала с уровнем VEGFC (p < 0.001) и PDGF-B (p < 0.05) (табл. 5).

Помимо ангиогенных факторов была оценена экспрессия рецепторов к сосудистым эндотелиальным факторам роста. VEGFR1 выявлялся в бляшке в следовых количествах в макрофагах, поэтому было исследовано только 5 бляшек. В бляшках преобладала экспрессия VEGFR2 и VEGFR3, коррелировавшая между собой (p < 0.001, табл. 5). Иммунореактивность к обоим рецепторам наблюдалась в макрофагах, ГМК бляшки и средней оболочки, а также ЭК (рис. 1g, 1h), однако характер и интенсивность экспрессии различались (табл. 3). В то время как VEGFR2 активно экспрессировался во всех типах клеток, причем наиболее выражена экспрессия была в ГМК/миофибробластах, иммунореактивность к VEGFR3 главным образом отмечалась в макрофагах, значительно реже в ГМК и в отдельных бляшках в ЭК, причем экспрессия наблюдалась в отдельных клетках эндотелиальной выстилки новообразованного сосуда. С экспрессией обоих рецепторов в бляшках прямо коррелировало содержание в ней FGF2 (p < 0.001), причем с VEGFR2 в большей степени, чем с VEGFR3 (табл. 5). Также отмечена прямая зависимость между экспрессией VEGFA и VEGFR3 (p < 0.001, табл. 5).

Содержание проанализированных факторов роста и их рецепторов значимо не различалось в бляшках разного типа, в зависимости от объема атероматоза, кальцификатов, степени выраженности воспаления (размера скоплений CD68⁺ макрофагов). В то же время отмечена прямая зависимость между плотностью расположения новообразованных сосудов в бляшке (количеством сосудов в 1 см² бляшки) и содержанием в ней VEGFA, VEGFD, FGF2, PDGF-B, VEGFR2 (р < 0.01) и VEGFR3 (p < 0.05, табл. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ангиогенез представляет собой сложный процесс, регулируемый про- и антиангиогенными факторами, которые включают динамическое взаимодействие между многочисленными клетками, факторами роста и внеклеточным матриксом [15]. Ключевым фактором запуска ангиогенеза считается VEGFA, который при взаимодействии с VEGFR2 вызывает пролиферацию, миграцию и инвазию ЭК в окружающие ткани, способствует привлечению воспалительных клеток, а также стимулирует синтез матриксных металлопротеиназ, необходимых для деградации базальной мембраны и внеклеточного матрикса, обязательного этапа ангиогенеза [16]. VEGFA является наиболее изученным ангиогенным фактором в семействе сосудистых эндотелиальных факторов роста [3]. Связывание VEGFA с VEGFR2 также приводит к выраженному повышению проницаемости эндотелия [16], вследствие чего он также известен как фактор сосудистой проницаемости.

VEGFA в норме экспрессируется преимущественно в ЭК и перицитах, однако в условиях гипоксии и воспаления также отмечена его продукция моноцитами/макрофагами и ГМК [17]. Согласно ранее проведенным исследованиям, VEGFA в большом количестве представлен в бляшках сонных артерий на поздних стадиях развития атеросклероза, где он выявлялся в ЭК, ГМК и макрофагах [18]. Мы также отметили выраженную экспрессию VEGFA в бляшках каротидного синуса, при этом иммунореактивность наиболее стабильно наблюдалась в макрофагах, тогда как в ГМК и ЭК варьировала в широких пределах, но увеличивалась с повышением количества иммунореактивных макрофагов.

Прямая зависимость между уровнем VEGFA и выраженностью неоваскуляризации продемонстрирована в многочисленных работах при широком спектре различных заболеваний, включая атеросклероз [17]. Кроме того, применение моноклональных антител к VEGFA приводило к уменьшению неоваскуляризации и размера бляшки [13], подчеркивая значимость фактора в ангиогенезе при атеросклерозе. Полученные нами данные подтверждают описанную закономерность – выраженность экспрессии VEGFA коррелировала с количеством микрососудов в бляшке. Активация VEGFA в бляшках приводит к формированию высокопроницаемых, структурно неполноценных микрососудов, которые способствуют усилению воспаления, окислительного стресса и, в целом, прогрессированию атеросклероза [16]. В этой связи неудивительно, что VEGFA рассматривался как многообещающая мишень терапевтического воздействия для блокады ангиогенеза в бляшке. Тем не менее, спектр побочных эффектов, выявленных в клинических исследованиях при онкологических и офтальмологических заболеваниях [17], исключает использование блокаторов VEGFA/VEGFR2 для длительного лечения атеросклероза.

Экспрессия VEGFR2 в проанализированных бляшках также была выражена в значительной степени, наблюдалась в ЭК, макрофагах и особенно ГМК, а также коррелировала с количеством микрососудов. По данным литературы, VEGFR2 преимущественно выявляется в ЭК, но не в макрофагах или ГМК, опосредуя передачу сигнала VEGFA [16]. Тем не менее, экспрессия VEGFR2 в ГМК была отмечена в немногочисленных исследованиях. В частности, в одном исследовании на культуре ГМК продемонстрировано резкое повышение экспрессии VEGFR2 под действием гипоксии, что в сочетании с повышенным уровнем VEGFA приводило к активации пролиферации ГМК [19]. Кроме того, экспрессия рецептора была зафиксирована в ГМК аорты кроликов WHHL (генетически гиперлипемичные кролики Ватанаба) [20]. Таким образом, персистирующая резко выраженная гипоксия в бляшке каротидного синуса на поздних стадиях развития атеросклероза может стимулировать экспрессию VEGFR2 в ГМК с последующей их пролиферацией, что, возможно, объясняет выявленную нами экспрессию рецептора в ГМК и требует дополнительного подтверждения.

В моноцитах/макрофагах и ГМК наряду с ЭК чаще описывается экспрессия другого рецептора VEGFA – VEGFR1 [16]. VEGFR1 имеет в 10 раз более высокое сродство к VEGFA, чем VEGFR2, однако результирующий сигнал является слабым [17]. Растворимая форма рецептора связывает VEGFA, предотвращая его связывание с полноразмерной формой VEGFR1 и VEGFR2 [21]. Кроме того, гетеродимеры VEGFR1/VEGFR2 блокируют передачу сигнала VEGFA, предотвращая VEGFR2 гомодимерную активность [12]. В этой связи VEGFR1 известен своей негативной регуляторной ролью в ангиогенезе. В проведенном исследовании VEGFR1 выявлялся в бляшках в следовых количествах, что могло дополнительно стимулировать ангиогенез и ускорить прогрессирование атеросклероза вследствие усиления сигнала VEGFA/VEGFR2. Имеются данные о деградации рецептора при связывании с липопротеинами низкой плотности [15], широко представленными в бляшках, что может отчасти объяснить отмеченный в нашем исследовании столь низкий уровень VEGFR1.

Мы также проанализировали содержание в бляшках других членов семейства VEGF, а именно VEGFB, VEGFC и VEGFD, с неожиданным результатом – из всех проанализированных сосудистых эндотелиальных факторов роста, включая VEGFA, отмечено ранее не описанное отчетливое преобладание VEGFD с субтотальной выраженной экспрессией маркера всеми типами клеточных популяций в большинстве исследованных бляшек.

VEGFD очень близок по структуре и рецепторной специфичности к VEGFC, и основным его биологическим эффектом при взаимодействии с VEGFR3 ранее считался лимфангиогенез [17]. Тем не менее, было продемонстрировано, что VEGFD является эффективным ангиогенным фактором, реализующим свое действие через посредство VEGFR2 или гетеродимеров VEGFR2/VEGFR3 либо опосредованно, повышая экспрессию других факторов роста, включая VEGFA [16]. Полученные нами данные о наличии корреляции между уровнями VEGFD и VEGFA в бляшке могут косвенно подтверждать ранее отмеченную другими авторами взаимосвязь двух факторов. Прямая зависимость степени выраженности неоваскуляризации в бляшке и экспрессии в ней VEGFD также может указывать на активное участие VEGFD в регуляции ангиогенеза при атеросклерозе.

Большинство опубликованных результатов исследований по механизму действия VEGFD посвящено его роли в канцерогенезе, в том числе в аспекте патологического ангио- и лимфангиогенеза, а также в патогенезе других заболеваний, включая сердечно-сосудистые [16, 22]. Данные о роли VEGFD в атерогенезе и прогрессировании атеросклероза, в том числе в неоваскуляризации бляшки, единичны. В частности, на кроличьей модели сахарного диабета в атеросклеротических бляшках каротидного синуса продемонстрировано, что экспрессия VEGFD в атеросклеротических бляшках была повышена и наблюдалась в ЭК, ГМК и макрофагах [20, 23], это согласуется с полученными нами данными по характеру экспрессии маркера. Проатерогенное действие VEGFD также показано на модели каротидной гиперплазии у кроликов, у которых введение в адвентицию аденовируса, кодирующего VEGFD, приводило к утолщению интимы [1]. Помимо ангио- и лимфангиогенного действия, сигнальный путь VEGFD/VEGFR3 вовлечен в стимуляцию миграции и пролиферации миофибробластов, а также стимуляцию синтеза коллагена 1-го типа в культуре миофибробластов сердца, способствуя фиброзу [24]. VEGFD также обладает антиоксидантной активностью и регулирует липидный обмен [16].

В целом, имеющиеся в литературе данные свидетельствует о потенциально значительной роли VEGFD в атерогенезе и неоваскуляризации, что требует дополнительного изучения и делает его привлекательной мишенью терапевтического воздействия при атеросклерозе, в особенности с учетом широкого спектра уже разработанных препаратов, направленных на активацию или подавление VEGFD/VEGFR3 сигнального пути. Препараты данного типа успешно прошли доклинические исследования и применяются в клинических исследованиях I/IIa фазы при онкологических, офтальмологических (влажная возрастная макулярная дегенерация) и сердечно-сосудистых заболеваниях (рефрактерная стенокардия) [22].

По нашим данным, содержание VEGFC в бляшках было значимо ниже, чем VEGFD и VEGFA. VEGFC считается ключевым фактором лимфангиогенеза, реализующим свое действие через взаимодействие с VEGFR3 [16]. Тем не менее, VEGFC может связываться с VEGFR2, хотя и с более низкой афинностью, чем с VEGFR3, и запускать ангиогенез [16]. Отмечена обратная связь между ангиогенезом и лимфангиогенезом, а именно значимое снижение ангиогенеза при активном развитии лимфатической сети и наоборот. Поэтому ангиогенез, опосредуемый VEGFC, преимущественно происходил вдали от очагов лимфангиогенеза [16]. Кроме того, получены данные о возможности запуска ангиогенеза при связывании VEGFC с VEGFR3 за счет стимуляции экспрессии PDGF-B, вовлеченного в активацию ЭК [25], или под действием атерогенной микроРНК MiR-27b, которая усиливала экспрессию VEGFC с последующей стимуляцией пролиферации и миграции клеток и ангиогенеза в культуре HMEC-1 [26]. В дополнение к регуляции ангио-/лимфангиогенеза и воспаления, VEGFC, как и VEGFD, обладает фиброгенной активностью – непосредственно способствует пролиферации, миграции и синтезу коллагена фибробластами [16].

Обнаруженное нами высокое содержание в бляшках каротидного синуса VEGFR3 – основного рецептора VEGFC и VEGFD, сопоставимое с уровнем VEGFR2, указывало на его потенциально значимую роль в ангиогенезе и атерогенезе. VEGFR3 преимущественно экспрессируется в лимфатических ЭК, стимулируя их дифференцировку, пролиферацию, миграцию и выживаемость при связывании с VEGFC и VEGFD, тем самым стимулируя лимфангиогенез [16]. Маркер также отмечен в макрофагах [16]. Мы получили сходные данные по экспрессии рецептора – в атеросклеротической бляшке VEGFR3 главным образом выявлялся в макрофагах, значительно реже в ГМК и лишь в единичных ЭК, которые также экспрессировали CD34 (сосудистые ЭК). При этом экспрессия VEGFR3, согласно полученным нами результатам, коррелировала с содержанием в бляшке VEGFR2 и VEGFA. О наличии модулирующей роли VEGFR3 в передаче сигнала VEGFA/VEGFR2, а также тесной связи VEGFR2 и VEGFR3 свидетельствовали результаты ряда ранее проведенных исследований [27, 28]. В частности, отмечено взаимодействие VEGFR2 и VEGFR3 по системе обратной связи – VEGFR2 стимулировал экспрессию VEGFR3, который затем подавлял экспрессию VEGFR2 [27]. VEGFA, VEGFC и VEGFD стимулировали образование гетеродимеров VEGFR2/VEGFR3, которые активируют пролиферацию ЭК, способствуя новообразованию сосудов [28]. При этом гетеродимеры могут активировать ангиогенез даже при блокаде VEGFR2, вероятно, вследствие усиления тирозинкиназной активности VEGFR3 при связывании с VEGFR2 [27].

В наименьшей степени среди сосудистых эндотелиальных факторов роста в бляшках был представлен VEGFB, который выявлялся главным образом в макрофагах и единичных ГМК и ЭК. Тем не менее, экспрессия VEGFB значимо не отличалась от экспрессии VEGFC. VEGFB является гомологом VEGFA и реализует свое действие только через взаимодействие с VEGFR1 [16]. Он широко экспрессируется в различных типах клеток, включая ГМК сосудов и ЭК, и обладает слабой ангиогенной активностью [16]. Проангиогенный эффект VEGFB может быть связан с подавлением апоптоза/стимуляцией выживаемости клеток или с вытеснением VEGFA из комплекса с VEGFR1, что может усилить передачу сигнала VEGFA/VEGFR2 [29]. Наиболее значимая роль VEGFB в атерогенезе и неоваскуляризации бляшки может быть связана с недавно выявленными его антиатерогенными эффектами – сильным антиоксидантным действием и регуляцией метаболизма клеток [29]. Тем не менее, VEGFR1, необходимый для реализации эффекта VEGFB, выявлялся в бляшках в следовых количествах.

Помимо классических (семейство VEGF) был оценен уровень альтернативного ангиогенного фактора – FGF2, который является сильным активатором ангиогенеза [11]. Ранее проведенные исследования продемонстрировали, что FGF2 является сильным митогеном для различных клеток, включая ЭК [10]; стимулирует пролиферацию и структурную организацию ЭК в тубулярные структуры, а также рост, дифференцировку и выживание ассоциированных с кровеносными сосудами клеток [30]; оказывает антифиброзное действие [31]. При этом FGF2 регулирует ангиогенез опосредованно, в том числе за счет активации высвобождения других ангиогенных факторов, и относится к “непрямым” ангиогенным факторам [6, 10, 32].

Нами выявлена выраженная экспрессия FGF2 в исследованных бляшках каротидного синуса, которая по степени и характеру значимо не отличалась от экспрессии VEGFA и коррелировала с ней, а также с экспрессией VEGFR2 и VEGFR3. Полученные данные согласуются с результатами опубликованных работ, в которых указан синергетический эффект FGF2 и VEGFA, обусловливающий стимуляцию миграции ЭК, перицитов и ГМК [32], а также корреляция экспрессии VEGFA/VEGFR2 и FGF2/FGFR1 [6]. В ряде исследований также продемонстрирована сложная и тесная взаимосвязь между сигнальными путями FGF2 и VEGFA в ходе ангиогенеза. В частности, для поддержания экспрессии VEGFR2 необходима стимуляция ЭК FGF2 [10]; FGF2 регулирует сплайсинг VEGFR1 с активацией образования растворимых форм рецептора, которые поддерживают градиент VEGFA для навигации образующихся сосудов [10]; FGF2 стимулирует синтез VEGFA [32].

Исследования членов семейства FGF при атеросклерозе немногочисленны, а полученные результаты зачастую противоречивы, хотя исследователи сходятся во мнении относительно повышенного содержания и критической роли членов FGF в атеросклеротических бляшках [33]. К примеру, имеются данные о ключевой роли FGF2 в неоваскуляризации бляшки [3, 6] и об отсутствии экспрессии FGF2 в бляшках [3].

PDGF-B – наиболее хорошо охарактеризованный фактор роста для привлечения периваскулярных клеток и стабилизации новообразованной сосудистой сети [11, 30]. ЭК в составе развивающегося сосуда секретируют PDGF-B, который связывается с гепарансульфат-протеогликанами внеклеточного матрикса и поверхности клеток, тем самым создавая градиент, необходимый для навигации перицитов в направлении развивающегося сосуда [34], нарушение которого приводило к образованию высокопроницаемых сосудов. Также показано, что VEGFA стимулирует экспрессию рецептора PDGF, тем самым регулируя миграцию и пролиферацию фибробластов и ГМК, а также образование внеклеточного матрикса [35].

Описанное в литературе связывание PDGF-B, FGF2 и VEGFA с внеклеточным матриксом создает депо данных факторов роста в межклеточном веществе [34, 36], что может объяснить иммунореактивность волокнистого компонента бляшки к вышеуказанным факторам, обнаруженное в проведенном нами исследовании, и подчеркивает возможность резкого повышения ангиогенного сигнала при их высвобождении из депо под действием протеаз. Экспрессия PDGF-B описана в многочисленных клетках, включая ЭК, ГМК и макрофаги [37], что также было отмечено и нами. Дисфункция сигнального пути PDGF-B выявляется при широком спектре заболеваний, включая атеросклероз, при котором отмечено повышение экспрессии фактора [38]. Ряд авторов также указывает на сходный характер экспрессии PDGF-B и VEGFA [18], что также подтверждали результаты нашего исследования.

PDGF-B, как и FGF2, считается “непрямым” ангиогенным фактором [6]. Показано, что он может стимулировать экспрессию VEGFA и FGF2 [35], при этом на кроличьей модели атеросклероза недавно был продемонстрирован синергетический эффект PDGF-B и FGF2 в части привлечения перицитов, стабилизации новообразованной сосудистой сети и уменьшении площади сосудистой сети [11]. Несмотря на то, что FGF2 и PDGF-B считаются важными регуляторами ангиогенеза в бляшке, их точная роль в регуляции и координации этого сложного процесса остается во многом слабо изученной [1, 6]. В последние годы получены данные о том, что в бляшках на поздних стадиях развития атеросклероза была снижена экспрессия рецептора PDGF-B, несмотря на относительно высокий уровень экспрессии самого фактора [6]. Кроме того, описана возможность образования нефункциональных гетеродимеров VEGFR2/PDGFR-бета в перицитах под действием VEGFA [39]. Окисленные липопротеины низкой плотности при краткосрочной инкубации с ГМК индуцировали активацию PDGFR-бета, тогда как длительная инкубация приводила к подавлению фосфорилирования рецептора [6].

Мы оценивали экспрессию рецепторов только сосудистых эндотелиальных факторов роста, что ограничивает возможности интерпретации результатов активации сигнальных путей других факторов. При высоком уровне PDGF-В и FGF2 (с учетом их синергетического эффекта) мы зачастую наблюдали в бляшках многочисленные тонкостенные сосуды с нарушенной целостностью эндотелиальной выстилки без слоя перицитов и периваскулярными кровоизлияниями разной давности. В совокупности это свидетельствует о незрелой структуре новообразованных сосудов с повышением проницаемости их стенки, что может быть связано с нарушением передачи сигнала PDGF-B вследствие снижения экспрессии, стимуляции деградации его рецептора или подавления фосфорилирования рецептора под действием VEGFA/VEGFR2, липопротеинов низкой плотности и других возможных факторов на поздних стадиях развития атеросклероза.

TSP-1 считается сильным ингибитором ангиогенеза, действие которого может быть реализовано различными путями при атеросклерозе: подавление экспрессии VEGFA, снижение уровня липопротеинов низкой плотности, клиренс матриксных металлопротеиназ, индукция апоптоза ЭК, подавление их миграции и пролиферации [40]. Экспрессия TSP-1 выявляется в клетках различных типов, включая ЭК, макрофаги и ГМК [9], что подтверждалось в проведенном исследовании. TSP-1 модулирует клеточный ответ на факторы внешней среды, конкурентно связываясь с клеточными рецепторами, компонентами внеклеточного матрикса, протеолитическими ферментами и растворимыми факторами [36]. Данные по экспрессии и значимости TSP-1 при атеросклерозе и неоваскуляризации бляшки немногочисленны. Ряд авторов указывает на повышение экспрессии маркера в атеросклеротической бляшке [41], что может быть связано с его активацией в ответ на действие факторов роста (PDGF-B, FGF2) и гипоксии [9]. Тем не менее, содержание в бляшках TSP-1 по нашим данным было низким, а интенсивность экспрессии слабой. Значимость TSP-1 в ангиогенезе в бляшке неоднозначна, поскольку помимо антиангиогенного действия фактор также позиционируется как проатерогенный, стимулирующий миграцию и пролиферацию ГМК с формированием секреторного фенотипа, в особенности под влиянием глюкозы [41]. Неоднозначная роль TSP-1 в атерогенезе и неоваскуляризации бляшки, а также его тесная связь с ключевыми регуляторными сигнальными путями ангиогенеза при атеросклерозе свидетельствует о необходимости дополнительного изучения механизмов его действия в комплексе с другими ангиогенными факторами.

Нами также была оценена взаимосвязь различных ангиогенных факторов со структурными компонентами бляшки, однако выявить какую-либо зависимость (за исключением неоваскуляризации), в том числе с выраженностью воспалительной реакции (содержание CD68⁺ макрофагов) нам не удалось. Возможной причиной такого результата может быть небольшой объем выборки, в особенности малое количество стабильных бляшек. Кроме того, мы не выделяли различные подтипы макрофагов и не оценивали содержание в бляшке провоспалительных цитокинов, которые играют значимую роль в ангиогенезе.

Таким образом, в проведенном исследовании продемонстрирован резко выраженный проангиогенный профиль экспрессии различных регуляторных факторов ангиогенеза в атеросклеротических бляшках каротидного синуса на поздних стадиях развития атеросклероза со значимым преобладанием VEGFD иммунореактивности на фоне резкого дефицита антиангиогенного фактора TSP-1. Высокое содержание в бляшках VEGFA, VEGFR2/3, FGF2 и PDGF-B, а также относительно низкий уровень VEGFC/VEGFB и следовые количества VEGFR1 на фоне высокопроницаемой новообразованной сосудистой сети свидетельствует о резком смещении равновесия в сторону стимуляторов ангиогенеза и неполноценности механизма стабилизации новообразованной сосудистой сети.

С учетом сложной системы взаимодействия между различными ангиогенными факторами и их рецепторами, а также наличием многочисленных локальных модуляторов процесса при атеросклерозе, необходимо дальнейшее изучение регуляции неоваскуляризации атеросклеротических бляшек с обязательным комплексным анализом разнонаправленных звеньев регуляции ангиогенеза, в том числе на клеточных и животных моделях атеросклероза. В этой связи стоит обратить особое внимание на механизм действия VEGFD, гиперэкспрессия которого была впервые нами продемонстрирована в бляшках каротидного синуса наряду с выраженной экспрессией его рецепторов (VEGFR2/VEGFR3). Широкий спектр эффектов VEGFD, отмеченный при различных патологиях, указывает на его возможно значимую роль как в ангиогенезе, так и атерогенезе, что делает его многообещающей мишенью терапевтического воздействия при атеросклерозе.