Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 4, стр. 477-488

ВВЕДЕНИЕ

Начальное предпочтение алкоголя, приводящее к формированию алкогольной зависимости, связано с нарушением функционирования системы награды. Мезолимбическая часть дофаминовой системы головного мозга является центром награды и подкрепления и напрямую вовлечена в механизм алкогольной зависимости [1]. Мезолимбический путь системы награды и подкрепления в основном составляют дофаминергические нейроны, локализованные в области вентральной покрышки среднего мозга (VTA), проекции которых приходят в область прилежащего ядра [2]. Тирозингидроксилаза (ТГ) – основной фермент, лимитирующий скорость синтеза катехоламинов, содержится во всех дофаминовых нейронах. С помощью ТГ аминокислота L-тирозин превращается сначала в 3,4-дигидроксифенилаланин и далее в дофамин [3]. Одним из механизмов регуляции активности ТГ является механизм обратной связи, в ходе которого продукты распада катехоламинов подавляют активность этого фермента [4]. ТГ является общепризнанным маркером для изучения локализации, дифференцировки и развития катехоламинергических нейронов.

Крысы линии DAT-HET – это гетерозиготы линии DAT-KO, у которых с помощью методики для редактирования генома “нуклеаза цинковые пальцы” уменьшили число сайтов рестрикции белка-переносчика дофамина (DAT) только на одной аллели гена. В результате у крыс DAT-HET количество внеклеточного дофамина повышено на 50% по сравнению с животными дикого типа. В связи с этим данная линия обладает рядом поведенческих характеристик, таких как повышенная возбудимость, локомоторная активность и нестабильный уровень тревожности [5]. Модель DAT-HET подходит для изучения таких заболеваний как синдром дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ), шизофрения и аддиктивные расстройства [6].

В некоторых исследованиях на животных было показано, как употребление алкоголя в различных режимах алкоголизации влияет на дофаминергическую систему и вызывает изменения в поведении. Так, этанол снижал уровень дофамина в вентральном стриатуме у крыс Wistar, потребляющих раствор этилового спирта в умеренном количестве в режиме свободной алкоголизации, а также оказывал анксиолитический эффект, который выражался в снижении актов дефекации у крыс в тесте “Открытое поле” [7]. Хроническое потребление алкоголя в течение 365 дней приводило к снижению содержания фермента ТГ и дофамина, а также к увеличению количества DAT в вентральном стриатуме у крыс линии Sprague-Dawley [8]. При прерывистом полупринудительном спаивании у крыс Wistar с высоким потреблением этанола снижался уровень дофамина в прилежащем ядре [9]. У крыс линии Long-Evans через 48 ч после окончания длительной прерывистой алкоголизации с 20%-ным этанолом наблюдалось депрессивное поведение и ангедония [10]. Вместе с тем отмечалось и агрессивное поведение, коррелирующее с повышением уровня дофамина в прилежащем ядре, если крысы получали 10%-ный этанол перед социальными тестами [11]. Транспортер DAT также вовлечен в формирование алкогольной зависимости. В режиме свободного выбора при увеличении концентрации раствора этанола до 32% самцы мышей DAT-HET употребляли больше этанола по сравнению с самцами DAT-KO [12]. У крыс линии Wistar Kyoto, потреблявших большое количество алкоголя при свободном выборе, увеличивалось количество сайтов связывания DAT в нейронах многих областей головного мозга, в том числе в прилежащем ядре [13]. Алкоголь распространяет свое влияние также на активность ТГ. При остром воздействии перорально введенного 20%-ного этанола у крыс линии Sprague-Dawley было отмечено повышение уровня ТГ во многих областях мозга, в том числе в черной субстанции, которая является частью мезолимбической системы [14 ] . У этой же линии крыс при хроническом потреблении 5%-ного раствора этанола в условиях свободного выбора было обнаружено увеличение экспрессии мРНК ТГ в вентральном стриатуме [15]. У крыс Wistar после непрерывного потребления раствора этанола в течение 20 дней наблюдалось снижение иммунореактивности к ТГ в дендритных шипиках в области прилежащего ядра [16].

Несмотря на большое количество исследований, изучающих связь между потреблением алкоголя, его влиянием на дофаминергическую систему и поведение, механизмы предпочтения этанола при гипердофаминергии до конца не изучены. Использование крыс DAT-HET в качестве модели нарушения функционирования дофаминергической системы дает возможность оценить изменение поведенческих характеристик под влиянием этанола и получить новые данные для изучения воздействия этанола на уровень ТГ, который является важным звеном в синтезе дофамина. Методы прерывистой и полупринудительной алкоголизации обычно направлены на формирование мотивации предпочтения алкоголя и включают дополнительный фактор стресса, который может оказывать сильное воздействие на крыс DAT-HET. Ранее в пилотном исследовании нами было показано, что при полупринудительной алкоголизации крысы DAT-HET формируют предпочтение этанола быстрее, чем крысы Wistar, и при этом у них снижается уровень тревожности [17].

Режим свободной алкоголизации включает в себя свободный доступ к любой жидкости в домашней клетке без дополнительного стрессового воздействия, поэтому более всего подходит для изучения предпочтения алкоголя и связанных с этим первичных изменений в поведении животных в данной модели. Таким образом, целью работы была оценка влияния свободной алкоголизации на питьевое, локомоторное, исследовательское поведение, тревогу и уровень ТГ у крыс с нарушением функционирования дофаминергической системы (DAT-HET).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

Исследование проведено на половозрелых самцах крыс линии DAT-HET (n = 15) и популяции Wistar (n = 13) в возрасте двух месяцев, массой тела не менее 180 г на начало эксперимента. Крысы линии DАT-HET были получены и верифицированы в виварии Санкт-Петербургского государственного университета. Верификация наличия нокаутного гена проводилась с помощью генотипирования классическим методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Крысы Wistar были получены в виварии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Все животные были разделены на 4 группы. Экспериментальные группы “DАT-HET ethanol” (n = 10) и “Wistar ethanol” (n = 9) на протяжении 112 дней эксперимента находились в режиме свободной алкоголизации, где имели постоянный доступ к поилке с 10%-ным раствором этанола и к поилке с водой, участвовали во всех поведенческих тестах. Спустя 30 дней после окончания алкоголизации (142-й день эксперимента) из этих групп были отобраны произвольным образом 5 крыс для иммуногистохимического исследования. Контрольные группы: “DАT-HET water” (n = 5) и “Wistar water” (n = 4) имели постоянный доступ к воде и еде, но не имели доступа к раствору этанола, не участвовали в поведенческих тестах, и через 142 дня эксперимента были взяты для иммуногистохимического исследования мозга.

Содержание животных

Все крысы содержались на стандартном рационе по три (две) особи в клетке размером 570 × 350 × 250 мм со свободным доступом к пище и поилкам с водой и с этанолом в условиях освещенности 12 ч свет, 12 ч темнота, температура воздуха – 20 ± 3°С и влажность 50–55%. В качестве пищи животные получали сбалансированный полнорационный корм ЛБК “Тосненский комбикормовый завод” в гранулированной форме, энергетическая ценность 11.39 МДж/кг.

Тест “Двухстаканная проба”

Для оценки предпочтения алкоголя крыса помещалась в клетку, аналогичную домашней, с двумя одинаковыми поилками. Одна из поилок содержала воду, другая – 10%-ный раствор этилового спирта. Локализацию поилок меняли при каждом следующем тестировании. Перед тестированием крысы подвергались питьевой депривациии в течение 24 ч. Оценивали долю (%) выпитого раствора этанола по отношению к общему количеству выпитой жидкости в течение 10 мин наблюдения.

Производили оценку потребления массы раствора этанола, выпитого за неделю. Каждую неделю определяли массу выпитого из поилки раствора этанола. Для каждой клетки определяли массу выпитого этанола в г на кг массы тела животного в пересчете на 100%-ный этанол, затем рассчитывали среднее для одной крысы за один день недели.

Тест “Открытое поле”

Тестирование проводили в установке, которая представляет собой арену размером 600 × 600 мм, снабженную пятью “норковыми” отверстиями и освещенную лампой накаливания 720 люксов, на расстоянии 1.5 м от пола. В течение 5 мин регистрировали следующие параметры: длину пройденного пути, вертикальные стойки (количество), заглядывания в “норки” (количество), груминг (продолжительность, с), болюсы (количество), уринации (количество).

Тест “Приподнятый крестообразный лабиринт”

Тестирование проводили на установке, имеющей два закрытых и два открытых рукава, в месте пересечения которых находится открытая площадка. Лабиринт был установлен на высоте 1 м от пола. Размер каждого рукава составлял 50 × 10 см, размер центра лабиринта – 10 × 10 см. Крысу помещали в центр установки носом к открытому рукаву и в течение 5 мин регистрировали время нахождения в открытых и в закрытых рукавах, время нахождения центре лабиринта, а также вертикальные стойки, свешивания с лабиринта, акты дефекации и уринации.

Иммуногистохимическое исследование

Всем отобранным крысам в качестве наркоза внутрибрюшинно вводили хлоралгидрат (400 мг/кг) и декапитировали. Мозг фиксировали с помощью погружения в 4%-ный раствор параформальдегида в течение 6 дней (при 4°С). После криопротекции в 30%-ном растворе сахарозы, разведенной в фосфатно-солевом буфере с 0.9% NaCl (pH 7.4) мозг замораживали с помощью изопентана (Sigma, США) при ‒42°С и хранили при –80°С. С помощью криостата (Leica CM-1520, Германия) были изготовлены чередующиеся серии фронтальных срезов мозга (толщина 20 мкм) из области прилежащего ядра (nAcc – nucleus accumbens) согласно атласу мозга крысы [18]. Каждый шестой срез монтировали на стекла Super Frost/plus (Menzel, Германия), высушивали при комнатной температуре и хранили при –20°С. Для исследования использован протокол, описанный ранее [19]. Для предварительной демаскировки антигена срезы на стеклах кипятили в цитратном буфере (pH 6.0) в течение 5 мин. Для реакции использовали первичные антитела мыши против ТГ (ТГ, Sigma, США), разведенные 1 : 1500, вторичные антитела козы против IgG мыши, конъюгированные с биотином (VectorLabs., Великобритания), разведенные 1 : 600 и раствор стрептовидин-пероксидазы (BioLegend, США), разведенный 1 : 700. Стекла подвергали стандартной гистологической обработке и заключали в прозрачную среду Bio-Mount (Bio-Optica, Италия). Специфичность реакции проверяли с помощью негативного контроля (реакции без первичных антител). Изображения из области nAcc были получены в проходящем свете с помощью микроскопа Carl Zeiss Imager A1 (Германия) со встроенной видеокамерой Axiocam 712, программного обеспечения для захвата изображения Zen 3.4 (blue edition). С помощью программы Image J (NIH, США) оценивали оптическую плотность ТГ в иммунопозитивных отростках. Результаты представлены в условных единицах (у. е.).

Протокол исследования: массу выпитого раствора этанола в домашних клетках у крыс оценивали еженедельно. Тест “Двустаканная проба” проводили на (–1-й), 27-, 55-, 83- и 111-й дни и через 28 дней после окончания алкоголизации. Тест “Крестообразный лабиринт” – на (–2-й), 54- и 110-й дни алкоголизации, тест “Открытое поле” – на (–4-й), 52- и 108-й дни. Взвешивание крыс проводили каждую неделю эксперимента.

Статистическая обработка результатов

Результаты иммуногистохимического исследования оценивали с помощью Н-критерия Крускала–Уоллиса и последующего апостериорного анализа межгрупповых различий по U-критерию Манна–Уитни с поправкой Холма–Бонферрони. Результаты представлены в виде бокс-плотов с медианой (М) 50% с интерквартильными размахами. Достоверность различий в поведенческих тестах оценивали с помощью U-критерия Манна–Уитни. Полученные результаты поведенческих тестов представляли в виде графиков с медианой с межквартильным интервалом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При оценивании предпочтения этанола в тесте “Двухстаканная проба” было обнаружено, что все животные на протяжении эксперимента в условиях свободного выбора в домашней клетке не предпочитали этанол воде (доля выпитого этанола в тестах не превышала 50% от общего количества выпитой жидкости). Крысы “DAT-HET ethanol” достоверно меньше предпочитали этанол по сравнению с крысами “Wistar ethanol” на 111-й день алкоголизации. Через 28 дней после окончания алкоголизации доля выпитого этанола не превышала 30% для обеих групп (рис. 1).

Рис. 1.

Предпочтение этанола в тесте “Двухстаканная проба”. По оси абсцисс – дни алкоголизации, по оси ординат – доля (%) выпитого алкоголя. Здесь и далее указана значимость отличий (p < 0.05) по Mann–Whitney U test.

Анализ еженедельных измерений массы выпитого раствора этанола в домашних клетках показал, что крысы группы “DAT-HET ethanol” употребляли достоверно меньше алкоголя в середине спаивания [среднее (7-я–11-я) неделя] по сравнению с крысами “Wistar ethanol” и не отличались от них в первые [среднее (1-я–6-я) неделя] и последние [среднее (12-я–16-я) неделя] недели алкоголизации (рис. 2).

Рис. 2.

Средняя масса раствора этилового спирта, выпитого одной крысой из группы за один день (в перерасчете на чистый этанол) в домашних клетках. По оси абсцисс – недели алкоголизации, по оси ординат – средняя масса раствора этилового спирта, выпитого одной крысой из группы за один день, в г/кг массы тела животного.

В среднем по всем пятнадцати измерениям крысы “DAT-HET ethanol” также выпили достоверно меньше алкоголя по сравнению с крысами “Wistar ethanol” 1.3 ± 0.2 и 2.0 ± 0.2 г/кг соответственно (р = 0.03).

В тесте “Открытое поле” крысы “DAT-HET ethanol” демонстрировали высокую локомоторную и вертикальную активность (длина пройденного пути, стойки) по сравнению с крысами “Wistar ethanol” до начала алкоголизации и не отличались по исследовательской активности (заглядывания). После начала алкоголизации двигательная активность крыс “DAT-HET ethanol” снизилась, и поведение животных обеих групп не различалось (рис. 3). Исследовательская активность снизилась в середине и конце спаивания у крыс обеих групп, различий между группами не наблюдали. По вегетативным актам и грумингу крысы не различались на протяжении всего эксперимента.

Рис. 3.

Двигательная и вертикальная активность у крыс на протяжении алкоголизации. По оси абсцисс: дни алкоголизации; по оси ординат: длина пройденного пути, в мм (a), вертикальные стойки, количество (b).

В тесте “Приподнятый крестообразный лабиринт” крысы “DAT-HET ethanol”, в отличие от крыс “Wistar ethanol”, предпочитали открытые рукава в начале и спустя 54 дня после начала алкоголизации. Крысы “DAT-HET ethanol” проводили достоверно меньше времени в центре крестообразного лабиринта до начала и на 54-й день алкоголизации по сравнению с животными из группы “Wistar ethanol”. Крысы “DAT-HET ethanol” проводили достоверно меньше времени в закрытых рукавах лабиринта до начала алкоголизации. В конце алкоголизации между группами достоверных отличий не обнаружено. Количество свешиваний с открытых рукавов у группы “DAT-HET ethanol” в начале опыта было больше (8.3 ± 4.6 против 3.0 ±1.0, р < 0.01), однако в последующих тестах различия между группами не достоверны. Также не обнаружено достоверных различий между группами по времени, проведенному в открытых рукавах.

Рис. 4.

Время, проведенное в закрытых (а), открытых рукавах (b) и в центре (с) приподнятого крестообразного лабиринта. По оси абсцисс: дни алкоголизации; по оси ординат: время в мс.

Рис. 5.

Иммуногистохимическая реакция к тирозингидроксилазе на фронтальном срезе мозга крысы Wistar с областью прилежащего ядра (nAcc). При малом увеличении область nAcc выделена квадратом, при большем увеличении в nAcc расположены тирозингидраксилаза-иммунопозитивные отростки. Обозначение: ac – anterior commissure, масштаб: 5 мм (а) и 200 мкм (b).

В данном исследовании проведено измерение оптической плотности ТГ- иммунопозитивного материала в отростках дофаминергических нейронов в области прилежащего ядра (nucleus accumbenc) (рис. 5) во всех группах крыс линий DAT-HET и Wistar.

Отмечена исходно более высокая оптическая плотность ТГ-иммунопозитивных отростков в области прилежащего ядра у крыс “DAT-HET water”: M = 113 (0.108; 0.126) по сравнению с группой “Wistar water”: M = 108 (0.103; 0.115). После алкоголизации у крыс “DAT-HET ethanol” отмечается снижение уровня ТГ: М = 109 (0.103; 0.114) по сравнению с группой “DAT-HET water” (рис. 6). Снижение оптической плотности ТГ у крыс “DAT-HET ethanol” отмечается и по сравнению с группой “Wistar ethanol”: M = 112 (0.106; 0.117) (p = 0.04).

Рис. 6.

Оптическая плотность ТГ-иммунопозитивных отростков в области прилежащего ядра у исследуемых групп крыс линий DAT-HET и Wistar. По оси ординaт: оптическaя плотность в условных единицaх (у. е.). Обознaчения: чернaя линия внутри боксa – медиaнa, линии пределa – интерквaртильный рaзмaх. Достоверность отличий при р < 0.05, по Mann–Whitney U test.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данном эксперименте крысы DAT-HET не показали предпочтения этанола в условиях свободной алкоголизации в “Двухстаканной пробе” и демонстрировали низкий уровень его потребления в домашних клетках в течение недели. Ранее было показано, что в условиях полупринудительной алкоголизации крысы DAT-HET по сравнению с Wistar увеличивают потребление и предпочтение этанола [17]. Полученные в данном эксперименте результаты перекликаются с более ранними исследованиями о роли DAT в формировании предпочтения к этанолу именно в условиях свободной алкоголизации. Так, в аналогичных условиях у самцов мышей DAT-KO и DAT-HET снижалось потребление и предпочтение этанола [20]. Следует отметить, что крысы Wistar, потребляющие больше этанола в недельных пробах в середине эксперимента, тоже не демонстрировали достоверно устойчивого предпочтения в процессе алкоголизации и спустя месяц после нее. Наши данные согласуются с результатами работ, показавших, что подобная динамика потребления этанола характерна для животных, которые получают этанол при свободном выборе [21].

Локомоторная активность у крыс DAT-HET до начала алкоголизации достоверно выше, чем у крыс линии Wistar, что неоднократно отмечалось ранее [5, 6]. В дальнейшем на фоне алкоголизации к середине эксперимента локомоторная активность животных линии DAT-HET снизилась и не отличалась от показателей алкоголизирующихся крыс Wistar. Различий в исследовательской активности крыс DAT-HET по сравнению с Wistar не было обнаружено, она была высокой в первом тестировании до начала спаивания и снизилась в последующих тестах. Эти же результаты отмечаются и в конце эксперимента. Возможно, на фоне свободной алкоголизации, при отсутствии формирования предпочтения этанола, уменьшение локомоторной и исследовательской активности у крыс DAT-HET связано с седативным эффектом этанола, который снижает гиперреактивность этой группы животных. Также можно высказать предположение, что на это могут влиять такие факторы, как привыкание к тестовой арене открытого поля и старение животных в процессе эксперимента.

Гиперреактивность крысы DAT-HET демонстрируют и в тесте “Приподнятый крестообразный лабиринт”, что также соответствует поведенческим характеристикам линии [6]. До алкоголизации они статистически значимо больше по сравнению с Wistar проводят времени в открытых рукавах и меньше в центре лабиринта. Такое соотношение нахождения в открытых рукавах и в центре, возможно, свидетельствует о высокой реактивности крыс данной линии. На фоне алкоголизации эта тенденция сохраняется до середины эксперимента, однако в конце эксперимента различия с крысами Wistar нивелируются.

Проекции дофаминергических нейронов, локализованных в области вентральной покрышки среднего мозга (VTA), приходят в область прилежащего ядра и составляют мезолимбический путь, контролирующий систему награды и подкрепления [2, 22]. Поэтому оценка уровня ТГ проводилась в иммунопозитивных отростках дофаминергических нейронов в области прилежащего ядра. Несмотря на невысокое потребление раствора этанола у крыс “DAT-HET ethanol”, уровень ТГ в проекциях дофаминергических нейронов в области прилежащего ядра был ниже у крыс “DAT-HET water”, но не отличался от крыс “Wistar ethanol”. Также имел тенденцию к снижению уровень ТГ у крыс DAT-HET по сравнению с алкоголизироваными крысами Wistar, однако при статистической обработке после поправки Холма–Бонферрони различия нивелируются, вероятно, из-за небольшой выборки.

Известно, что DAT регулирует передачу сигналов на всех пре- и постсинаптических рецепторах дофамина, удаляя нейротрансмиттер из внеклеточного пространства, методом обратного захвата [23], его плотность наиболее высока в стриатуме и прилежащем ядре [24]. У всех крыс с нокаутом DAT нарушение обратного захвата приводит к дисбалансу синтеза дофамина, в частности, у DAT-KO снижается уровень мРНК ТГ в среднем мозге и уровень белка ТГ в стриатуме, а у DAT-HET увеличен внеклеточный уровень дофамина в стриатуме [5]. По этой причине у крыс DAT-HET изначально повышенное количество ТГ в проекциях дофаминергических нейронов в области прилежащего ядра может быть связано с высоким содержанием внеклеточного дофамина в стриатуме. Можно предположить, что даже малые дозы этанола могут воздействовать на дофаминергических нейроны, вызывая снижение общего уровня ТГ в их проекциях в прилежащем ядре, и, вероятно, снижают уровень внеклеточного дофамина в вентральном стриатуме и других структурах мезолимбической системы. При этом у крыс DAT-HET не возникает предпочтения к этанолу по причине работы компенсаторных механизмов в дофаминергической системе. Как следствие, это приводит к снижению содержания дофамина и изменению характерного поведения для данной модели животных, прежде всего их гиперактивности.

Таким образом, можно сделать вывод, что у крыс линии DAT-HET наблюдается увеличение уровня ТГ в прилежащем ядре. Кроме этого, режим свободной алкоголизации снижает уровень ТГ в прилежащем ядре при развитии патологического увеличения содержания ТГ, наблюдающегося у животных линии DAT-HET, но не оказывает эффекта на животных в контрольных группах. Данный вывод хорошо согласуется с полученными поведенческими данными, при которых у крыс DAT-HET снижается избыточная локомоторная активность в условиях алкоголизации. Однако необходимо учесть тот факт, что крысы DAT-HET не сформировали предпочтения этанола в условиях свободной алкоголизации и потребляли меньше алкоголя, чем животные контрольной группы. Таким образом, сравниваемые группы были подвергнуты воздействию разного объема этанола, что вызывает трудности при интерпретации данных с позиции нейрохимического и фармакологического подходов. Однако эти трудности могут быть преодолены в следующих экспериментах, например, с использованием принудительного воздействия одинаковыми низкими объемами этанола.

Ограничения исследования

Был исследован только показатель общего фермента ТГ в волокнах прилежащего ядра. Разное количество животных в группах. Не производилась оценка уровня отдельных катехоламинов.