Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 6, стр. 736-744

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на самцах крыс Спрег-Доули из ЦКП “Биоколлекция ИФ РАН” в возрасте 4 (n = 12, масса 380 ± 50 г) и 18 мес. (n = 11, масса 540 ± 80 г). Все процедуры, выполненные в исследовании с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и требованиям Комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН. До проведения эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище по 6 особей в клетках Т4 на стандартной лабораторной диете в условиях искусственного освещения (цикл: 12 ч свет/12 ч темнота).

При проведении эксперимента крысы наркотизировались золетилом (внутрибрюшинно, 20 мг/кг, Virbac, Франция). Среднее артериальное давление (АД), измеренное с помощью прибора для неинвазивного измерения АД (“Систола”, Netrobotics, Россия) в хвостовой артерии, у наркотизированных крыс в возрасте 4 мес. составляло 129 ± 7 мм рт. ст., в возрасте 18 мес. – 136 ± 5 мм рт. ст.

Скорость мозгового кровотока измерялась через высверленное в теменной области черепа отверстие (S ≈ 1 см²) ультразвуковым компьютеризированным допплерографом ММ-Д-К (Minimax Doppler v.1.7, УЗДП-009-02, Россия) с рабочей частотой датчика 25 МГц. Датчик устанавливался на область измерения через проводящий гель без сдавливания поверхности измерения. Глубина прохождения ультразвукового сигнала для датчика данной частоты составляет порядка 3–4 мм, что обеспечивало исследование кровотока в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс. Постановка датчика осуществлялась под углом не более 60 град., что соответствует наилучшему акустическому и визуальному допплеровскому сигналу. В основу метода допплерографии положена регистрация допплеровского сдвига частот, вызванного отражением ультразвукового сигнала от форменных элементов крови. Ультразвуковой допплерограф определяет направление движения и линейную скорость кровотока по срезу исследуемой ткани. Данные представляются на экране монитора в виде цветной допплерограммы. На основании полученной визуальной картины в режиме online можно анализировать все получаемые данные параметров кровотока и выбирать безартефактный фрагмент допплерограммы. По характерному звуковому сигналу и визуальному сигналу на мониторе прибора можно определить тип преобладающего кровотока. В наших исследованиях запись сигнала проводилась преимущественно с артериального участка сосудистой сети обоих полушарий головного мозга. Звуковой сигнал, получаемый с участка сосудистого русла преимущественно артериального наполнения, характеризуется пульсирующим тихим шумом, синхронизированным с фазами сердечного цикла; визуальный сигнал имеет в спектре систолические и диастолические пики.

Оценка состояния кровотока проводилась по данным спектрального анализа допплеровского сигнала. С помощью программного обеспечения допплерографа автоматически рассчитывались величины линейных скоростей кровотока (пиковой (Vps) и средней систолической (Vs), конечной (Vd) и средней диастолической (Vpd) и средней за сердечный цикл (Vm)). Также оценивались индексы кровотока: индекс пульсации (Гослинга), отражающий упруго-эластические свойства артерий (PI), индекс периферического сопротивления (Пурсело), отражающий состояние сопротивления кровотоку дистальнее места измерения (RI) и индекс Арбелли (STI), отражающий степень стеноза артерий [10, 11]:

PI = (Vps – Vd)/Vm, RI = (Vps – Vd)/Vps, STI = 0. 9(1 – Vd/Vs) × 100%.

Межполушарной асимметрии скоростей и индексов кровотока обнаружено не было.

Статистический анализ данных проводился с использованием пакета статистических программ Microsoft Excel 2019 и программы InStat 3.02 (GraphPad Software Inc., США). Проверка экспериментальных данных на нормальное распределение проводилась с использованием критерия Колмогорова–Смирнова. Сравнение средних данных независимых выборок при сравнении более 2 групп при нормальном характере распределения вариант в совокупности данных (выборке) проводилось при помощи дисперсионного анализа с последующим попарным сравнением групп согласно критерию Тьюки. При распределении вариант в выборке отличном от нормального при сравнении 2 групп использовался U-критерий Манна–Уитни. Если исследование на нормальность показывало его отсутствие хотя бы для одной выборки, статистический анализ полученных данных производился с использованием непараметрических методов. Данные в табл. 1 и на графиках представлены как медиана [25-й процентиль; 75-й процентиль]. Статистически значимыми считали различия при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У 18-месячных крыс по сравнению с более молодыми животными было отмечено увеличение пиковых скоростей кровотока: систолической (в среднем на 33.81%, p = 0.01, U = 700, критерий Манна–Уитни) и конечной диастолической (в среднем в 2 раза, p = 0.02, U = 532, критерий Манна–Уитни, табл. 1). Средняя за сердечный цикл скорость кровотока также была увеличена (в среднем на 70.72%, p = 0.02, U = 707, критерий Манна–Уитни, табл. 1).

Анализ скоростных параметров кровотока в различных участках полушарий головного мозга показал, что возрастные изменения наблюдаются только в лобной и теменной области полушарий. При старении в лобной области увеличивается пиковая систолическая (до 43.53 [21.89; 54.83] см/с по сравнению с 30.19 [19.34; 39.94] см/с у 4-месячных крыс), средняя за сердечный цикл (в среднем в 2 раза, p = 0.05, U = 612, критерий Манна–Уитни) и конечная диастолическая (до 2.67 [1.18; 5.66] см/с по сравнению с 1.61 [0.69; 2.62] см/с у крыс в возрасте 4 мес.) скорости кровотока (рис. 1). Показатели средней систолической скорости кровотока снижаются (0.53 [0.38; 0.98] см/с у крыс в возрасте 4 мес.; 0.45 [0.33; 0.61] см/с у крыс в возрасте 18 мес.) (рис. 1).

Рис. 1.

Показатели линейных скоростей кровотока в различных участках полушарий головного мозга: лобном (frontal), теменном (parietal) и затылочном (occipital). Темная заливка – крысы в возрасте 4 мес., белая заливка – крысы в возрасте 18 мес. Верхняя и нижняя граница каждого прямоугольника – первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили) соответственно, поперечная линия внутри – медиана (50-й процентиль), крестик внутри – среднее арифметическое, концы отрезков 10-й и 90-й процентили, точки – выбросы. Различия значимы по сравнению с соответствующими значениями у крыс в возрасте 4 мес. (*p < 0.05, **p < 0.01, U – критерий Манна–Уитни).

В теменной области полушарий головного мозга у животных в возрасте 18 мес. по сравнению с более молодыми крысами увеличиваются показатели пиковой систолической (в среднем на 25%, p = 0.03, U = 792, критерий Манна–Уитни) и средней за сердечный цикл (в среднем на 21.54%, p = 0.02, U = 1341, критерий Манна–Уитни) скоростей кровотока (рис. 1).

Старение не влияет на показатели индекса резистентности. В то же время в лобной и теменной области полушарий головного мозга у крыс в возрасте 18 мес. отмечается снижение показателя индекса пульсации в среднем на 20% (рис. 2). Индекс STI, отражающий степень стеноза артерий, изменяется только в лобном регионе – увеличивается в среднем на 5.69% (p = 0.02, U = 612, критерий Манна–Уитни) (рис. 3).

Рис. 2.

Показатели пульсационного индекса в различных участках полушарий головного мозга: лобном (frontal), теменном (parietal) и затылочном (occipital). Темная заливка – крысы в возрасте 4 мес., белая заливка – крысы в возрасте 18 мес. Различия значимы по сравнению с соответствующими значениями у крыс в возрасте 4 мес. (*p < 0.05, **p < 0.01 U – критерий Манна–Уитни). Остальные обозначения как на рис. 1.

Рис. 3.

Показатели индекса STI в различных участках полушарий головного мозга: лобном (frontal), теменном (parietal) и затылочном (occipital). Темная заливка – крысы в возрасте 4 мес., белая заливка – крысы в возрасте 18 мес. Различия значимы по сравнению с соответствующими значениями у крыс в возрасте 4 мес. (*p < 0.05, U – критерий Манна–Уитни). Остальные обозначения как на рис. 1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследование показало, что старение сопровождается изменением параметров кровотока в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс. У 18-месячных крыс по сравнению с более молодыми животными отмечается увеличение пиковых и средней за сердечный цикл скоростей кровотока. Изменения церебрального кровотока при старении во многом связывают с возрастными нарушениями скорости метаболизма и атрофией головного мозга [8]. Установлено, что возрастная атрофия имеет региональную изменчивость и более заметна в лобных, височных и теменных областях [12, 13]. В нашем исследовании у крыс в возрасте 18 мес. изменение скоростных параметров кровотока наблюдалось в лобной и теменной области полушарий головного мозга, в то время как в затылочном регионе достоверных изменений этих показателей по сравнению с аналогичными значениями у 4-месячных животных обнаружено не было. В лобной и теменной области было отмечено увеличение пиковой систолической и средней за сердечный цикл скорости кровотока. Это может указывать на развитие возрастных стенозирующих процессов, связанных со снижением тонуса, сужением и разрежением церебрального микроциркулярного русла [1, 3, 14, 15]. В лобной области полушарий также наблюдалось повышение конечной диастолической скорости кровотока (в среднем в 2 раза) и индекса STI, отражающего степень стеноза артерий, что может свидетельствовать о большей выраженности стеноза артерий в данном регионе по сравнению с другими участками полушарий головного мозга. Сужение просвета сосудов в сочетании с высокими пиковыми скоростями кровотока указывает на гиперперфузию [16]. Однако наши данные не соответствуют результатам других исследователей, полученных на людях и экспериментальных животных и свидетельствующих об отсутствии [6, 8, 9] или уменьшении мозгового кровотока [2, 5–7] при старении. Такие противоречия могут быть связаны с видовыми или регионарными различиями, возрастом и наличием сопутствующей патологии [8]. Нельзя не учитывать и того, что отличия в получаемых результатах могут быть обусловлены методическими особенностями. В наших экспериментах регистрировалась линейная скорость мозгового кровотока, тогда как авторы некоторых из цитируемых работ [2, 7, 8] оценивали объемную скорость кровотока. Исследование объемной скорости кровотока с одной стороны позволяет в большей степени проводить оценку коллатерального кровоснабжения перфузируемой зоны, но в то же время использование такого методического подхода может снизить чувствительность обнаружения изменений мозгового кровотока [7, 17]. Также возможно, что обнаруженная нами гиперперфузия лобных и затылочных областей полушарий головного мозга у 18-месячных крыс предшествует развитию последующих гипоперфузионных нарушений мозгового кровотока. Для сохранения нормальной функции мозга большое значение имеет поддержание адекватной церебральной перфузии через плотную микроваскулярную сеть [18–20]. В настоящее время появляется все больше доказательств того, что старение вызывает многогранные функциональные нарушения в микроциркуляции головного мозга. Согласно гипотезе капиллярной дисфункции, на ранних этапах старения для поддержания адекватной оксигенации мозга необходимо увеличение мозгового кровотока [21]. Но длительная гиперперфузия приводит к повреждению сосудов микроциркулярного русла [22, 23], нарушению нормальной регуляции церебральной перфузии артериолами и развитию гипоперфузии.

Максимальная систолическая скорость кровотока в определенной мере отражает эластичность стенок исследуемых сосудов и зависит от многих переменных (величины артериального давления, вязкости крови и др.). Конечная диастолическая скорость кровотока определяет состояние периферического сосудистого русла, но оба этих параметра отражают кровоток в конкретный период сердечного цикла, не давая информации об истинной скорости кровотока в сосуде за весь период сердечного цикла. Наиболее полное представление о движении частиц крови в сосуде дают величины не максимальных, а средних скоростей потока, которые являются более чувствительным параметром [24], и показатели индексов кровотока, позволяющие судить о величине сосудистого сопротивления [11, 25]. Согласно полученным нами результатам, у животных в возрасте 18 мес. по сравнению с более молодыми крысами в лобной области полушарий головного мозга снижается средняя систолическая скорость кровотока. Такие изменения могут указывать на активацию при старении коллатеральных путей кровотока в этом участке мозга, необходимую для поддержания адекватной перфузии [26]. Старение не влияет на показатели индекса резистентности, в то же время в лобной и теменной областях полушарий головного мозга у крыс в возрасте 18 мес. снижается показатель пульсационного индекса (в среднем на 20%). Наряду с увеличением конечной диастолической скорости кровотока снижение пульсационного индекса может косвенно свидетельствовать о снижении сосудистого сопротивления и тонуса сосудов [16, 26, 27]. В основе данных изменений, вероятно, лежит возрастное нарушение ауторегуляции церебральных сосудов [3].

Таким образом, установлено, что в 18-месячном возрасте у крыс отмечаются проявления нарушения мозговой гемодинамики. На фоне снижения уровня сопротивления мозговых сосудов, на что указывает увеличение конечной диастолической скорости кровотока и уменьшение индекса пульсации, наблюдается активация механизмов, направленных на поддержание адекватной перфузии ткани мозга. Увеличивается перфузия лобной и теменной областей полушарий головного мозга за счет повышения пиковых и средней за сердечный цикл скоростей кровотока, и активируются коллатеральные пути кровоснабжения мозга, о чем свидетельствует снижение средней систолической скорости кровотока в лобной области полушарий.