Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 12, стр. 1742-1762

ВВЕДЕНИЕ

Активные формы кислорода (АФК) – малые химически активные молекулы, образующиеся в клетке в процессе окислительно-восстановительных реакций. К АФК относят кислородные радикалы и пероксиды: обладающий большой реакционной способностью и коротким временем жизни супероксидный анион-радикал ${\text{O}}_{2}^{ - }$ и являющийся более стабильной нерадикальной молекулой пероксид водорода (H₂O₂) [1, 2]. Также к АФК относятся азотсодержащие соединения, такие как оксид азота (NO), диоксид азота (NO₂·) и пероксинитрит (ONOO^–). Однако эту группу веществ, как правило, рассматривают отдельно от “классических” АФК, выделяя в категорию активных форм азота [3]. АФК обладают широким спектром функций в различных органах и тканях, в том числе в сердечно-сосудистой системе.

На протяжении многих лет АФК рассматривали в качестве негативных регуляторов, оказывающих повреждающее влияние на функционирование клеток. Действительно, развитие многих заболеваний сердечно-сосудистой системы, таких как легочная и артериальная гипертензия, сахарный диабет и др., связано с повышенной продукцией АФК [4, 5]. В то же время исследования последних лет демонстрируют важную роль АФК в нормальном функционировании системы кровообращения. Так, показано, что АФК участвуют в регуляции тонуса кровеносных сосудов [2, 6]. Кроме того, в относительно низких концентрациях АФК влияют на процессы пролиферации, роста и дифференцировки эндотелиальных и гладкомышечных клеток (ГМК) [1, 7], которые активно протекают в развивающемся организме. Они регулируют процессы васкулогенеза и ангиогенеза [8, 9], а также дифференцировку ГМК в сократительный фенотип [10, 11], то есть задействованы в регуляции формирования и созревания сосудистой системы.

Следует отметить, что регуляция тонуса сосудов как легочного, так и системного кругов кровообращения в перинатальном и раннем постнатальном периодах во многом отличается от таковой у взрослых. Это продемонстрировано для целого ряда механизмов, реализующихся на уровне эндотелия и ГМК. Так, снижение сопротивления легочных сосудов после рождения, а также поддержание системного артериального давления на сравнительно низком уровне у новорожденных во многом связано со значимым сосудорасширяющим влиянием продуцируемого эндотелием оксида азота и калиевых каналов ГМК [12–16]. Наряду с этим, функциональный вклад некоторых проконстрикторных механизмов, например, сигнального пути Rho-киназы, в легочных и системных сосудах также выше в период раннего постнатального онтогенеза [17–19]. Вероятно, одновременное повышение активности как вазодилататорных, так и вазоконстрикторных механизмов создает широкий диапазон изменений сосудистого тонуса, что важно для адаптации новорожденного организма к новым условиям окружающей среды. Примечательно, что АФК прямо или опосредовано способны влиять на перечисленные выше сигнальные пути [2, 3]. В связи с этим участие АФК в регуляции тонуса сосудов у новорожденных может обладать рядом особенностей по сравнению со взрослым организмом. Таким образом, целью данного обзора является обобщение современных представлений о вазомоторной роли АФК в сосудистой системе в периоды перинатального и раннего постнатального онтогенеза.

1. ОСНОВНЫЕ ИСТОЧНИКИ И МИШЕНИ АФК В СОСУДАХ

Основными источниками АФК в клетках кровеносных сосудов являются электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) митохондрий, ферменты NADPH-оксидазы (NOX) и супероксиддисмутазы (SOD) [2, 3].

ЭТЦ митохондрий состоит из четырех комплексов, которые последовательно транспортируют электроны с молекул NADH на кислород с образованием воды. По мере переноса электронов происходит транспорт протонов из матрикса в межмембранное пространство, что создает движущую силу, способствующую образованию АТФ в комплексе V (АТФ-синтазе). Большинство электронов, поступающих в ЭТЦ, в конечном итоге восстанавливают кислород до воды в комплексе IV, однако небольшая часть электронов “уходит” из цепи в комплексе I или III с образованием ${\text{O}}_{2}^{ - }$ [20]. Образовавшийся ${\text{O}}_{2}^{ - }$, с одной стороны, способен выходить в цитоплазму через специальные анионные каналы [21]. С другой стороны, супероксиддисмутазы (SOD1 и SOD2), расположенные в митохондриях, катализируют дисмутацию ${\text{O}}_{2}^{ - }$ в H₂O₂, который может свободно диффундировать из органеллы, опосредуя клеточную передачу сигналов или, в высоких концентрациях, способствуя развитию окислительного стресса.

Еще один функционально важный источник АФК в сосудах – NADPH-оксидазный ферментативный комплекс. В целом описано 7 изоформ NADPH-оксидаз (NOX1-5 и DUOX1-2). В кровеносных сосудах могут экспрессироваться шесть изоформ NOX: NOX1, 2, 4 и 5 (у грызунов NOX5 не обнаружена) и DUOX1-2 [3, 22], при этом NOX1, 2 и 5 продуцируют ${\text{O}}_{2}^{ - }$, а NOX4 и DUOX1-2 – в основном H₂O₂. NOX, локализованные в плазматической мембране, продуцируют АФК преимущественно во внеклеточное пространство из-за ориентации каталитических субъединиц. Затем ${\text{O}}_{2}^{ - }$ попадает во внутриклеточное пространство через анионные каналы (например, хлорные каналы ClC-3 [23]), либо дисмутируется до H₂O₂, который может проникать в клетку путем пассивной диффузии через плазматическую мембрану или через аквапориновые каналы [24, 25]. Помимо плазматической мембраны, NOX могут быть локализованы во внутриклеточных органеллах: митохондриях, саркоплазматическом ретикулуме и ядре [2]. Примечательно, что локализация разных изоформ NOX в пределах плазматической мембраны может различаться. Так, в эндотелиальных клетках NOX1, 2 и 5, но не NOX4, локализованы в кавеолах, что может определять сигнальные функции АФК, продуцируемых той или иной изоформой NOX [26].

SOD дисмутируют ${\text{O}}_{2}^{ - }$ до менее агрессивной и более стабильной молекулы H₂O₂. Таким образом, с одной стороны, SOD можно отнести к антиоксидантным системам (устранение ${\text{O}}_{2}^{ - }$), а с другой стороны – к АФК-продуцирующим ферментам (синтез H₂O₂). Изоформы SOD отличаются металлами, входящими в состав активного центра фермента, а также локализацией в клетке. Так, в активном центре SOD1 и SOD3 находятся ионы цинка и меди, а SOD2 – марганца. При этом SOD1 является цитоплазматической изоформой, а также локализована в межмембранном пространстве митохондрий, SOD2 расположена в матриксе митохондрий, а SOD3 является внеклеточной изоформой фермента [27]. Все три изоформы SOD экспрессируются в клетках кровеносных сосудов [6, 27].

Эффекты влияния АФК на тонус сосудов во взрослом организме подробно рассмотрены в ранее опубликованных обзорах [1–3, 27]. В целом показано, что АФК способны вызывать как сокращение, так и расслабление артерий. Например, ${\text{O}}_{2}^{ - }$ способствовал сокращению легочных артерий [28, 29] и аорты крыс [30], артерий скелетной мускулатуры [6, 29], средней мозговой артерии [29], а также афферентных почечных артериол мышей [31]. В то же время бедренная артерия и артерии брыжейки крыс расслаблялись в ответ на увеличение продукции ${\text{O}}_{2}^{ - }$ [28, 29]. H₂O₂ обладал сократительным влиянием в аорте мышей [32], но вызывал расслабление афферентных почечных артериол мышей [31] и бедренной артерии крыс [33]. В коронарных артериях и артериях брыжейки крыс H₂O₂ способен как усиливать сокращение, так и ослаблять его [34, 35].

Разнонаправленное влияние АФК на тонус сосудов связывают с их влиянием на ряд мишеней в эндотелии и ГМК. Просократительное влияние АФК связано прежде всего со снижением продукции NO эндотелием. Дело в том, что ${\text{O}}_{2}^{ - }$ взаимодействует с NO c образованием пероксинитрита (ONOO^–), который способствует разобщению эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), окисляя тетрагидробиоптерин (BH₄), необходимый для ее димеризации [3]. Разобщенная eNOS производит меньше вазодилатирующего NO, но больше ${\text{O}}_{2}^{ - }$, в результате эндотелий-зависимое расслабление становится менее выраженным.

На уровне ГМК АФК могут способствовать увеличению внутриклеточной концентрации кальция, а следовательно, сокращению несколькими способами: активируя потенциал-управляемые кальциевые каналы L-типа [36, 37] или неселективные катионные каналы TRPC (transient receptor potential channels, type C) [32], увеличивая чувствительность IP3-рецепторов саркоплазматического ретикулума к IP3 (инозитол-3-фосфат) [38], а также снижая активность потенциал-управляемых калиевых каналов (K_v) [39]. Кроме того, АФК могут способствовать сокращению путем влияния на сигнальные пути, активность которых напрямую не зависит от внутриклеточной концентрации кальция: пути МАР-киназ [40, 41], Rho-киназы [28, 42], Src-киназы [43]. Вазорелаксирующее действие АФК может быть связано с их прямым активирующим влиянием на протеинкиназу G [31, 44, 45], которая, в свою очередь, фосфорилирует множество мишеней в ГМК [46], в том числе различные калиевые каналы, приводя в итоге к расслаблению.

Судя по всему, итоговый “знак” вазомоторного влияния АФК зависит от множества факторов и может различаться в зависимости от принадлежности сосуда к малому или большому кругу кровообращения, диаметра/порядка ветвления сосуда, концентрации АФК и компартмента их секреции в клетке. Как будет рассмотрено далее, “знак” влияния АФК на тонус сосудов также может зависеть от стадии развития организма.

2. РОЛЬ АФК В РАЗОБЩЕНИИ ЛЕГОЧНОГО И СИСТЕМНОГО КРУГОВ КРОВООБРАЩЕНИЯ ПОСЛЕ РОЖДЕНИЯ

В малом круге кровообращения сразу после рождения происходят драматические изменения в связи с переходом от плацентарного газообмена к легочному. Относительно гипоксическая среда плода способствует сужению легочных сосудов и соответственно повышению их сопротивления кровотоку [47–50]. Чтобы не перфузировать кровью неработающие легкие, а также снизить нагрузку на правый желудочек, в сердечно-сосудистой системе плода имеются два шунта, соединяющие круги кровообращения: овальное отверстие в межпредсердной перегородке и артериальный (боталлов) проток (АП), который обеспечивает сброс крови из легочной артерии в аорту. После рождения эти шунты закрываются и происходит разобщение двух кругов кровообращения. Доказано, что закрытие АП связано с повышением напряжения кислорода в крови и реализуется с участием АФК (рис. 1).

Рис. 1.

Схема, иллюстрирующая роль АФК (ROS) в сокращении артериального протока при нормоксии. ETC – электрон-транспортная цепь митохондрий, LTCC – потенциал-активируемые кальциевые каналы L-типа, nSMase – нейтральная сфингомиелиназа, NOX – NADPH-оксидаза, Rho-kinase – Rho-киназа. Острые стрелки – активирующее влияние, тупые стрелки – ингибирующее влияние.

В ранних исследованиях на препаратах АП кролика и человека было показано, что нормоксия (повышение содержания кислорода до 21%) вызывает сокращение, увеличение содержания H₂O₂, а также подавление тока K_v в ГМК [39, 51]. Ингибиторы ЭТЦ митохондрий устраняли рост продукции H₂O₂ в ответ на нормоксию [39]. По мнению авторов, нормоксия вызывает повышение продукции АФК митохондриями (преимущественно H₂O₂), что приводит к снижению активности каналов K_v, деполяризации мембраны ГМК и сокращению АП.

Кроме того, участником сократительной реакции АП млекопитающих на нормоксию может быть Rho-киназа – фермент, играющий ключевую роль в механизме кальциевой сенситизации ГМК [52]. В экспериментах на АП человека и кролика было показано, что сократительный ответ на нормоксию, связанный с генерацией H₂O₂ митохондриями, уменьшается в три раза после удаления Са²⁺ из наружного раствора или блокады ключевых механизмов его повышения в цитоплазме ГМК, а остаточный “Са²⁺-независимый” компонент реакции устраняется ингибитором Rho-киназы [53]. Увеличение содержания О₂ в среде приводило к повышению активности Rho-киназы (судя по приросту фосфорилирования ее основной мишени в ГМК – регуляторной субъединицы фосфатазы легких цепей миозина по ингибиторному сайту Thr696), а через час экспозиции – также к повышению содержания белка Rho-киназы в ткани АП.

Позже сходные эффекты АФК были выявлены в экспериментах на легочной части АП куриных эмбрионов [49]. В данном случае легочную часть АП выделяют отдельно, поскольку АП куриных эмбрионов обладает уникальным свойством: в отличие от млекопитающих он формируется в результате слияния двух сосудов с разным эмбриологическим происхождением, морфологией и реактивностью на кислород и АФК [54, 55]. Легочная часть АП состоит преимущественно из клеток-производных нервного гребня, имеет структуру артерии мышечного типа, сокращается на повышение парциального давления O₂, как и АП млекопитающих [54, 55]. Аортальная же часть имеет мезодермальное происхождение и морфологию артерии эластического типа, она расслабляется в ответ на O₂. Эта особенность позволяет оценивать специфичность реакций на различные стимулы “истинного” АП (легочной части) и “контрольного” сосуда (аортальной части).

В исследовании Cogolludo и соавт. было показано, что нормоксия вызывает сокращение легочной части АП зрелых куриных эмбрионов и расслабление аортальной части [49]. Примечательно, что сокращение легочной части значительно ослаблялось на фоне ингибиторов различных комплексов ЭТЦ митохондрий, потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа, а также Rho-киназы. Кроме того, нормоксия сопровождалась повышением содержания как ${\text{O}}_{2}^{ - }$, так и H₂O₂ в ткани только легочной части АП. Отсутствие изменений содержания H₂O₂ в ответ на нормоксию в аортальной части, вероятно, связано с высокой экспрессией в ней каталазы – фермента, катализирующего разложение H₂O₂ до H₂O. Таким образом, механизмы сокращения легочной части АП зрелых куриных эмбрионов при нормоксии схожи с таковыми в АП млекопитающих: увеличение синтеза H₂O₂, подавление активности каналов K_v, деполяризация и активация потенциал-управляемых кальциевых каналов L-типа, а также повышение чувствительности сократительного аппарата ГМК к Са²⁺ с участием Rho-киназы.

Еще один участник реакции сокращения АП на нормоксию – церамид, сфинголипид плазматической мембраны, образующийся в результате гидролиза сфингомиелина ферментами сфингомиелиназами. Примечательно, что АФК способны активировать сфингомиелиназы, и, следовательно, способствовать увеличению количества церамида в клетке [56]. Ингибирование активности нейтральной сфингомиелиназы или подавление синтеза этого фермента путем РНК-интерференции вызывало существенное снижение реакций сокращения АП эмбрионов курицы и человека на нормоксию [57]. В соответствии с этим нормоксия приводила к увеличению продукции церамида в ГМК легочной части АП эмбрионов курицы, а добавление экзогенных церамида и сфингомиелиназы воспроизводило эффекты нормоксии на АП, т.е. вызывало снижение амплитуды тока K_v и сокращение [57]. Мишенью церамида в ГМК АП являются NOX [58], их ингибирование значимо ослабляет сократительные реакции АП на нормоксию. Таким образом, авторы предполагают следующую цепочку событий: нормоксия вызывает рост продукции АФК митохондриями, АФК активируют сфингомиелиназу и образуется церамид, активирующий NOX, а продуцируемые NOX АФК подавляют активность каналов K_v, что в конечном счете ведет к сокращению (рис. 1).

Примечательно, что АП незрелых плодов овец (E103–105, продолжительность гестации около 145 дней) и кроликов (E26, продолжительность гестации около 30 дней) развивают менее выраженные сократительные реакции на повышение кислорода по сравнению со зрелыми плодами [59–61]. Легочная же часть АП незрелых куриных эмбрионов (E15) совсем не сокращалась при 21% O₂ [49]. В соответствии с этим нормоксия не вызывала изменений содержания АФК в стенке АП незрелых эмбрионов, что может быть связано с более высокой экспрессией SOD1 [49]. Наконец, было показано, что для ГМК легочной части АП незрелых эмбрионов характерно наличие нечувствительных к кислороду K_v токов низкой амплитуды, тогда как K_v токи в ГМК зрелых эмбрионов были чувствительными к кислороду и имели высокую амплитуду. Таким образом, механизм, обеспечивающий сокращение АП в ответ на нормоксию с участием АФК, формируется к концу внутриутробного развития.

Рассмотренные в этом разделе данные позволяют заключить, что АФК играют важную роль в физиологической реакции сокращения АП после рождения, механизмы их вазомоторного влияния обобщены на рис. 1.

3. РОЛЬ АФК В РЕГУЛЯЦИИ ТОНУСА АРТЕРИЙ МАЛОГО КРУГА КРОВООБРАЩЕНИЯ В ПЕРИОД РАННЕГО ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА

Важно отметить, что поддержание высокого сопротивления сосудов малого круга кровообращения плода в период внутриутробного развития во многом связано с действием АФК [57]. При этом механизмы вазоконстрикторного влияния АФК в легочных артериях плода сходны с таковыми в АП, но стимулом к их активации является не нормоксия, а гипоксия [57]. После рождения вслед за сокращением АП необходимо обеспечить снижение сопротивления малого круга кровообращения. Известно, что сосудорасширяющее влияние эндотелиального NO играет важную роль в снижении тонуса легочных артерий в ранний постнатальный период [15, 16]. В то же время переход от плацентарного дыхания к легочному сопровождается резким повышением оксигенации органов и тканей, что может приводить к избыточной продукции АФК [62–64] и, как следствие, к снижению биодоступности NO [65]. Такие события, по крайней мере отчасти, могут лежать в основе развития легочной гипертензии новорожденных – патологического состояния, являющегося одной из ведущих причин смертности среди младенцев [66]. С другой стороны, целый ряд работ демонстрирует важную роль АФК в нормальной регуляции сосудистого тонуса в раннем постнатальном периоде, в том числе, их участие в реализации эндотелий-зависимого расслабления легочных артерий. Как будет рассмотрено далее, этот механизм созревает постепенно, в связи с чем вазомоторная роль АФК оказывается неодинаковой сразу после рождения и на более поздних стадиях развития (рис. 2).

Рис. 2.

Схемы, иллюстрирующие роль АФК в регуляции тонуса легочных артерий у новорожденных (слева) и более зрелых (в возрасте до 4 нед., справа) животных. Слабая выраженность реакции эндотелий-зависимого расслабления в легочных артериях новорожденных животных связана с низкой биодоступностью NO вследствие высокой продукции АФК в эндотелии и ГМК и низкой экспрессией антиоксидантных систем (прежде всего, SOD). На более позднем этапе развития реакции эндотелий-зависимого расслабления становятся выраженными благодаря повышению экспрессии SOD, которые способствуют сохранности NO, а также синтезируют H₂O₂, вызывающий расслабление ГМК. AA (arachidonic acid) – арахидоновая кислота, Ach (acetylcholine) – ацетилхолин, 8-isoprostane – 8-изопростан, COX (cyclooxygenase) – циклооксигеназа, PGI₂ (prostaglandin I₂) – простациклин, PLA₂ (phospholipase A₂) – фосфолипаза А₂, EC (endothelial cell) – эндотелиальная клетка, SMC (smooth muscle cell) – ГМК, TP (thromboxane A₂ receptor) – рецептор тромбоксана А₂, IP (prostaglandin I₂ (prostacyclin) receptor) – рецептор простациклина. Острые стрелки – активирующее влияние, тупые стрелки – ингибирующее влияние.

3.1. ВЛИЯНИЕ АФК ОГРАНИЧИВАЕТ ЭНДОТЕЛИЙ-ЗАВИСИМОЕ РАССЛАБЛЕНИЕ АРТЕРИЙ МАЛОГО КРУГА КРОВООБРАЩЕНИЯ У НОВОРОЖДЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

В экспериментах на легочных артериях поросят, кроликов и овец показано, что степень выраженности реакций эндотелий-зависимого расслабления в первые часы после рождения существенно меньше, чем на более поздних стадиях развития [15, 16, 67]. Есть основания полагать, что это связано с низкой биодоступностью NO у новорожденных из-за высокого содержания АФК в стенке артерий.

Так, в работе Morecroft и MacLean ацетилхолин вызывал выраженное расслабление артерий четырехдневных и взрослых кроликов, которое полностью устранялось ингибитором NO-синтаз L-NAME [15]. Кроме того, у четырехдневных животных L-NAME вызывал развитие спонтанного тонуса. Таким образом, у четырехдневных и взрослых кроликов NO (1) является главным посредником эндотелий-зависимого расслабления легочных артерий и (2) проявляет выраженное антиконстрикторное влияние (препятствует развитию спонтанного тонуса). Однако у новорожденных кроликов (в первые 12 ч после рождения) L-NAME не влиял на тонус легочных артерий, а расслабление артерий в ответ на ацетилхолин развивалось только в присутствии SOD. Инкубация с SOD также приводила к ослаблению сокращения артерий новорожденных кроликов на агонист α₁‑адренорецепторов фенилэфрин, а удаление эндотелия устраняло данный эффект [15]. Авторы заключили, что вклад NO в эндотелий-зависимое расслабление, а также его антиконстрикторное влияние в ткани легочных артерий новорожденных кроликов снижены из-за накопления ${\text{O}}_{2}^{ - }$, и, следовательно, снижения биодоступности NO. Помимо этого, ONOO^–, образующийся в результате взаимодействия ${\text{O}}_{2}^{ - }$ с NO, сам по себе способен вызывать сокращение. На легочных артериях новорожденных крысят было показано, что ONOO^– может способствовать сокращению путем увеличения количества 8-изопростана, способного активировать рецепторы тромбоксана А₂, а также путем активации сигнального пути Rho-киназы [68] (рис. 2, слева).

Накопление ${\text{O}}_{2}^{ - }$ может происходить в результате сниженной экспрессии/активности антиоксидантных систем, в том числе SOD. Показано, что активность и количество белка SOD существенно ниже в легочной ткани новорожденных кроликов по сравнению со взрослыми [69]. Сходным образом экспрессия мРНК SOD1 и SOD2 в легочной ткани человека увеличивалась по мере взросления [70]. Кроме того, содержание белка всех трех изоформ SOD в легочной ткани взрослых мышей выше, чем у мышей в возрасте 7 дней [71]. Активность SOD в легочной ткани кроликов существенно растет от момента рождения уже к возрасту 3–4 дней [62]. Вместе с тем активность SOD в ткани легких и продукция ${\text{O}}_{2}^{ - }$ в легочных артериях были сопоставимыми у новорожденных и двухнедельных поросят [67]. Отсутствие постнатальных изменений этих показателей у поросят может быть связано с их большей зрелостью к моменту рождения по сравнению с другими упоминавшимися выше млекопитающими, то есть изменения экспрессии/активности SOD у них могут происходить на конечном этапе внутриутробного развития.

В ходе развития могут изменяться не только активность и экспрессия ферментов, но и их локализация в ткани. Парадоксально, но в легких плодов и новорожденных кроликов внеклеточная SOD (SOD3) локализуется преимущественно в эпителиальных клетках дыхательных путей и альвеол [69]. Спустя неделю жизни она обнаруживается как внутри, так и вне клеток, а в возрасте 1 месяца и старше содержание SOD3 внутри клеток становится существенно меньше, нежели во внеклеточном матриксе [69]. Если аналогичные изменения локализации SOD3 происходят и в ткани легочных сосудов, это может быть еще одним объяснением увеличения биодоступности NO от момента рождения к более поздним стадиям онтогенеза.

Такое предположение согласуется с результатами функциональных исследований. Несмотря на отсутствие явных возрастных изменений общей активности SOD у поросят [67], ингибитор Cu,Zn-SOD (т.е. SOD1 и SOD3) DETCA подавлял реакции расслабления на ацетилхолин у новорожденных поросят и не оказывал влияния на реакции артерий двухнедельных животных, то есть эти изоформы SOD вовлечены в реализацию эндотелий-зависимого расслабления легочных артерий новорожденных, но не двухнедельных поросят [67]. Важно отметить, что инкубация легочных артерий новорожденных поросят с проникающей в клетку формой SOD (PEG-SOD, конъюгат SOD с полиэтиленгликолем) устраняла влияние DETCA на эндотелий-зависимое расслабление, тогда как непроникающая в клетку форма SOD такого влияния не оказывала [67]. Судя по всему, эндотелий-зависимому расслаблению легочных артерий новорожденных поросят способствуют изоформы SOD, локализованные только внутри клетки, то есть поддержание биодоступности NO за счет дисмутации ${\text{O}}_{2}^{ - }$ в основном происходит во внутриклеточном, а не внеклеточном пространстве.

Анализ приведенных выше работ позволяет заключить, что новорожденный организм может быть особенно восприимчивым к окислительному стрессу из-за сниженной активности антиоксидантных систем, в частности, SOD (рис. 2, слева). Постепенное повышение экспрессии/активности SOD, а также изменение их локализации в ткани (переход из внутриклеточного компартмента во внеклеточную среду) являются важными механизмами увеличения вклада NO в регуляцию тонуса легочных артерий после рождения.

3.2. АФК УЧАСТВУЮТ В ЭНДОТЕЛИЙ-ЗАВИСИМОМ РАССЛАБЛЕНИИ АРТЕРИЙ МАЛОГО КРУГА КРОВООБРАЩЕНИЯ В ПЕРИОД РАННЕГО ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА

Результаты работ на легочных артериях более зрелых животных (до 4 нед. после рождения) демонстрируют, что АФК могут принимать непосредственное участие в эндотелий-зависимом расслаблении (рис. 2, справа).

Устранение АФК путем инкубации легочных артерий 1–2-недельных поросят с проницаемыми для мембраны SOD-миметиком (перевод ${\text{O}}_{2}^{ - }$ в H₂O₂) и каталазой (перевод H₂O₂ в H₂O и O₂) приводило к существенному ослаблению вазодилатации на ацетилхолин [72, 73]. Интересно, что апоцинин, который ингибирует NOX, а также может служить “ловушкой” нерадикальных окислителей, таких как H₂O₂ [74, 75], вызывал сходные изменения реакций на ацетилхолин. Эти данные говорят о том, что АФК способствуют эндотелий-зависимому расслаблению на ацетилхолин в легочных артериях 1–2-недельных поросят.

Следует отметить, что существенных изменений вклада АФК в регуляцию расслабления легочных артерий поросят в период с первой по вторую неделю жизни не происходит. Эффекты проникающего в клетку SOD-миметика, PEG-каталазы и апоцинина на ацетилхолин-вызванное расслабление были сопоставимы в артериях 5–6-дневных и 12–13-дневных поросят. В соответствии с этим содержание белка SOD1, SOD2 и SOD3 в легочных артериях 5–6-дневных поросят не отличалось от 12-дневных [72, 76]. Что касается экспрессии NOX, количество белка NOX1 в легочных артериях поросят по одним данным не изменяется от 5–6-дневного к 12-дневному возрасту [76], а по другим сведениям несколько снижается [72]. При этом общее содержание белка p67phox (регуляторная субъединица, активирующая NOX2) растет от 5–6-дневного к 12-дневному возрасту, а содержание p67phox в мембранной фракции не изменяется [72]. Таким образом, с 1-ю по 2-ю неделю жизни в легочных артериях поросят содержание SOD не изменяется, тогда как однозначный вывод об изменении экспрессии NOX сделать сложно.

Механизм участия АФК в эндотелий-зависимом расслаблении легочных артерий в период раннего постнатального онтогенеза может быть связан с функционированием eNOS [77]. Показано, что легочные артерии овец в возрасте 4 нед. расслабляются на ацетилхолин и на Са²⁺-ионофор А23187 (также способствует активации eNOS) значительно лучше, чем артерии плодов на поздней стадии внутриутробного развития (E136). В обеих группах животных реакции расслабления на A23187 устранялись в присутствии ингибитора NO-синтаз L-NAME, однако ингибитор растворимой гуанилатциклазы ODQ действовал лишь на артерии плодов, но не 4-недельных овец. Последнее указывает на то, что у 4-недельных овец активация eNOS приводит к расслаблению с участием механизма, отличного от синтеза NO. Действительно, в эндотелиальных клетках плодов А23187 вызывал преимущественно синтез NO, тогда как в клетках 4-недельных овец помимо NO в большом количестве продуцировались ${\text{O}}_{2}^{ - }$ и H₂O₂. PEG-SOD и каталаза не влияли на вызванное А23187 расслабление артерий плодов, в то время как у 4-недельных овец инкубация с PEG-SOD приводила к усилению, а инкубация с комбинацией PEG-SOD и каталазы – к ослаблению дилататорных реакций на A23187. Результаты данного эксперимента позволяют заключить, что релаксация артерий 4-недельных животных, но не плодов, на A23187 связана с влиянием продуцируемого эндотелием H₂O₂. Наконец, авторы продемонстрировали, что продукция АФК эндотелиальными клетками 4-недельных овец блокируется ингибитором NO-синтаз L-NAME, но не апоцинином (ингибитор NOX). Таким образом, в легочных артериях 4-недельных овец eNOS находится в разобщенном состоянии, что связано с низким содержанием BH₄, и продуцирует преимущественно АФК, которые способствуют расслаблению [77].

Основываясь на данных литературы, можно предложить следующий механизм релаксирующего влияния АФК на легочные артерии молодых животных. С одной стороны, известно, что вазодилататоры, зависимые от активности циклооксигеназы (ЦОГ), вносят весомый вклад в эндотелий-зависимое расслабление легочных артерий поросят при действии ацетилхолина [78]. С другой стороны, как было показано на изолированных ГМК аорты крысы, H₂O₂ может вызывать активацию фосфолипазы А₂ и высвобождение арахидоновой кислоты [79]. Поэтому неудивительно, что АФК, генерируемые экзогенной ксантиноксидазой, или же экзогенный H₂O₂ вызывали расслабление ГМК артерий поросят, причем эти реакции уменьшались под действием ингибитора ЦОГ индометацина [80]. Более того, как ксантиноксидаза, так и H₂O₂ стимулировали продукцию простациклина в этих артериях. Таким образом, есть основание полагать, что в легочных артериях поросят АФК вызывают расслабление, стимулируя выработку зависимых от ЦОГ вазодилататорных метаболитов арахидоновой кислоты.

Итак, совокупность приведенных экспериментальных работ демонстрирует, что у более зрелых животных АФК способны принимать непосредственное участие в эндотелий-зависимом расслаблении: наряду с NO, АФК (в первую очередь H₂O₂) могут вызывать дилатацию легочных сосудов, возможно, с участием ЦОГ (рис. 2, справа).

3.3. АФК, ПРОДУЦИРУЕМЫЕ ГМК, СНИЖАЮТ РЕАКТИВНОСТЬ ЛЕГОЧНЫХ АРТЕРИЙ НА ЭКЗОГЕННЫЙ NO

Как известно, АФК-продуцирующие ферменты экспрессируются не только в эндотелии, но и в ГМК [3]. Следовательно, модуляция эффектов эндотелиального NO под действием АФК может происходить и на уровне ГМК. Есть основания полагать, что эти процессы происходят по-разному у новорожденных и более зрелых животных.

Работа Perez-Vizcaino и соавт. была посвящена сравнению реакций легочных артерий новорожденных (в течение 18 ч после рождения) и 15–20-дневных поросят на экзогенный NO и определению роли АФК в этих реакциях [81]. Важно отметить, что все эксперименты были проведены на сосудах с удаленным эндотелием. Артерии новорожденных поросят расслаблялись на газообразный NO существенно хуже по сравнению с артериями более взрослых поросят. При этом расслабление на NO в обеих группах полностью устранялось ингибитором растворимой гуанилатциклазы ODQ, что говорит о запуске классического сигнального цГМФ-зависимого каскада в ГМК.

Исследователи выдвинули гипотезу о том, что ослабленные реакции артерий новорожденных поросят на NO связаны с большей активностью систем, генерирующих ${\text{O}}_{2}^{ - }$, или же с меньшей активностью антиоксидантных систем в гладкой мышце. Инкубация артерий как с непроникающей в клетку SOD, так и с проникающим в клетку SOD-миметиком приводила к усилению реакций расслабления на NO в обеих группах, что указывает на большую сохранность NO на фоне данных веществ, однако степень выраженности эффектов SOD/SOD-миметика была одинакова в артериях новорожденных и более взрослых животных [81]. Вещества, увеличивающие количество ${\text{O}}_{2}^{ - }$ (комплекс ксантиноксидазы с гипоксантином и ингибитор Cu,Zn-SOD DETCA), напротив, ослабляли реакции на NO в обеих группах, что указывает на разрушение NO под действием ${\text{O}}_{2}^{ - }$. При этом эффекты данных веществ также были сопоставимы в сосудах животных двух возрастных групп [81]. Результаты данного исследования позволяют заключить, что менее выраженная реакция расслабления гладкой мышцы легочных артерий на экзогенный NO у новорожденных животных не связана с влиянием SOD.

Вместе с тем оказалось, что у новорожденных, но не более взрослых животных, расслабление на NO усиливается на фоне ингибитора ЦОГ-1 [81]. Исходя из того, что ЦОГ-зависимые пути способны активировать синтез АФК [82, 83], можно предположить, что сниженная реактивность артерий новорожденных поросят на NO связана с повышенной продукцией АФК как побочных продуктов более активной у них гладкомышечной ЦОГ-1 (рис. 2, слева).

Кроме того, показаны возрастные различия в эффектах NOX: ингибитор NOX DPI в большей степени усиливал расслабление артерий на NO в группе 15–20-дневных поросят по сравнению с новорожденными [81]. Хотя это и не объясняет описанные выше возрастные особенности реактивности сосудов на NO [81], но указывает на повышение вклада NOX, локализованных в ГМК, в регуляцию тонуса легочных артерий в ходе постнатального онтогенеза.

Интересно, что экзогенный NO из разных источников инактивируется АФК неодинаково. Показано, что газообразный NO в гораздо большей степени инактивируется ${\text{O}}_{2}^{ - }$, нежели NO, высвобождаемый уже в ткани из NO-доноров SNP или SNAP [84]. Авторы предполагают, что NO, источником которого являются SNP и SNAP, образуется в компартментах клетки, отличных от компартмента образования супероксида. Вероятно, с этим связано отсутствие различий в расслаблении легочных артерий новорожденных и 15–20-дневных поросят на SNP [81], а также отсутствие эффектов SOD, тирона (“ловушки” ${\text{O}}_{2}^{ - }$), ингибиторов NOX и каталазы на SNAP-вызванное расслабление легочных артерий плодов овец и крыс [85–87].

Итак, результаты приведенных исследований демонстрируют, что АФК, продуцируемые ГМК, также способны снижать биодоступность NO, что особенно ярко проявляется в период новорожденности.

4. РОЛЬ АФК В РЕГУЛЯЦИИ ТОНУСА СИСТЕМНЫХ АРТЕРИЙ В ПЕРИНАТАЛЬНЫЙ И РАННИЙ ПОСТНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОДЫ ОНТОГЕНЕЗА

В целом функциональная роль АФК в артериях большого круга кровообращения, играющих ключевую роль в регуляции системного артериального давления, в перинатальный и ранний постнатальный периоды онтогенеза исследована в значительно меньшей степени по сравнению с легочными сосудами и АП. Однако точно известно, что АФК принимают участие в реализации важной реакции, защищающей головной мозг плода от острой гипоксии во время родов (т.н. brain-sparing effect) [88]. У плодов овец эта реакция формируется к концу периода гестации (начиная с Е110) и заключается в сужении периферических сосудов, которое необходимо для перераспределения крови в пользу головного мозга с целью снабжения его кислородом в условиях гипоксии. В ней задействованы как системные нейрогуморальные механизмы, запускаемые в основном хеморецепторами каротидных синусов, так и механизмы местной регуляции сосудистого тонуса, которые реализуются с участием АФК [88].

Известно, что у взрослых птиц и млекопитающих гипоксия вызывает сужение сосудов легких [89], но расширение сосудов системного кровообращения [90]. Однако, как будет рассмотрено далее, на позднем этапе внутриутробного развития периферические сосуды плода демонстрируют противоположные изменения тонуса – сужение в ответ на гипоксию. В экспериментах на беременных самках и плодах овец (срок гестации – около E130) c хронически имплантированными катетерами и датчиками кровотока дыхание матери гипоксической газовой смесью (6% O₂ в течение 30 мин, двукратное снижение оксигенации артериальной крови плода) приводило к повышению у плода артериального давления и сопротивления сосудистого бассейна бедренной артерии [91, 92]. Такое сужение сосудов плода значительно уменьшалось под действием аскорбиновой кислоты или ингибитора ксантиноксидазы, причем блокада синтеза NO (введение L-NAME) отменяла эффекты обоих антиоксидантов [91, 92].

Полученные результаты позволили авторам сформулировать положение о развитии у плода “оксидантного тонуса” периферических сосудов: гипоксия при прямом воздействии на сосуды приводит к генерации в них АФК, которые снижают биодоступность продуцируемого эндотелием NO. Следует также отметить, что введение аллопуринола (ингибитор ксантиноксидазы) сопровождалось снижением у плода артериального давления и в отсутствие гипоксии, что указывает на участие АФК в формировании базальных уровней периферического сопротивления и системного артериального давления в позднем пренатальном онтогенезе [92].

Артерии брыжейки куриных эмбрионов также сокращаются в ответ на гипоксию (наиболее выражено в период с E21 по P3), но механизмы этой реакции принципиально иные, чем у млекопитающих [93]. Гипоксическое сужение артерий куриных эмбрионов реализуется независимо от эндотелия (сохраняется после его удаления или в присутствии L-NAME) и включает два компонента: фазический, который наблюдается в течение начальных 10 мин и затем сменяется тоническим. При этом только фазический, но не тонический компонент выражено уменьшался под действием ингибиторов ЭТЦ митохондрий (ротенона и антимицина), а также ингибитора NOX VAS2870, но не изменялся в присутствии непроникающих в клетку форм SOD и каталазы [93]. Таким образом, в артериях брыжейки куриных эмбрионов АФК могут обеспечивать быстрое и транзиторное сокращение ГМК в ответ на гипоксию, реализуя свое влияние внутри клетки. По данным фармакологического анализа, потенциальными мишенями АФК в ГМК артерий куриных эмбрионов могут служить потенциал-управляемые кальциевые каналы L-типа, Rho-киназа и некоторые другие регуляторные молекулы [93].

Интересно, что бедренная артерия куриных эмбрионов (E19), напротив, расслабляется в ответ на гипоксию, однако, по мнению авторов, АФК не принимают значимого участия в развитии этой реакции [94]. В этой же работе было показано, что ингибиторы ЭТЦ митохондрий не оказывают влияния на реакции расслабления артерий, развивающиеся по различным механизмам: при действии ацетилхолина (эндотелий-зависимое расслабление), донора NO SNP и форсколина (активатор аденилатциклазы). Вместе с тем ингибиторы ЭТЦ митохондрий несколько уменьшали сократительные реакции артерий в ответ на норадреналин, что указывает на возможное просократительное влияние АФК в ГМК бедренной артерии куриных эмбрионов при активации внутриклеточных сигнальных путей агонистами мембранных рецепторов [94].

Следует отметить, что фетальный фенотип сосудистой реакции на гипоксию проявляется и в течение некоторого времени после рождения. Было показано, что изолированные артерии брыжейки 3-дневных поросят также сокращаются при снижении содержания O₂ в окружающей среде, тогда как в возрасте 35 дней сокращение сменяется расслаблением [95]. Как и у плодов овец, гипоксическое сужение артерий новорожденных поросят исчезает после блокады синтеза NO, а также после удаления эндотелия, то есть связано с инактивацией эндотелиального NO.

Не исключено, что вазомоторное влияние АФК может сохраняться и после третьего дня постнатального развития, особенно у млекопитающих, детеныши которых рождаются сравнительно незрелыми. Результаты работ на культурах ГМК, выделенных из системных артерий человека и лабораторных грызунов, демонстрируют важную роль АФК в формировании сократительного фенотипа ГМК [10, 11]. Следует отметить, что артерии головного мозга [96] и кожи [19] 2‑недельных крысят по содержанию сократительных и регуляторных белков, маркирующих сократительный фенотип ГМК, еще значительно отличаются от артерий взрослых крыс. Логично предположить, что в этом возрасте у крыс может проявляться участие АФК в регуляции тонуса периферических сосудов.

Действительно, по нашим данным, ингибитор NOX VAS2870 существенно ослабляет сократительные ответы подкожной артерии крысят в возрасте двух недель (рис. 3). Это говорит о том, что продуцируемые NOX АФК обладают выраженным проконстрикторным влиянием в сосудистом русле кожи у крыс, по крайней мере, в первые две недели после рождения. Учитывая, что у 1–2-недельных крысят [97] кожный кровоток составляет до 20% сердечного выброса, вазомоторное влияние АФК может проявляться у них и на системном уровне. Безусловно, для ответа на вопрос о механизмах влияния АФК на тонус периферических сосудов в период раннего постнатального онтогенеза необходимы дальнейшие исследования. Подсказками на этом сложном пути могут служить характерные для системных артерий развивающегося организма особенности функционирования вазомоторных механизмов [12, 13, 18, 19], которые могут подвергаться регуляции со стороны АФК [2, 3].

Рис. 3.

Оригинальная запись эксперимента на подкожной артерии крысенка в возрасте 2-х недель. Приведены две зависимости “концентрация–эффект” на агонист α₁‑адренорецепторов метоксамин (methoxamine), вторая из зависимостей была получена в присутствии ингибитора NOX VAS2870. Инкубация препарата с VAS2870 (10 мкМ) приводит к значительному ослаблению сократительных ответов. W – washout (отмывка).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, важная роль АФК в регуляции тонуса сосудов в период раннего постнатального онтогенеза не вызывает сомнений, однако характер их вазомоторного влияния может различаться в легочных и системных сосудах, а также на разных стадиях онтогенеза. В перинатальном онтогенезе (на поздней стадии внутриутробного развития и в течение первых часов и суток после рождения) во всех отделах сосудистой системы преобладает констрикторное влияние АФК, а на более поздних этапах знак их влияния может изменяться.

Индуцируемое нормоксией повышение продукции АФК обеспечивает сокращение АП, необходимое для направления крови к легким после рождения. В легочном круге новорожденного организма действием АФК объясняется ослабление реакций эндотелий-зависимого расслабления в результате снижения биодоступности NO. Мы полагаем, что это отражает “следовое” влияние АФК в первые дни жизни: как известно, они способствуют поддержанию высокого сопротивления легочных сосудов в пренатальный период [57]. Механизмы этого явления связаны с функционированием ферментов, обеспечивающих синтез и деградацию АФК и, вероятно, видоспецифичны (в том числе, в связи с разной степенью зрелости организма на момент рождения). Низкая биодоступность NO в легочных артериях новорожденных кроликов по большей части связана с низкой экспрессией/активностью антиоксидантных систем (в частности, SOD). Поскольку в легких человека и грызунов содержание SOD также растет по мере взросления, у этих видов может работать сходный механизм снижения биодоступности NO в период новорожденности. С другой стороны, у новорожденных поросят низкая биодоступность NO может быть связана с высокой продукцией АФК, в частности, как побочных продуктов локализованной в ГМК ЦОГ-1. Подобные условия создают риск развития патологических состояний, например, кислородно-радикального заболевания новорожденных (“oxygen radical disease in newborn”) [64]. Возможно, в качестве компенсации у новорожденных животных сформировался механизм защиты NO от разрушения под действием АФК, проявляющийся в большей экспрессии и функциональном вкладе SOD3 внутри клетки, а не во внеклеточном пространстве, как у зрелых животных.

На более поздних этапах онтогенеза (в возрасте от 1-ой до 4-х недель) АФК, в частности, H₂O₂, напротив, могут принимать непосредственное участие в реализации эндотелий-зависимого расслабления легочных сосудов. Иными словами, влияние АФК служит одним из механизмов постепенного увеличения способности легочных сосудов к дилатации, что необходимо для снижения давления в малом круге кровообращения. Данный факт необходимо учитывать ввиду часто применяемой в клинике антиоксидантной терапии в ранний постнатальный период [98, 99].

Наконец, в системных сосудах на поздних стадиях внутриутробного развития АФК обеспечивают важнейшую защитную реакцию от гипоксии, сопровождающей процесс родов. Гипоксия напрямую вызывает сокращение периферических сосудов плода, что способствует перераспределению крови к головному мозгу, тем самым защищая его от повреждающего гипоксического влияния. Доказано, что данный процесс происходит с участием АФК. АФК сохраняют вазомоторное влияние в периферических системных сосудах и на более поздних стадиях раннего постнатального онтогенеза, однако этот вопрос требует дальнейших исследований.