Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 12, стр. 1832-1846

ВВЕДЕНИЕ

Еще в конце ХХ века воспаление ассоциировалось в основном с инфекциями и травмами. Но данные последних десятилетий свидетельствуют о том, что воспаление сопровождает самые разнообразные патологические процессы (атеросклероз, диабет, ожирение и др.) и является врожденным защитным механизмом организма не только от инфекционного, но и от неинфекционного патологического воздействия [1]. В конечном итоге воспаление обеспечивает выживание во время развития патологического процесса и поддерживает гомеостаз тканей в различных неблагоприятных условиях. Воспалительный процесс представляет собой каскад клеточных и микрососудистых реакций, которые служат для удаления поврежденной и создания новой ткани. Одним из первых признаков воспаления является увеличение проницаемости кровеносных сосудов, позволяющее крупномолекулярным компонентам плазмы и дендритным клеткам выходить из кровотока и накапливаться в поврежденной ткани [2]. В очаг воспаления привлекаются различные иммунные клетки, которые индуцируют продукцию сигнальных молекул, сопровождающих воспаление: провоспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IL-6), хемокинов (CCL2 и CXCL8), газотрансмиттеров, липидных медиаторов, протеолитических ферментов и свободных радикалов [3]. Воспалительные макрофаги продуцируют в очаге воспаления большое количество активных форм кислорода и азота, которые являются эффективными средствами борьбы с патогенами, но также приводят к повреждению и гибели различных клеток в воспаленных тканях. Часть макрофагов также погибает в этой высокореактивной среде. В итоге в очаге воспаления накапливается множество различных сигнальных молекул и большое количество клеточного детрита, включающего фрагменты клеток ткани, макрофагов и бактериальных клеток [4]. Несмотря на повышенную проницаемость кровеносных сосудов в воспаленной ткани, крупные молекулы из очага воспаления поступают в лимфатические капилляры и удаляются из ткани лимфатическими сосудами [5], которые доставляют эти молекулы в дренирующие лимфатические узлы (ЛУ) [6].

Иммунные клетки и сигнальные молекулы, доставленные лимфой в ЛУ, взаимодействуют с различными клетками ЛУ: субкапсулярными макрофагами, эндотелиальными клетками лимфатических синусов и стромальными клетками. Результатом подобного взаимодействия является ремоделирование стромы и сосудистой сети ЛУ, расширение фибробластной ретикулярной сети и увеличение ЛУ в объеме до 20 раз [7]. Изменения, происходящие в строме и паренхиме ЛУ при воспалении, хорошо изучены [8]. В то же время данных об изменениях активной транспортной функции ЛУ при воспалении практически нет. Между тем одной из основополагающих функций ЛУ является их активная насосная функция [9]. В ряде исследований показано, что в физиологических условиях капсула ЛУ ритмично сокращается, что приводит к повышению давления в синусах ЛУ и выходу лимфы в выносящие ЛС [10, 11]. Активным элементом, обеспечивающим сокращения капсулы ЛУ, являются гладкомышечные клетки капсулы, плотно контактирующие друг с другом и функционирующие по принципу функционального синцития [12]. Установлено, что воспаление сопровождается экспрессией в капсуле ЛУ индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), циклооксигеназы-2 и цистатионин-γ-лиазы. Продуцируемые ими оксид азота (NO), простагландины и сероводород оказывают ингибирующее влияние на гладкомышечные клетки ЛУ, что приводит к угнетению фазных сокращений, снижению тонического напряжения и расслаблению капсулы [13, 14]. Механизмы ингибирующего действия этих сигнальных молекул на гладкомышечные клетки капсулы ЛУ изучены слабо. В то же время известно, что одним из механизмов ингибирования сократительной функции гладких мышц артерий в процессе развития воспалительного ответа является активация К⁺-каналов гладкомышечных клеток [15, 16]. Электрофизиологические и функциональные данные демонстрируют аномальную активацию K⁺-каналов в гладких мышцах кровеносных сосудов у животных с эндотоксическим шоком [17]. На мембране гладкомышечных клеток лимфатических сосудов также найдено несколько видов К⁺-каналов, в т.ч. BK_Ca- и K_ATP-каналы [18, 19]. Доказано их участие в регуляции транспортной функции лимфатических сосудов при воспалении [20]. Роль K⁺-каналов на мембране гладких мышц капсулы ЛУ до настоящего времени не изучена, соответственно, нет данных об их участии в регуляции сократительной функции гладких мышц ЛУ при воспалении. Целью данного исследования являлось изучение роли BK_Ca- и K_ATP-каналов гладкомышечных клеток в ингибировании сократительной функции ЛУ при моделировании сепсиса у крыс.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было проведено на самцах крыс Wistar в возрасте 20 недель и массой 320–350 г из биоколлекции Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Крыс до эксперимента содержали в условиях вивария в помещении с регулируемой температурой 20–22°С и световом режиме 12 ч свет/12 ч темнота при свободном доступе к стандартному корму и питьевой воде. Перед исследованием животных случайным образом разделили на три группы: две опытных по 12 крыс и контрольную (n = 10). У всех крыс перед экспериментом измеряли артериальное давление (АД) с помощью аппарата “Систола” (“Нейроботикс”, Россия). Абдоминальный сепсис вызывали посредством лигирования-пункции слепой кишки (cecal ligation puncture, CLP). Под анестезией золетилом (15 мг/кг, Vibrac, Франция) выбривали шерсть в нижней части живота и дезинфицировали кожу хлоргексидином (Южфарм, Россия). Выполняли срединный разрез брюшной стенки в нижней части живота длиной 2 см, слепую кишку извлекали из брюшной полости и размещали на стерильной салфетке. Затем перевязывали слепую кишку шелковой лигатурой на расстоянии 3 см от дистального конца и прокалывали лигированную часть кишки насквозь иглой 20G. После этого кишку аккуратно массировали до появления кишечного содержимого на поверхности кишки. Затем слепую кишку погружали в брюшную полость и зашивали разрез брюшной стенки. В контрольной группе оперативное вмешательство проводили по аналогичной схеме, но извлеченную из брюшной полости кишку не лигировали и не прокалывали. По завершении операции каждой крысе подкожно вводили по 3 мл теплого физиологического раствора, и с целью обезболивания в раннем постоперационном периоде инфильтрировали область разреза 0.2%-ным раствором лидокаина (0.4 мл, Фармстандарт-Лексредства, Россия). Животных помещали в индивидуальные клетки с подогреваемым полом до полного восстановления от анестезии. Состояние крыс контролировали каждые 12 ч. Через 12 и 24 ч после CLP у крыс вновь измеряли АД.

Брыжеечные ЛУ забирали у крыс через 12 и 24 ч после операции CLP. Под общей анестезией золетилом вскрывали брюшную полость и извлекали 2–3 брыжеечных ЛУ, после чего животных выводили из эксперимента посредством обескровливания (разрез нижней полой вены). До исследования ЛУ хранили в холодильнике на льду в физиологическом солевом растворе (PSS). Перед исследованием у ЛУ удаляли основную массу перинодального жира и окружающую соединительную ткань. Размеры ЛУ определяли под микроскопом МССО (“ЛОМО”) с измерительным окуляром. К полюсам ЛУ фиксировали шелковые лигатуры. ЛУ помещали в камеру миографа, через которую постоянно протекал физиологический солевой раствор (PSS), содержащий (в мМ) 120.4 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 15.5 NaHCO₃, 11.5 глюкозы (все вещества химически чистые, производства “Химпром”) и 10 г/л очищенного бычьего сывороточного альбумина (Merck, Sigma-Aldrich). Раствор барботировали газовой смесью, состоящей из 95% О₂ и 5% СО₂. Температуру раствора поддерживали на уровне 38 ± 0.1°С, рН 7.40 ± 0.02; термометр Testo 103 (Testo SE & Co., Германия, pH-метр Hanna HI 83141 (HANNA Instruments, Германия). С помощью лигатур ЛУ прикрепляли к датчику силы FORT-10 (WPI, США) и микроманипулятору.

Сигнал от датчика подавали на вход усилителя INA333 (Texas Instruments Incorporated, США), далее – в сигма-дельта АЦП, встроенный в микроконтроллер STM32F373 (STMicroelectronics, Франция). Затем поток данных с частотой 50 Гц поступал на USB-порт компьютера. Полученные данные обрабатывали программой регистрации, разработанной в Институте экспериментальной медицины, которая обеспечивала непрерывную запись информации с датчика на протяжении всего эксперимента.

Помимо вышеуказанных химических веществ, в данном исследовании использовали следующие реактивы (все – производства Sigma Aldrich-Merck (Германия): 1400W (N-([3-(Aminomethyl)phenyl] methyl)ethanimidamide dihydrochloride), 20 мкМ; ODQ (1H-1,2,4 Oxadiazolo 4,3-a quinoxalin-1-one), 10 мкМ; пинацидил (Pinacidil monohydrate), 10 мкМ; глибенкламид (Glibenclamide), 10 мкМ; NS 1619 (1,3-Dihydro-1-[2-hydroxy-5-(trifluoromethyl)phenyl]-5-(trifluoromethyl)-2H-benzimidazol-2-one), 1 мкМ; тетраэтиламмоний хлорид, ТЭА (Tetramethyl-d12-ammonium chloride), 1–10 мМ.

Реактивы растворяли в PSS непосредственно перед каждым экспериментом. ODQ, NS 1619, пинацидил и глибенкламид предварительно растворяли в DMSO (Servicebio Technology, Китай) и перед экспериментом добавляли необходимое количество концентрата в физиологический раствор. DMSO в разведении 1 : 1000 не вызывал значимых изменений параметров сократительной активности ЛУ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили в программах MS Excel 2010 (Microsoft Corp., США) и InStat 3.1 (GraphPad Software, США). Нормальность распределения полученных данных определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка (M ± SE). Для сравнения данных использовали t-критерий Стьюдента для непарных выборок. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В процессе исследования через 12 и 24 ч после операции у всех CLP-крыс регистрировали признаки абдоминального сепсиса: учащенное поверхностное дыхание, пилоэрекция, сгорбленность или съеживание в углу клетки, отказ от пищи. Наблюдалось значительное снижение систолического (САД) и диастолического (ДАД) давления (табл. 1). Через 24 ч одна крыса из группы CLP2 погибла.

При вскрытии брюшной полости крыс СLP обнаруживали кровянистую жидкость, гиперемию и отек кишечника. Брыжеечные ЛУ крыс СLP имели овальную форму, были темно-красного цвета, их размеры были в пределах: длина – 9–12 мм, ширина 6–7 мм. Различий в размерах ЛУ в группах CLP1 и CLP2 не было выявлено, при этом ЛУ крыс CLP2 выглядели более темными и отечными. ЛУ крыс контрольной группы были бледно-розового цвета, имели преимущественно овальную форму, их длина была около 6–7 мм, ширина – 3–4 мм.

После 30-минутного выдерживания в камере миографа с проточным PSS ЛУ подвергали натяжению, соответствующему трансмуральному давлению 4 см водн. ст. На протяжении последующих 1–2 мин наблюдали релаксацию ЛУ и установление стабильного уровня тонуса. Средний уровень тонуса ЛУ в контрольной группе составил 1.23 ± 0.14 мН, в группе CLP1 – 0.73 ± 0.08 мН, в группе CLP2 – 0.67 ± 0.06 мН. ЛУ крыс контрольной группы генерировали спонтанные фазные сокращения со средней частотой 0.82 ± 0.15 мин^–1 и амплитудой 0.38 ± 0.08 мН. В ЛУ крыс CLP фазных сокращений не было зарегистрировано.

Ранее нами было показано, что основной сигнальной молекулой, образующейся в ЛУ при воспалении и приводящей к релаксации капсулы ЛУ, является NO, продуцируемый iNOS [14]. В данном исследовании мы также оценивали величину NO-опосредованной релаксации ЛУ крыс CLP. 1400W практически не оказывал влияния на тонус ЛУ крыс контрольной группы, а в ЛУ групп CLP1 и CLP2 приводил к значительному повышению тонуса (рис. 1).

Рис. 1.

Тонус лимфатических узлов крыс при действии 1400W и ODQ. Тонус лимфатических узлов крыс контрольной группы в физиологическом растворе (CG) принят за 100%. CLP1 – лимфатические узлы крыс через 12 ч после операции, CLP2 – лимфатические узлы крыс через 24 ч после операции. Различия достоверны: * – p < 0.05, ^# – p < 0.01.

Сигнальный каскад NO → sGC → cGMP регулирует различные физиологические процессы, включая расслабление гладких мышц кровеносных сосудов [21]. Расслабляющий эффект эта сигнальная цепочка оказывает и на лимфатические сосуды и ЛУ [22]. Исходя из этого, мы провели серию экспериментов с ингибированием растворимой гуанилатциклазы. ODQ оказывал слабое влияние на тонус ЛУ крыс контрольной группы, но приводил к значительному повышению тонуса ЛУ крыс CLP1 и CLP2. Необходимо отметить, что в обеих группах крыс CLP повышение тонуса ЛУ под влиянием ODQ было достоверно меньше по сравнению с эффектом 1400W.

Конечным звеном сигнальной цепочки NO → sGC → cGMP → K_ATP-каналы являются K_ATP-каналы. Применение пинацидила приводило к релаксации ЛУ всех групп, при этом амплитуда релаксации ЛУ крыс CLP1и CLP2 была достоверно выше по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы (рис. 2). После удаления пинацидила и восстановления ЛУ в камеру миографа добавляли глибенкламид, являющийся блокатором К_ATP-каналов. Поскольку блокирование К_ATP-каналов глибенкламидом происходит медленно, для возникновения максимального блока требовалось до 15 мин [23]. Через 15 мин оценивали тонус ЛУ, который во всех группах ЛУ значительно повысился. Затем на фоне действия глибенкламида в раствор добавляли пинацидил. На фоне глибенкламида пинацидил вызывал слабую релаксацию ЛУ всех групп крыс.

Рис. 2.

Тонус лимфатических узлов крыс при действии активатора и блокатора К_ATP-каналов. Тонус лимфатических узлов крыс контрольной группы в физиологическом растворе (CG) принят за 100%. CLP1 – лимфатические узлы крыс через 12 ч после операции, CLP2 – лимфатические узлы крыс через 24 ч после операции. Pin – пинацидил, Glib – глибенкламид. Различия достоверны: * – p < 0.01.

Сепсис представляет собой довольно сложное состояние организма, в его развитие вовлекаются различные системы и различные сигнальные цепочки [24]. В частности, известно, что при септическом шоке состояние гипотонии поддерживается также за счет сверхактивации ВК_Са-каналов гладкомышечных клеток артерий [25]. Исходя из этих данных, с учетом того факта, что ВК_Са-каналы обнаружены в гладкомышечных клетках лимфатических сосудов, в следующей серии опытов мы исследовали возможное участие ВК_Са-каналов гладкомышечных клеток капсулы в сепсис-индуцированной релаксации ЛУ. В омывающий раствор добавляли ТЭА в нарастающих концентрациях (1, 3, 5, 10 мМ). Каждое очередное повышение концентрации ТЭА производили после установления стабильного уровня тонуса, вызванного предыдущей концентрацией ТЭА. ТЭА в изученных концентрациях приводил к повышению тонуса ЛУ, которое в ЛУ септических крыс было достоверно больше по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы. Максимальное повышение тонуса было зарегистрировано в ЛУ крыс CLP2.

После 30-минутного восстановления ЛУ исследовали их тонические реакции при добавлении в раствор NS 1619. Действие NS 1619 приводило к релаксации ЛУ, амплитуда релаксации ЛУ септических крыс была достоверно больше по сравнению с эффектом NS 1619 на ЛУ крыс контрольной группы. После завершения расслабления, вызванного NS 1619, в раствор, содержащий NS 1619, добавляли ТЭА в концентрации 3 мМ. ТЭА в течение нескольких минут полностью нивелировал релаксирующий эффект NS 1619 и приводил к повышению тонуса ЛУ всех групп (рис. 3b).

Рис. 3.

Тонус лимфатических узлов крыс при действии блокатора и активатора ВК_Са-каналов. CG – лимфатические узлы крыс контрольной группы, CLP1 – лимфатические узлы крыс через 12 ч после операции, CLP2 – лимфатические узлы крыс через 24 ч после операции. (a) – зависимость тонуса лимфатических узлов крыс от концентрации ТЭА, (b) – тонус лимфатических узлов крыс при действии NS 1619 (1 мкМ) и тетраэтиламмония (TEA) (3 мМ). За 100% принимали исходную величину тонуса лимфатических узлов каждой группы в физиологическом растворе. Различия достоверны: * – p < 0.01.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сепсис является тяжелой формой воспалительного процесса, и его моделирование часто применяется в доклинической практике. Наиболее широко используемой клинической моделью сепсиса является лигирование и пункция слепой кишки, эта модель считается “золотым стандартом”, поскольку хорошо воссоздает гемодинамическую и метаболическую фазы сепсиса у человека [26]. Ремоделирование ЛУ обычно начинается с увеличения афферентного лимфатического притока и поступления в ЛУ активированных дендритных клеток и медиаторов воспаления. Вслед за этим происходит массивный приток иммунных клеток из системы кровообращения, а также пролиферация лимфоцитов. Затем к ремоделированию подключаются эндотелиальные и ретикулярные клетки стромального компартмента ЛУ [27]. Несмотря на то, что отдельные клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе ремоделирования ЛУ, раскрыты, некоторых деталей для полной картины этого сложного процесса явно не хватает. Капсула ЛУ является довольно жесткой и слабо растяжимой соединительнотканной структурой (по сравнению с паренхимой ЛУ), содержащей гладкомышечные клетки, и процессы, происходящие в капсуле при воспалении, важны для понимания механизмов регуляции потоков лимфы через ЛУ и формирования полного представления о процессе гипертрофии ЛУ. В нашем исследовании объем ЛУ крыс CLP через 24 ч после операции увеличивался в 4–5 раз.

В нескольких работах показано, что уже через 4–6 ч после индукции острого воспаления транспорт лимфы по лимфатическим сосудам нарушается, и основным эффектором ингибирования насосной функции лимфатических сосудов является NO [24, 28]. В нашей предыдущей работе при исследовании брыжеечных ЛУ быка, обработанных липополисахаридом, было установлено, что в воспаленных ЛУ экспрессируются различные ферменты, в т.ч. и те, которые продуцируют сигнальные молекулы, вызывающие релаксацию гладких мышц капсулы ЛУ – iNOS, цистатионин-γ-лиаза и циклооксигеназа 2 [14]. Позднее нами были получены примерно такие же данные при исследовании брыжеечных ЛУ крыс после лигирования-пункции слепой кишки [29]. Учитывая, что максимальный релаксирующий эффект на ЛУ был вызван NO, продуцируемым iNOS, в данном исследовании мы сконцентрировали внимание на механизмах действия NO на гладкомышечные клетки брыжеечных ЛУ крыс. Было подтверждено, что механические свойства ЛУ крыс CLP сильно изменяются по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы: после стандартного натяжения их тонус устанавливался на уровне 50–60% от соответствующего показателя ЛУ крыс контрольной группы, т.е. они становились более растяжимыми. С целью определения вклада NO в релаксацию ЛУ крыс CLP мы использовали высокоселективный ингибитор iNOS – 1400W, который значительно уменьшал сепсис-индуцированную релаксацию ЛУ крыс CLP (в среднем – на 30%). В данном исследовании мы не принимали во внимание NO, продуцируемый eNOS, поскольку iNOS образует NO, количество которого в десятки и сотни раз превышает количество этого газомедиатора, производимого eNOS. Также с учетом механизма действия 1400W в дальнейшем во всех заключениях в данной работе мы исходили из того, что в ЛУ септических крыс сигнальные цепочки активирует NO, продуцируемый iNOS. На основании данных наших экспериментов мы не можем идентифицировать клетки, экспрессирующие iNOS в ЛУ септических крыс. В этот процесс значительный вклад могут вносить иммунные клетки, поступившие при воспалении в ЛУ. В то же время на основании данных, полученных нами ранее при исследовании изолированных ЛПС-стимулированных полосок капсулы ЛУ [14], мы с достаточным основанием можем утверждать, что определенная часть iNOS экспрессируется клетками капсулы ЛУ. Применение ODQ приводило к значительному повышению тонуса ЛУ крыс CLP, при этом тоническое напряжение ЛУ крыс контрольной группы также достоверно повышалось, но в меньшей степени. Повышение тонуса ЛУ крыс контрольной группы при действии ODQ объясняется тем, что в физиологических условиях эндотелиоциты лимфатических сосудов и ЛУ непрерывно продуцируют небольшие количества NO, который активирует растворимую гуанилатциклазу (soluble guanylate cyclase, sGC) и таким образом способствует небольшому понижению тонуса [30–32]. ODQ блокирует стимулирующее действие NO на sGC, что приводит к повышению тонуса ЛУ. В ЛУ крыс CLP ODQ приводил к большему повышению тонуса ЛУ по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы, что, по нашему мнению, объясняется усиленной стимуляцией sGC, осуществляемой большим количеством NO, продуцируемым iNOS. Также значительное повышение тонуса ЛУ под влиянием ODQ можно объяснить сверхэкспрессией sGC в гладкомышечных клетках капсулы ЛУ, наблюдающейся при сепсисе, как, например, это было показано в ткани аорты и миокарде крыс [33].

Сравнение эффектов 1400W и ODQ на тонус ЛУ крыс CLP показывает, что 1400W оказывает достоверное большее влияние на сокращение гладкомышечных клеток капсулы ЛУ. Мы полагаем, что подобное различие эффектов ингибирования продукции NO и cGMP на тонус ЛУ объясняется сложными механизмами влияния NO на гладкомышечные клетки ЛУ. Известно, что NO в гладкомышечных клетках сосудов не только стимулирует sGC, но может влиять на клеточную активность независимо от активации sGC, например, стимулируя кальциевую АТФазу саркоплазматического ретикулума, тем самым снижая внутриклеточную концентрацию кальция и вызывая расслабление гладких мышц [34]. Мы предполагаем, что в гладкомышечных клетках ЛУ при сепсисе могут активироваться и другие NO-опосредованные сигнальные цепочки, следствием чего является снижение концентрации цитоплазматического Са²⁺ и расслабление гладкомышечных клеток.

Известно, что концентрация цитоплазматического Са²⁺ является основным фактором, определяющим степень активации сократительных белков в гладкомышечных клетках, она зависит в основном от притока Са²⁺ извне через потенциалзависимые Са²⁺-каналы. Их состояние определяется мембранным потенциалом, а последний – преимущественно градиентом концентрации К⁺, которая зависит от активности К⁺-каналов [35]. Все виды К⁺-каналов играют важную роль в поддержании мембранного потенциала в гладкомышечных клетках, а два из них: К_АТР-каналы и ВК_Са-каналы часто вовлекаются в различные патологические процессы, и их активация является основной причиной расслабления сосудистых гладкомышечных клеток и гипотонии при сепсисе [36].

Во многих публикациях показано, что К_АТР-каналы гладкомышечных клеток артерий являются одной из основных мишеней сепсиса, имеющей решающее значение для развития тяжелой гипотонии [36]. Литературы о К_АТР-каналах в лимфатических сосудах значительно меньше по сравнению с кровеносными сосудами, но почти вся она предполагает, что эти каналы фундаментально аналогичны каналам в гладких мышцах артерий и что их активация является негативным регулятором лимфатического транспорта [37]. Действие пинацидила на протяжении нескольких минут приводило к релаксации ЛУ крыс всех групп, при этом релаксация ЛУ крыс CLP была достоверно большей по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы.

Хотя до настоящего времени нет прямых доказательств наличия К_АТР-каналов в гладкомышечных клетках капсулы ЛУ, мы полагаем, что релаксация ЛУ крыс контрольной группы на применение пинацидила могла быть обусловлена лишь активацией К_АТР-каналов, поскольку пинацидил является достаточно селективным активатором К_АТР-каналов. Кроме того, лимфатические сосуды и ЛУ имеют общее происхождение [38], а К_АТР-каналы ранее были обнаружены в гладкомышечных клетках лимфатических сосудов [39], и их активация способствовала прекращению спонтанных фазных сокращений и расслаблению лимфатических сосудов [40]. Небольшая релаксация ЛУ крыс контрольной группы на пинацидил, по нашему мнению, объясняется тем, что К_АТР-каналы обычно имеют низкую активность в физиологических условиях, но активируются при патологии и, в частности, при сепсисе, что приводит к гиперполяризации и расслаблению гладкомышечных клеток [41]. Мы полагаем, что большая амплитуда релаксации ЛУ крыс CLP по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы была обусловлена сепсис-индуцированной сверхэкспрессией К_АТР-каналов в гладкомышечных клетках ЛУ. Ранее у морских свинок с TNBS-индуцированном илеитом в собирательных мезентериальных лимфатических сосудах, дренирующих подвздошную кишку, была выявлена выраженная экспрессия мРНК субъединиц, образующих К_АТР-каналы [41].

Эффекты применения глибенкламида подтверждают важность К_АТР-каналов в ЛУ в физиологических условиях и при сепсисе. Глибенкламид приводил к повышению тонуса ЛУ во всех группах крыс, при этом прирост тонуса в ЛУ крыс CLP был достоверно большим по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы. Затем в раствор, содержащий глибенкламид, мы добавляли пинацидил. Пинацидил на фоне глибенкламида не приводил к достоверной релаксации ЛУ, как это было в опытах без применения глибенкламида, т.е. активатор К_АТР-каналов оказался неспособен открыть К_АТР-каналы, заблокированные глибенкламидом. Таким образом, мы получили дополнительное подтверждение участия К_АТР-каналов в релаксации ЛУ как в физиологических условиях, так и при сепсисе. Наши данные не являются прямым доказательством сверхэкспрессии К_АТР-каналов в гладкомышечных клетках ЛУ при сепсисе, но на других объектах показано, что гипореактивность сосудов при сепсисе обусловлена не только увеличением количества открытых К_АТР-каналов, но и увеличением их числа на мембране гладкомышечных клеток за счет активации генов [42].

Второй вид калиевых каналов, роль которых в модуляции тонуса ЛУ мы изучали в данной работе – это Са²⁺-зависимые калиевые каналы большой проводимости (BK_Ca-каналы). BK_Ca-каналы экспрессируются на плазматической мембране различных возбудимых и невозбудимых клеток, включая нервные и гладкомышечные, где они являются связующим звеном между мембранным потенциалом и внутриклеточной концентрацией Са²⁺. Они участвуют во многих клеточных функциях, таких как генерация потенциала действия (реполяризация), высвобождение нейромедиаторов, модуляция тонуса гладкомышечных клеток сосудов и дыхательных путей [43, 44]. Известно также, что BK_Ca-каналы вовлекаются в различные патологические процессы, так, например, их активность значительно снижена в артериях при диабете 2-го типа [45] и артериальной гипертензии [46].

BK_Ca-каналы в физиологических условиях управляются мембранным потенциалом и концентрацией цитоплазматического Са²⁺, при этом на BK_Ca-каналы оказывают выраженное влияние различные эндогенные вазодилататоры, и, в частности, активность каналов артерий модулирует NO [47]. В экспериментах на животных установлено, что во время септического шока сверхактивируются каналы K_ATP и BK_Ca, что ведет к развитию тяжелой гипотонии [48]. Показано, что BK_Ca-каналы экспрессируются в гладкомышечных клетках лимфатических сосудов мышей [49]. Они также обнаружены в грудном протоке человека [50]. Данных о BK_Ca-каналах в гладких мышцах капсулы ЛУ в литературе нет.

В наших экспериментах на начальном этапе в качестве блокатора BK_Ca-каналов мы использовали ТЭА в концентрациях 1–10 мМ (рис 3а). Известно, что TЭA эффективно блокирует BK_Ca-каналы через внутреннюю или внешнюю сторону мембраны [51]. В концентрации 3 мМ ТЭА оказывал выраженный стимулирующий эффект на тонус ЛУ крыс всех групп. Такая концентрация ТЭА считается селективной для BK_Ca-каналов [52], поэтому в дальнейшем при исследовании BK_Ca-каналов ЛУ был использован ТЭА в этой концентрации. Действие ТЭА приводило к повышению тонуса ЛУ во всех исследуемых группах, при этом ЛУ септических крыс демонстрировали значительно больший прирост тонуса по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы. Также представляется интересным, что эффект ТЭА на ЛУ крыс группы CLP2 был более выраженным по сравнению с ЛУ крыс CLP1 (рис. 3).

В следующей серии экспериментов мы оценили влияние NS 1619 на тонус ЛУ. NS 1619 представляет собой селективный активатор BK_Ca-каналов [52] и широко применяется при исследовании функций гладких мышц [53]. Применение NS 1619 сопровождалось выраженной релаксацией ЛУ крыс всех групп. Расслабление ЛУ крыс CLP было более выраженным по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы, кроме того, релаксирующий эффект NS 1619 на ЛУ крыс группы CLP2 был достоверно большим по сравнению с ЛУ крыс CLP1(рис 3b). Применение ТЭА на фоне продолжающегося действия NS 1619 сопровождалось быстрым повышением тонического напряжения ЛУ всех групп, максимальное повышение тонуса было зарегистрировано в ЛУ крыс CLP2.

Данные, полученные в экспериментах с применением блокатора и активатора BK_Ca-каналов, позволяют сделать заключение о том, что в брыжеечных ЛУ крыс в физиологических условиях экспрессируются BK_Ca-каналы, которые оказывают влияние на сократительную функцию гладкомышечных клеток капсулы ЛУ. Их активация или блокирование сопровождаются достоверными изменениями тонуса ЛУ: релаксацией или повышением тонуса соответственно. Достоверные различия в амплитудах сокращения или релаксации ЛУ крыс контрольной группы и крыс групп CLP1 и CLP2 являются доказательством (хотя и косвенным) сверхэкспрессии BK_Ca-каналов в гладкомышечных клетках капсулы ЛУ при сепсисе. Необходимо отметить, что сверхэкспрессия BK_Ca-каналов в гладкомышечных клетках капсулы ЛУ септических крыс продолжала нарастать по мере прогрессирования сепсиса (реакции ЛУ крыс группы CLP2 на применение блокатора или активатора BK_Ca-каналов были более выраженными по сравнению с ЛУ крыс группы CLP1). Мы не изучали сигнальные механизмы, посредством которых NO активирует BK_Ca-каналы гладкомышечных клеток ЛУ, но из литературы известно, что NO может активировать BK_Ca-каналы посредством фосфорилирования каналов или прямым, независимым от циклического цГМФ способом [54].

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что при моделировании сепсиса у крыс воспаление сопровождается увеличением растяжимости капсулы ЛУ, что способствует их ремоделированию и гипертрофии. Одним из механизмов, приводящих к релаксации капсулы ЛУ, является экспрессия в ЛУ индуцибельной NO-синтазы, продуцирующей значительные количества оксида азота. Синтез NO приводит к расслаблению гладкомышечных клеток капсулы ЛУ посредством сверхэкспрессии и активации двух видов К⁺-каналов: К_АТР- и BK_Ca-каналов. Блокатор К_АТР-каналов глибенкламид приводил к повышению тонуса ЛУ во всех группах крыс, при этом прирост тонуса в ЛУ крыс CLP был достоверно большим по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы. Применение селективного блокатора BK_Ca-каналов NS 1619 сопровождалось выраженной релаксацией ЛУ крыс всех групп. Расслабление ЛУ крыс CLP было более выраженным по сравнению с ЛУ крыс контрольной группы. В перспективе К_АТР- и BK_Ca-каналы гладкомышечных клеток капсулы ЛУ могут явиться потенциальной мишенью для терапевтического воздействия с целью коррекции иммунного ответа посредством замедления или ускорения потока лимфы через ЛУ.