Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 12, стр. 1847-1855

ВВЕДЕНИЕ

Гистамин и гистаминовые рецепторы опосредуют различные важные функции в организме, включая участие в аллергических реакциях, контроль за эмоциями и регуляцию памяти и сна [1–6]. Поэтому различные гистаминовые рецепторы давно являются мишенью для лекарств и играют важную роль в здоровье человека, например, в иммунной регуляции и контроле анафилактического воспаления [7–9]. В различных тканях известно как минимум четыре рецептора к гистамину, однако большинство проявлений гиперчувствительности немедленного типа и аллергических реакций происходит при участии рецептора Н1 [10, 11]. С момента успешной разработки первого препарата в 1937 г. антигистаминные средства претерпели усовершенствования в виде препаратов первого и второго поколения [12].

Первые классические антагонисты H1-рецепторов представляют собой антигистаминные препараты первого поколения [13]. Они легко проникают через гематоэнцефалический барьер и связываются с гистаминовыми рецепторами в центральной нервной системе (ЦНС), вызывая галлюцинации, сонливость, беспокойство, бессонницу и другие побочные реакции [14]. H1-антигистаминные препараты второго поколения, по сравнению с первым поколением, редко проникают через гематоэнцефалический барьер и избирательно связываются с периферическими H1-рецепторами, вызывая слабые (либо не вызывая) побочные эффекты на ЦНС [15]. Тем не менее данные препараты могут стимулировать повышенный аппетит и приводить к увеличению веса, а также имеют некоторую степень кардиотоксичности [16]. В целом антигистаминные препараты обычно используются при состояниях, не угрожающих жизни, что создало необходимость тщательной проверки безопасности и постоянному совершенствованию данной категории препаратов. Тестирование антигистаминных препаратов в трансляционных исследованиях с использованием экспериментальных животных [17, 18] позволяет подтвердить эффективность уже существующих препаратов и улучшить разработку новых средств, действующих на Н1-рецепторы. Одним из удобных модельных организмов для таких исследований могут стать рыбы зебраданио (zebrafish, Danio rerio), широко использующиеся в нейробиологических и физиологических исследованиях.

Благодаря легко дифференцируемым поведенческим паттернам и возможности проведения экспериментов с большим количеством животных, зебраданио стали удобной платформой для исследований нейротропных лекарственных средств и препаратов-кандидатов [19]. Система гистаминергических нейронов в мозге зебраданио организована так же, как и у большинства других позвоночных животных, и сосредоточена в каудальном отделе гипоталамуса с проекциями почти во все отделы мозга. На сегодняшний момент у зебраданио идентифицировано три из четырех рецептора к гистамину (HRH1, HRH2 и HRH3), которые помимо головного мозга также экспрессируются в кишечнике, печени, селезенке, жабрах, сердце и глазах [20]. Цель настоящего исследования – оценить воздействие антигистаминных препаратов хлоропирамина, лоратадина и цетиризина в концентрациях 1, 5 и 10 мг/л на поведение рыб зебраданио.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполняли на 82 взрослых (возраст 3–5 мес.) короткоплавниковых рыбах данио дикого типа (соотношение самцов и самок ~50 : 50), которые были получены от коммерческого дистрибьютора (ООО “Комета”, Пермь, Россия) и содержались в помещении для водных животных в Уральском федеральном университете. Перед экспериментом животные адаптировались не менее 14 дней к лабораторным условиям и содержались в одном 40-литровом пластиковом аквариуме (высота 45 × 40 длина × 30 ширина, см). Аквариум был заполнен отфильтрованной системной водой с температурой 25°C, pH 6.8–7.2, уровнем аммиака <0.9 мг/л и уровнем нитратов <200 мг/л. Освещение (1000–1100 люкс) обеспечивалось потолочными люминесцентными лампами с 14/10-часовым циклом свет–темнота (включение 8:00) в соответствии с принятыми стандартами содержания и тестирования рыб данио [21]. Все животные, использованные в этом эксперименте, были экспериментально наивными и получали еду (Tetra GMBH, Оснабрюк, Германия) два раза в день.

Исследуемые антигистаминные препараты хлоропирамин (“Супрастин”, ЗАО “Фармацевтический завод ЭГИС”, Будапешт, Венгрия), лоратадин (“Лоратадин-Вертекс”, АО “ВЕРТЕКС”, Санкт-Петербург, Россия) и цетиризин (“Цетрин”, Д-р Редди’с Лабораторис Лтд., Индия), являясь безрецептурными препаратами, были получены из аптеки “Живика” в городе Екатеринбурге. В день эксперимента рыбы случайным образом были разделены на 10 групп: контроль (n = 8) и опытные группы с воздействием хлоропирамином, лоратадином и цетиризином в концентрациях 1, 5 и 10 мг/л (n = 8–10). Выбор концентраций веществ в эксперименте основан на рекомендациях по применению препаратов и их терапевтической дозе для человека. Каждая навеска исследуемых препаратов диспергировалась в 1 мл ДМСО и затем вводилась в экспозиционный аквариум емкостью 1 л, в который поочередно подсаживались особи зебраданио. Рыбы из контрольной группы также подсаживались в экспозиционный аквариум, куда добавлялся 1 мл ДМСО. По истечении 20 мин, которых согласно инструкции достаточно для всасывания и развития антигистаминного эффекта препарата, рыбы далее помещались в тестовые аквариумы и снимались на видеокамеру в течение 5 мин (рис. 1). После каждой съемки в тестовых аквариумах проводилась замены воды. Вода из экспозиционного аквариума с растворенным в ней препаратом также заменялась через каждые 4 рыбы [22].

Рис. 1.

Схема дизайна эксперимента и модель нового аквариума для тестирования на зебраданио.

Тест нового аквариума

Тест нового аквариума является широко известной методикой оценки поведения рыб, активно применяющийся в скрининге различных физиологически активных веществ [23, 24]. Аппарат представляет собой стеклянный аквариум (высота 20 × длина 15 × ширина 5, см), заполненный водой и разделенный горизонтальной маркерной линией снаружи на две равные зоны (рис. 1). Методика аналогична тесту “открытого поля” для грызунов, где животных помещают в новые, ранее незнакомые для них условия. Идея данного теста строится на тенденции зебраданио в первую минуту тестирования тратить 70–85% времени в нижней трети аквариума. Данное поведение чувствительно к широкому спектру препаратов (флуоксетин, диазепам, буспирон, циталопрам, этанол и др.), воздействующие на опиоидные, дофаминовые, серотониновые, холинергические и адренергические рецепторы и процессы ЦНС [25].

Данные видео-трекинга обрабатывались вручную с помощью программного обеспечения RealTimer (ООО “Открытая наука”, Красногорск, Россия), где оценивали частоту, общую продолжительность (с) и латентный период (с) выхода в верхнюю и нижнюю части аквариума, замирание (неподвижность >2 с), атаксию (потеря положения тела и/или координации движений – лежание на боку, плавание на боку, плавание штопором) и число эрратических (беспорядочных) движений в соответствии с описанием в поведенческом каталоге по зебраданио [26]. Видео также анализировалось с помощью программного обеспечения Etho-VisionXT17 (Noldus IT, Вагенинген, Нидерланды), где оценивалась двигательная активность рыб по общему пройденному расстоянию (м), средней скорости движения (м/с) и максимальному ускорению (м/с²).

Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего и проанализированы однофакторным дисперсионным анализом с предварительной проверкой выборки на нормальность распределения (критерий Шапиро–Уилка) и попарным сравнением апостериорным тестом Даннетта (табл. 1). Во всех анализах значимость была установлена на уровне p < 0.05.

Таблица 1.   

Статистические данные по эффектам антигистаминных препаратов на поведение взрослых зебраданио в тесте новый аквариум (cм. рис. 2)

Поведенческий паттерн	Данные статистического критерия	Уровень значимости
Число выходов в верхнюю часть аквариума	F = 6.56	p < 0.001
Длительность нахождения в верхней части аквариума	F = 8.81	p < 0.001
Время первого выхода в верхнюю часть аквариума	F = 6.17	p < 0.001
Число беспорядочных движений	F = 4.04	p < 0.001
Частота актов замираний	F = 2.27	p < 0.03
Длительность актов замираний	F = 32.00	p < 0.001
Пройденное расстояние	F = 14.97	p < 0.001
Средняя скорость	F = 14.90	p < 0.001
Максимальное ускорение	F = 1.93	p = 0.06
Частота актов атаксии	F = 11.17	p < 0.001
Длительность актов атаксии	F = 5.91	p < 0.001

Рис. 2.

Поведенческие эффекты антигистаминных препаратов на взрослых зебраданио в тесте новый аквариум (cм. Детали статистики в табл. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для частоты выхода наверх в тесте нового аквариума отмечен значимый эффект препарата (табл. 1), отмечается его уменьшение в группах c хлоропирамином в концентрации 5 и 10 мг/л и группах с лоратадином во всех концентрациях при сравнении с контролем (рис. 1). В группе с лоратадином также отмечается значимое уменьшение суммарной длительности выхода наверх в концентрации 10 мг/л и увеличение времени латентного периода выхода наверх в концентрации 1 и 10 мг/л при сравнении с контролем. Дополнительно в группе хлоропирамина в концентрации 5 мг/л наблюдается значимое увеличение суммарной длительности выхода наверх по сравнению с контролем. Таким образом, препараты хлоропирамин в концентрации 5 и 10 мг/л и лоратадин во всех трех концентрациях уменьшают показатель выхода наверх, а также повышают его латентный период первого выхода наверх, т.е. вызывают седацию и уменьшают их общую активность. При этом седация в группе с лоратадином стойко проявляется с первой концентрации в отличие от группы с хлопирамином, где эффект проявляется только при высоких дозах препарата (рис. 1).

При рассмотрении двигательной активности рыб отмечается значимое уменьшение показателя пройденного пути и средней скорости во всех опытных группах по сравнению с контролем, что также подтверждает наличие седации (табл. 1). На рис. 1 приведены частоты беспорядочных движений рыб, наблюдается их значимое увеличение в группе с хлоропирамином в концентрации 10 мг/л по сравнению с контролем, что свидетельствует о нарушениях обычных паттернов поведения у опытных зебраданио.

Анализ распределения замираний (рис. 1) показывает увеличение их частоты в группах с лоратадином в концентрациях 5 и 10 мг/л по сравнению с контролем, а также значимое увеличение суммарной длительности замираний в группе с лоратадином, но уже во всех трех концентрациях по сравнению с контрольной группой. Таким образом, лоратадин во всех трех концентрациях значимо увеличивает показатель замираний, что согласуется с эффектом седации.

Из-за наличия седации у тестируемых препаратов в работе также был произведен подсчет актов атаксии, который показал значимое увеличение частоты и суммарной длительности в группах с хлоропирамином и лоратадином в концентрации 10 мг/л по сравнению с контролем (рис. 1). Наличие атаксии в высоких дозах хлоропирамина и лоратадина может говорить о нарушении координации движений и острой неспецифической токсичности у зебраданио.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе исследования было выявлено, что хлоропирамин в концентрации 10 мг/л оказывает седативный эффект на поведение зебраданио в тесте нового аквариума и значимо снижает показатель выхода наверх, двигательную и исследовательскую активность рыб. В той же концентрации хлоропирамин вызывает нарушение координации движений, что характерно для всех антигистаминных препаратов первого поколения и сопоставляется с результатами на грызунах и клиническими испытаниями на человеке [14, 27, 28]. При этом антигистаминный препарат второго поколения лоратадин также оказал седативный эффект на поведение зебраданио, но помимо уменьшения показателя выхода наверх и двигательной активности, препарат еще увеличивал частоту и длительность замираний. Более того, седативный эффект лоратадина проявляется уже с первой рассматриваемой концентрации в 1 мг/л, а в концентрации 10 мг/л, как и хлоропирамин, вызывает атаксию. Согласно данным литературы, лоратадин не оказывает серьезного влияния на ЦНС, тем не менее допускается появление сонливости и седации у некоторых пациентов и детей уже в терапевтических дозах препарата, что мы и можем наблюдать у рыб зебраданио [15].

Наконец, антигистаминный препаратов цетиризин не оказал значимого влияния на поведение рыб кроме снижения двигательной активности, что согласуется с результатами клинических испытаний [15, 29] и делает его наиболее оптимальным и безопасным антигистаминным препаратом в нашем исследовании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на высокую степень безопасности и многочисленные клинические испытания антигистаминных препаратов, их дальнейшее изучение и тестирование на новых модельных организмах может дать новые представления об эффективности и побочных реакциях на ЦНС. Рассматриваемые антигистаминные препараты, за исключением цетеризина, вызвали у зебраданио выраженный нейротропный побочный эффект, что согласуется с клиническими результатами испытаний на человеке и результатами испытаний на других животных моделях (в частности, рекомендуемыми терапевтическими дозировками для взрослых у хлоропирамина является 25 мг, лоратадина и цетиризина 10 мг). Таким образом, зебраданио ввиду своей более высокой фармакологической чувствительности выявили возможное наличие неблагоприятных эффектов у лоратадина уже в низкой, не терапевтической дозировке, что ранее не наблюдалось в других экспериментах. Данное исследование подтверждает необходимость введения многосторонних трансляционных доклинических испытаний со множеством видов животных, а также создает предпосылки для изучения более безопасных ангистаминных препаратов как находящихся сегодня на рынке, так и новых препаратов на их основе.