Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 9, стр. 1175-1187

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование сахарного диабета 1-го типа и схема эксперимента. Для экспериментов использовали половозрелых (3 мес.) самцов крыс Вистар, которые содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму. Все процедуры осуществляли в строгом соответствии с требованиями Комитета по биоэтике Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (протокол № 7-3/2020), “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” и European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC).

СД1 вызывали инъекцией стрептозотоцина (СТЗ) в дозе 45 мг/кг (в/б, в 0.1 M цитратном буфере, pH 4.5) самцам крыс. Контрольные животные того же возраста получали только буфер. Эффективность развития СД1 оценивали через 10 дней по уровню глюкозы в крови через 2 ч после потребления стандартной кормовой смеси, отбирая животных с уровнем глюкозы выше 15 мМ. Для определения уровня глюкозы использовали глюкометр и тест-полоски “One-Touch Select Ultra” (“LifeScan”, США). Через 30 дней после индукции СД1 крыс распределяли на группы (в каждой n = 5). Животные из групп “СД1+ТП03-1Д” и “СД1+ТП03-3Д” были обработаны с помощью ТП03, который синтезировали, как описано ранее [13]. ТП03 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и вводили крысам в дозе 15 мг/кг/сутки (в/б) в течение одного или трех дней соответственно. Другие группы обрабатывали следующим образом: “Контроль” и “СД1” – ДМСО (300 мкл, в/б), “СД1 + ХГЧ-1Д” – ХГЧ (“Московский эндокринный завод”, Россия) однократно, в дозе 10 МЕ/крысу (п/к), “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” – ТП03 (15 мг/кг/сутки, в/б, в течение трех дней) и ХГЧ (10 МЕ/крысу, п/к, однократно, на третий день эксперимента, через 30 мин после инъекции ТП03). Дозы препаратов ТП03 и ХГЧ были выбраны на основе результатов предварительных экспериментов. Доза ХГЧ была в два раза ниже той дозы (20 МЕ/крысу), при которой достигался 70%-ный стероидогенный эффект гонадотропина. Образцы плазмы получали из цельной крови, взятой из хвостовой вены крыс в первый (до и через 1, 3 и 5 ч после введения ТП03 или ДМСО) и в третий дни эксперимента (до введения препаратов, через 2 и 3.5 ч после введения ТП03 или ДМСО, или соответственно через 1.5 и 3 ч после введения ХГЧ). Образцы тканей семенников забирали после декапитации животных, которая осуществлялась под наркозом (хлоральгидрат, 400 мг/кг, в/б).

Морфологические показатели семенников крыс. Образцы тканей семенников фиксировали в течение 48 ч (4°С) в 4%-ном растворе параформальдегида, затем промывали 0.9%-ным натрий-фосфатным буфером (PBS) и погружали в PBS, содержащий 30% сахарозы. Далее ткани семенников замораживали на сухом льду с использованием среды Tissue-Tek (“Sacura Finetek Europe”, Нидерланды). Серии поперечных срезов (толщина 6 мкм) готовили с помощью криостата Leica CM-1520 (“Leica Biosystems”, Германия) и монтировали на стеклах SuperFrost/plus (“Menzel”, Германия). Срезы из разных экспериментальных групп помещали на одно и то же стекло, сушили на воздухе в течение ночи, а затем использовали для гистологического и иммуногистохимического анализа.

Для изучения морфологии семенных канальцев срезы семенников обрабатывали 50%-ным этанолом в течение 15 мин, промывали дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином Малера по стандартной методике. Затем срезы снова промывали дистиллированной водой и помещали под покровное стекло с глицерином. На каждом срезе было проанализировано 10 семенных канальцев.

Иммуноферментный и иммуногистохимический анализ. Уровень тестостерона в образцах плазмы крови крыс определяли с помощью иммуноферментного анализа (“ИФА-Тестостерон”, “Алкор-Био”, Россия). Свежеприготовленные срезы семенников промывали PBS, обрабатывали 0.6%-ной перекисью водорода в PBS в течение 30 мин для блокирования активности эндогенной пероксидазы, далее промывали PBS в течение 10 мин, а затем PBS, содержащим 0.1% Triton X-100 (PBST) в течение 20 мин. Затем срезы инкубировали в течение 1 ч в блокирующем растворе (5%-ная козья сыворотка в PBST). Инкубацию с первичными поликлональными кроличьими антителами к ЛГР (“LSBio”, США) проводили в 1%-ном блокирующем растворе в разведении 1 : 1000 в течение ночи (22°С). После промывки PBST (40 мин) срезы инкубировали в течение 1 ч в PBST с биотин-конъюгированными вторичными антикроличьими IgG-антителами козы (“VectorLabs”, Великобритания) в разведении 1 : 600, затем промывали PBS в течение 30 мин и инкубировали в растворе стрептавидин-пероксидазы (“Sigma-Aldrich”, США) в PBS в разведении 1 : 1000 в течение 1 ч. После промывки в PBS срезы обрабатывали 0.05%-ным диаминобензидином (“Sigma-Aldrich”, США) и 0.03%-ной перекисью водорода в PBS. Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой, после чего срезы помещали под покровное стекло с глицерином. Специфичность иммуногистохимической реакции проверяли с использованием отрицательного контроля (образцы без первичных или вторичных антител). Микрофотографии (по 20 для каждого животного) с разных уровней семенников получали с помощью микроскопа Carl Zeiss Imager A1, объектив ×20 (“Carl Zeiss”, Германия) с использованием одинаковых оптических характеристик для разных групп животных. Оптическую плотность количественно определяли с помощью программного обеспечения Image J NIH Analysis (“National Institutes of Health”, США). На каждой микрофотографии анализировали 5 участков с клетками и оценивали оптическую плотность ЛГР-иммунопозитивного материала, выраженную в арбитражных единицах.

Анализ генной экспрессии. Для анализа экспрессии генов из семенников выделяли тотальную РНК с помощью реагента “ExtractRNA” (“Евроген”, Россия), затем получали кДНК с помощью реакции обратной транскрипции (“MMLV RT Kit”, “Евроген”, Россия). ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью амплификатора “Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR System” (“Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.”, США) в смеси, содержащей кДНК, 0.4 мкМ прямого и обратного специфичных праймеров, реагент “qPCR-HS SYBR + Low ROX” (“Евроген”, Россия). В работе использовали ранее описанные последовательности комплементарных прямого и обратного праймеров для генов крысы Lhr, Star, Cyp11a1 и Cyp17a1, а также Actb, используемого в качестве референсного гена [12, 13].

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью критерия Крускала–Уоллиса с дальнейшим использованием апостериорного критерия Дана для попарного сравнения групп, используя пакет программ GraphPad Prism 8 (версия 8.0.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика диабетической модели и развитие андрогенной недостаточности. Крысы с СД1 демонстрировали сильно выраженную гипергликемию через 2 ч после потребления пищи (“СД1” – 21.2 ± 3.9 мМ, “Контроль” – 6.3 ± 0.4 мМ, p < 0.05) и снижение массы тела (“СД1” – 241 ± 20 г, ‘Контроль” – 327 ± 18 г, p < 0.05). У самцов крыс с СД1 был снижен базовый уровень тестостерона в крови – до 38.7–45.0% от такового в контроле, что свидетельствует о развитии андрогенной недостаточности (табл. 1, А). В семенниках диабетических крыс экспрессия генов Star, Cyp11a1 и Cyp17a1, кодирующих белок StAR и цитохромы P450scc и P450c17, была снижена соответственно до 30.0, 30.0 и 34.4% от ее уровня в контроле (рис. 1). При изучении относительного уровня мРНК гена Lhr, кодирующего рецептор ЛГ/ХГЧ в семенниках крыс с СД1, отличий выявлено не было. Однако при иммуногистохимическом анализе рецептора ЛГ/ХГЧ было показано снижение уровня белка для этого рецептора на 18% относительно контроля (рис. 2). Гистологический анализ тканей семенников СД1-крыс показал уменьшение высоты герминативного эпителия семенных канальцев на 15.5%, а количества сперматогониев и пахитеновых сперматоцитов на 10.1 и 11.1% соответственно (табл. 2). Таким образом, у самцов с экспериментальным СД1 наряду с метаболическими нарушениями наблюдались значительное ослабление стероидогенеза и сперматогенеза.

Рис. 1.

Экспрессия генов Lhr (a), Star (b), Cyp11a1 (c) и Cyp17a1 (d) в семенниках самцов крыс с СД1 при однократном введении им ТП03 или ХГЧ, а также в условиях трехдневной обработки ТП03, в том числе в сочетании с однократно вводимым ХГЧ. Ткани семенников были взяты через 3.5 ч после введения ТП03 (соответственно через 3 ч после введения ХГЧ) в последний день эксперимента. 1 – “Контроль” (ДМСО, в/б), 2 – “СД1” (ДМСО, в/б), 3 – “СД1 + ТП03-1Д”, однократное введение ТП03 (15 мг/кг/сутки, в/б), 4 – “СД1 + ХГЧ-1Д”, однократное введение ХГЧ (10 МЕ/крысу, п/к), 5 – “СД1 + ТП03-3Д”, введение ТП03 (15 мг/кг/сутки, в/б) в течение трех дней, 6 – “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” введение ТП03 (15 мг/кг/сутки, в/б) в течение трех дней и однократное введение ХГЧ (10 МЕ/крысу, п/к) на третий день эксперимента. Экспрессия генов нормирована относительно референсного гена (Actb). ^a – отличия от группы “Контроль”, ^b – от группы “СД1”, ^c – от группы “СД1+ТП03-3Д”, ^d – от группы “СД1 + ХГЧ-1Д” статистически значимы при p < 0.05, данные представлены как медиана, 25 и 75 процентиль (“бокс”), минимальное и максимальное значение (“усы”), n = 5.

Эффекты агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ на стероидогенез и сперматогенез СД1-крыс. Аллостерический агонист рецептора ЛГ/ХГЧ ТП03 через 3 ч после однократного введения стимулировал повышение уровня тестостерона у СД1-крыс на 347% (табл. 1, А). Однократная обработка ХГЧ приводила к повышению уровня тестостерона на 890% через 3 ч после введения. Трехдневная обработка крыс с помощью ТП03 восстанавливала уровень тестостерона до контрольных значений (табл. 1, Б). Введение ХГЧ крысам, которые получали ТП03 в течение трех дней, приводило к повышению уровня тестостерона на 1125% уже через 1.5 ч после инъекции гонадотропина. Через 3 ч после введения ХГЧ (3.5 ч после последней инъекции ТП03) уровень тестостерона в этой группе был на 1163% выше, чем в группе “СД1” (табл. 1, Б). При этом у животных в группах “СД1 + ХГЧ-1Д” и “СД1 + ТП03-3Д” уровень тестостерона хоть и имел тенденцию к повышению, но не достигал достоверных различий через 1.5 ч после введения ХГЧ и 2 ч после введения ТП03.

Изучение экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию тестикулярного стероидогенеза у диабетических крыс показало, что однократные инъекции ТП03 и ХГЧ повышали экспрессию генов Star на 42.4 и 42.7% и Cyp17a1 на 35.9 и 59.2% соответственно. Кроме того, в ответ на однократное введение ХГЧ экспрессия Cyp11a1 повышалась на 45.2% (рис. 1). Трехдневное введение ТП03 оказывало менее выраженный эффект на экспрессию генов Star, Cyp11a1 и Cyp17a1 по сравнению с однократной стимуляцией ТП03 или ХГЧ. Введение ХГЧ крысам с СД1, обработанных ТП03, усиливало эффект на экспрессию Cyp11a1 по сравнению с группой “СД1 + ТП03-3Д”, но при этом значение генной экспрессии были сопоставимы с таковым одного ХГЧ. Эффекты стимуляции ХГЧ на фоне предобработки ТП03 оказывали сопоставимое влияние на экспрессию гена Cyp17a1 в сравнении с группой, обработанной ТП03, но без ХГЧ (рис. 1).

Однократное введение ТП03 и ХГЧ СД1-крысам приводило к восстановлению некоторых морфологических характеристик семенных канальцев, сниженных при СД1, практически до их показателей в контроле. Высота герминативного эпителия увеличилась на 11 и 10% соответственно, а количество сперматогониев повышалось на 7.2 и 5% под действием агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ (табл. 2). Трехдневное введение ТП03 СД1-крысам повлияло лишь на высоту эпителия семенников, которая увеличилась на 10%. Предобработка крыс ТП03 и дальнейшая однократная стимуляция с помощью ХГЧ привели к значительному улучшению морфологических характеристик семенных канальцев у диабетических крыс, что выражалось в повышении количества пахитеновых сперматоцитов на 8% по сравнению с группой “СД1”. Количество сперматогониев в группе “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” увеличилось на 11% и было достоверно выше соответствующих значений в группах с трехдневным введением ТП03 и однократным введением ХГЧ. Наравне с этим, высота герминативного эпителия в семенных канальцах в группе с предобработкой ТП03 увеличилась на 11%, что было сопоставимо с подобными значениями в группах “СД1 + ХГЧ-1Д” и “СД1 + ТП03-3Д” (табл. 2).

Эффекты ТП03 и ХГЧ на экспрессию и клеточное содержание рецептора ЛГ/ХГЧ. При изучении эффектов ТП03 и ХГЧ на стероидогенез в клетках Лейдига, было также исследовано их влияние на экспрессию Lhr, гена, кодирующего рецептор ЛГ/ХГЧ. Было показано, что однократное введение ТП03 приводит к повышению генной экспрессии рецептора ЛГ/ХГЧ на 41.5%. При этом трехдневная обработка СД1-крыс ТП03 и их дальнейшая стимуляция с помощью ХГЧ не вызывали такого выраженного повышения экспрессии гена Lhr (рис. 1). При иммуногистохимическом исследовании тканей семенников было показано повышение уровня рецептора ЛГ/ХГЧ в группе “СД1 + ТП03-1Д” на 17% по сравнению с группой “СД1”. Содержание рецептора ЛГ/ХГЧ в группах “СД1 + ТП03-3Д” и “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” увеличивалось на 15 и 13% соответственно по сравнению с группой “СД1” (рис. 2).

Рис. 2.

Изменение оптической плотности иммунофлуоресценции рецептора ЛГ/ХГЧ в семенниках СД1-крыс в ходе предобработки ТП03 и однократной стимуляцией ХГЧ. 1 – “Контроль” (ДМСО, в/б), 2 – “СД1” (ДМСО, в/б), 3 – “СД1 + ТП03-1Д”, однократное введение ТП03 (15 мг/кг/сутки, в/б), 4 – “СД1 + ХГЧ-1Д”, однократное введение ХГЧ (10 МЕ/крысу, п/к), 5 – “СД1 + ТП03-3Д”, введение ТП03 (15 мг/кг/сутки, в/б) в течение трех дней, 6 – “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” введение ТП03 (15 мг/кг/сутки, в/б) в течение трех дней и однократное введение ХГЧ (10 МЕ/крысу, п/к) на третий день эксперимента. ^a – отличия от группы “Контроль”, ^b – от группы “СД1”, ^c – от группы “СД1 + ТП03-3Д”, ^d – от группы “СД1 + ХГЧ-1Д” статистически значимы при p < 0.05, данные представлены как медиана, 25 и 75 процентиль (“бокс”), минимальное и максимальное значение (“усы”), n = 50.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нарушение тестикулярного стероидогенеза и сперматогенеза являются частыми спутниками диабетической патологии, что подтверждено многочисленными исследованиями как на моделях животных, так и клиническими данными, полученными на человеке [1–3, 15–18]. Гипергликемия, инсулиновая резистентность, воспалительные процессы, нарушения процессинга и посттрансляционных модификаций белков при СД1 являются главными причинами дисфункций мужской репродуктивной системы [1]. Одним из основных показателей, характеризующих ослабление работы гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси при диабетической патологии является снижение уровня тестостерона в крови. В использованной нами модели стрептозотоцинового СД1 при оценке динамики суточного изменения уровня гормона снижение уровня тестостерона в крови крыс находилось в пределах 38.7–45.0%, что определяет релевантность использования данной модели для изучения андрогенного дефицита, вызванного СД (табл. 1, А). Снижение уровня тестостерона в крови является следствием нарушений процессов стероидогенеза, которые протекают преимущественно в клетках Лейдига семенников. Основными причинами андрогенного дефицита при экспериментальном СД являются гипергликемия, окислительный стресс и воспалительные процессы. Также одной из причин снижения уровня тестостерона в крови самцов крыс может быть токсический эффект стрептозотоцина, который он оказывает на клетки печени, вызывая снижение синтеза холестерина гепатоцитами. Одними из ключевых звеньев в системе стероидогенеза, чьи функции нарушаются при СД, являются транспорт холестерина в митохондрии и некоторые этапы синтеза гормона. Белок StAR, транспортирующий холестерин в митохондрии, представляет собой основную мишень при гормональной регуляции синтеза тестостерона, а цитохромы P450scc и P450c17 являются ключевыми ферментами, катализирующими реакции превращения холестерина в прегненолон и прогестерона в 17-гидроксипрогестерон и далее в андростендион соответственно [5]. Нами показано значительное снижение экспрессии генов Star, Cyp11a1 и Cyp17a1, кодирующих StAR и цитохромы P450scc и P450c17 в семенниках крыс с СД1 (рис. 1), что хорошо соотносится как с ранее полученными нашими данными [11, 12], так и с данными литературы о подобных нарушениях стероидогенеза в экспериментальных диабетических моделях [4, 5].

Ослабление стероидогенеза в семенниках при диабетической патологии может быть также связано с нарушением рецепции гонадотропных гормонов тканями семенников, вызванными нарушениями синтеза и процессинга рецептора ЛГ/ХГЧ. С помощью иммуногистохимического анализа нами показано уменьшение содержания рецептора ЛГ/ХГЧ в тканях семенников СД1-крыс (рис. 2), однако уровень мРНК Lhr у диабетических животных не отличался от контроля (рис. 1a), хотя в литературе есть данные, показывающие ослабление экспрессии Lhr при экспериментальных моделях СД [19]. Подобные различия в экспрессии генов и количестве “зрелого” белка в клетке могут быть связаны с нарушением процессинга и посттрансляционных модификаций белка вследствие усиления стресса эндоплазматического ретикулума при диабетической патологии, что может стимулировать компенсаторное повышение экспрессии мРНК рецептора [20].

Нарушение сперматогенеза при диабетической патологии связано с одной стороны с инсулиновой резистентностью, воспалительными процессами и окислительным стрессом, а с другой – с ослаблением тестикулярного стероидогенеза. Многочисленные работы показывают изменения целого ряда морфологических параметров семенников. Прежде всего это нарушение структуры семенных канальцев, уменьшение их диаметра и толщины эпителиального слоя [15–17]. Следствием этого становится уменьшение и структурная дезорганизация клеток, обеспечивающих начальные этапы сперматогенеза: сперматогониев и первичных сперматоцитов [17]. Нами были показаны значительные нарушения морфологии семенных канальцев у СД1-крыс, которые выражались в уменьшении таких морфометрических параметров как толщина герминативного эпителия, число сператогониев и пахитеновых сперматоцитов, что отражает ослабление сперматогенной системы у крыс при СД1 (табл. 2).

Использование препаратов гонадотропинов для коррекции андрогенной недостаточности наравне с тестостерон-заместительной терапией является одним из немногих способов поддержания нормального уровня тестостерона у мужчин с нарушениями фертильности [21, 22]. Однако наличие широкого списка противопоказаний у пациентов с диабетической патологией значительно ограничивает возможности их применения. Нами были разработаны и системно исследованы соединения на основе тиенопиримидиновых производных, которые обладали активностью агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ [10–13]. Связываясь с аллостерическим сайтом, локализованным в трансмембранном домене рецептора, они вызывают его активацию, при этом не конкурируя с гонадотропными гормонами, взаимодействующими с эктодоменом рецептора. Важной в практическом отношении особенностью наиболее активных соединений ТП03 и ТП04 была способность оказывать стабильный стероидогенный эффект не только при однократном введении, но и при обработке в течение 5–7 дней без существенного снижения чувствительности тканей семенников к действию эндогенного ЛГ. Это выражалось в сохранении высокого уровня экспрессии мРНК Lhr и количества рецепторов ЛГ/ХГЧ в клетках семенников при введении ТП03 и ТП04, в то время как хроническое введение препарата ХГЧ в дозировке 20 МЕ/крысу, оказывающей 70–80% от максимального эффекта препарата, приводило к значительному снижению как генной экспрессии, так и содержания рецептора в клетке, следствием чего было ослабление стимулирующего эффекта препарата на тестикулярный стероидогенез [11–13].

Мы предположили, что предобработка в течение трех дней одним из наиболее активных из разработанных нами аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ – ТП03 может привести к усилению эффекта хорионического гонадотропина, взятого в более низкой дозе 10 МЕ/крысу на тестикулярный стероидогенез у крыс, нарушенный вследствие диабетической патологии, но при этом не приведет к снижению чувствительности рецепторного аппарата клеток Лейдига к действию эндогенного ЛГ. Нами было показано, что предобработка СД1-крыс с помощью ТП03 в течение трех дней вызывает усиление эффекта на уровень тестостерона в крови однократной инъекции ХГЧ, взятого в сравнительно низкой дозе 10 МЕ/крысу (табл. 1, B). При этом, выраженный стимулирующий эффект наблюдается уже через 1.5 ч после введения ХГЧ и 2 ч после последней инъекции ТП03. Однако через 3 ч после введения ХГЧ различия в значениях уровня тестостерона в группах “СД1 + ХГЧ” и “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” становятся менее выраженными. Изучив генную экспрессию в семенниках СД1-крыс нами было показано, что влияние однократной и трехдневной обработки животных с помощью ТП03 имеет существенные отличия. Однократное введение ТП03 оказывает сопоставимое влияние на экспрессию генов Star и Cyp17a1 в сравнении с животными, обработанными однократной дозой ХГЧ (рис. 1). При трехдневной обработке с помощью ТП03 мы наблюдали менее выраженный эффект на экспрессию генов Star, кодирующий одноименный транспортный белок и Cyp17a1, катализирующего превращение предшественников в синтезе тестостерона прогестерона в 17-гидроксипрогестерон и далее в андростендион. Аналогичные значения уровня мРНК гена Cyp17a1 были получены в группе “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ”. Таким образом, в группах с трехдневной обработкой ТП03 не наблюдается повышения экспрессии гена Cyp17a1 в отличие от групп с однократным введением ТП03 или ХГЧ, что может быть следствием влияния петли отрицательной обратной связи, сдерживающей избыточное повышение уровня тестостерона, либо обусловлено разнонаправленной модуляцией ТП03 и ХГЧ транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов стероидогенеза. Также в группе “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” мы наблюдали усиление экспрессии гена Cyp11a1, кодирующего фермент, катализирующий первую реакцию в цепи превращений холестерина в тестостерон в сравнении с группой “СД1 + ТП03-3Д”, но не с группой “СД1 + ХГЧ-1Д” (рис. 1). Усиление экспрессии Cyp11a1 в группе “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” может отчасти объяснить усиление эффекта ХГЧ на фоне предобработки ТП03 на уровень тестостерона в крови СД1-крыс.

Ранее нами было показано, что один из наиболее многообещающих эффектов аллостерического агониста рецептора ЛГ/ХГЧ ТП03 – это отсутствие снижения генной экспрессии Lhr при однократной и многодневной обработке, следствием чего было сохранение чувствительности тканей семенников к эффектам эндогенного ЛГ. В данной работе нами показано увеличение как генной экспрессии Lhr (рис. 1a), так и уровня белка ЛГ/ХГЧ при однократном введении ТП03 (рис. 2). При трехдневной обработке ТП03 в группах “СД1 + ТП03-3Д” и “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” мы наблюдали увеличения только уровня белка рецептора ЛГ/ХГЧ, без изменения генной экспрессии. Повышение уровня рецептора ЛГ/ХГЧ, сниженном у крыс с СД1, может быть одной из основных причин усиления эффекта ХГЧ на фоне предобработки ТП03.

Далее мы исследовали влияние препаратов ТП03 и ХГЧ на морфологические параметры семенников, нарушенные вследствие диабетической патологии. Даже однократные инъекции ТП03 или ХГЧ вызывали улучшение морфологических характеристик: высоты герминативного эпителия, количества сперматогониев, но не влияли на число пахитеновых сперматоцитов. Трехдневная обработка ТП03 приводила к повышению высоты герменативного эпителия, тогда как другие характеристики хоть и имели тенденции к повышению, но не были статистически значимыми. При этом только в группе “СД1 + ТП03-3Д + ХГЧ” мы наблюдали полное восстановление количества пахитеновых сперматоцитов и сперматогониев до их уровня у контрольных животных, в то время как толщина герминативного эпителия семенных канальцев не превышала соответствующих значений у групп с однократным введением ХГЧ или трехдневным введением ТП03 (табл. 2).

Таким образом, нами впервые показано, что трехдневная предобработка крыс с андрогенным дефицитом, вызванным СД1, с помощью ТП03 приводит к усилению стимулирующего эффекта однократно введенного ХГЧ, взятого в относительно низкой дозе (10 МЕ/крысу), на уровень тестостерона в крови, и это сопровождается повышением экспрессии гена Cyp11a1 в семенниках. Это может быть обусловлено показанными нами повышением уровня белка рецептора ЛГ/ХГЧ в семенниках. Кроме того, предобработка СД1-крыс с помощью ТП03 усиливала восстанавливающие эффекты ХГЧ на морфологические параметры семенных канальцев в семенниках диабетических животных, повышая некоторые из них до контрольных значений. Использование аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ на основе тиенопиримидиновых производных может способствовать снижению дозировок препаратов гонадотропных гормонов, что имеет большое значение в клинической эндокринологии и во вспомогательных репродуктивных технологиях.