Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 4, стр. 457-465

ВВЕДЕНИЕ

Поддержание адекватной перфузии ткани головного мозга имеет большое значение для его нормального функционирования [1–3]. Старение сопровождается изменениями в строении и функциональной активности мозговых сосудов, что может нарушать мозговую гемодинамику и способствовать изменению метаболизма мозга, развитию нейродегенеративных процессов, ишемии и цереброваскулярных заболеваний [4–8]. Среди количественных показателей мозговой гемодинамики, которые коррелируют с метаболизмом мозга в состоянии покоя, выделяют давление крови, сопротивление сосудов и скорость кровотока [9]. Данные, полученные на людях и экспериментальных животных, в подавляющем большинстве свидетельствуют о возрастном уменьшении скорости мозгового кровотока [7, 10–12]. Однако также имеются сведения об отсутствии изменений скоростных показателей кровотока в мозговых артериях при старении [11, 13] или их увеличении [14]. Различия в получаемых результатах могут быть связаны как с методологическими особенностями измерения скорости кровотока и видовыми или регионарными отличиями [13], так и с существованием различий в изменении мозгового кровотока на разных этапах старения [15]. Целью данной работы было исследование скоростных показателей церебрального кровотока методом ультразвуковой допплерографии у молодых крыс и крыс на разных этапах старения. В задачи исследования входило проведение сравнительного анализа состояния кровотока коры и подкорковых структур полушарий головного мозга по величине линейных скоростей и индексов кровотока у молодых крыс линии Sprague-Dawley в возрасте 4-х месяцев и стареющих крыс в возрасте 18-ти и 23-х месяцев.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на самцах крыс Sprague-Dawley в возрасте 4-х (n = 19, массой 358 ± 11 г), 18-ти (n = 11, массой 450 ± 65 г) и 23-х месяцев (n = 9, массой 525 ± 33 г). Использовались крысы из ЦКП “Биоколлекция ИФ РАН для исследования интегративных механизмов деятельности нервной и висцеральных систем” (Санкт-Петербург). До проведения эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище по 6 особей в клетках Т4 на стандартной лабораторной диете в условиях искусственного освещения (цикл: 12 ч свет/12 ч темнота).

Крысы наркотизировались золетилом (внутрибрюшинно, 20 мг/кг, Virbac, Франция). Среднее артериальное давление (АД), измеренное с помощью прибора для неинвазивного измерения АД (“Систола”, Netrobotics, Россия) в хвостовой артерии, у наркотизированных крыс в возрасте 4-х мес. составляло 128 ± 4 мм рт. ст., 18-ти мес. – 133 ± 4 мм рт. ст., 23 мес. – 134 ± 2 мм рт. ст.

Измерение скорости мозгового кровотока проводилось методом ультразвуковой допплерографии [16] через высверленное в теменной области черепа отверстие (S ≈ 1 см²). Использовался ультразвуковой компьютеризированный допплерограф ММ-Д-К (Minimax Doppler v.1.7, УЗДП-009-02, Россия) с рабочей частотой датчика 25 МГц. Датчик устанавливался на область измерения через проводящий гель без сдавливания поверхности измерения. Глубина прохождения ультразвукового сигнала для датчика данной частоты составляет примерно 3–4 мм, что обеспечивало исследование кровотока в коре и подкорковых структурах полушарий головного мозга крыс. Оценка состояния кровотока проводилась по данным спектрального анализа допплеровского сигнала преимущественно с артериальных участков сосудистой сети обоих полушарий головного мозга [16]. С помощью программного обеспечения допплерографа автоматически рассчитывались величины линейных скоростей кровотока (пиковой (Vps) и средней систолической (Vs), конечной (Vd) и средней диастолической (Vpd) и средней за сердечный цикл (Vm)). Также программа допплерографа рассчитывала индексы кровотока: индекс пульсации (Гослинга), отражающий упруго-эластические свойства артерий (PI) и индекс периферического сопротивления (Пурсело), отражающий состояние сопротивления кровотоку дистальнее места измерения (RI). Межполушарной асимметрии скоростей и индексов кровотока обнаружено не было.

Статистический анализ данных проводился с использованием пакета статистических программ Microsoft Excel 2019 и программы InStat 3.02 (“GraphPad Software Inc.”, США). Проверка экспериментальных данных на нормальное распределение проводилась с использованием критерия Колмогорова–Смирнова. Во всех случаях исследование на нормальность распределения показало его отсутствие хотя бы для одной из сравниваемых выборок, поэтому статистический анализ полученных данных проводился с использованием непараметрических методов. Сравнение средних данных независимых выборок при сравнении 2 групп проводилось с использованием U-критерия Манна–Уитни. Данные в таблице и на графиках представлены как медиана [25-й процентиль; 75-й процентиль]. Статистически значимыми считали различия при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Значения скоростных показателей кровотока у крыс в возрасте 4-х мес. представлены в табл. 1. У 18-месячных крыс по сравнению с 4-месячными животными было отмечено увеличение пиковых скоростей кровотока: систолической (в среднем на 33.8%, p = 0.01, U = 700, критерий Манна–Уитни) и конечной диастолической (в среднем в 2 раза, p = 0.02, U = 532, критерий Манна–Уитни, табл.1). Средняя за сердечный цикл скорость кровотока также была увеличена (в среднем на 70.7%, p = 0.02, U = 707, критерий Манна–Уитни, табл. 1). Показатели средней систолической скорости кровотока снижались до 0.42 [0.29; 0.51] см/с по сравнению с 0.51 [0.35; 0.71] см/с у 4-месячных крыс (табл. 1).

Сравнительный анализ скоростей кровотока в различных участках полушарий головного мозга у молодых и 18-месячных крыс показал существование различий в лобной и теменной области полушарий. В лобной области увеличивалась пиковая систолическая (до 60.56 [35.19; 71.01] см/с по сравнению с 41.26 [28.56; 51.21] см/с у 4-месячных крыс), средняя за сердечный цикл (в среднем в 2 раза, p = 0.02, U = = 123.5, критерий Манна–Уитни) и конечная диастолическая (до 4.53 [3.23; 8.26] см/с по сравнению с 2.69 [1.18; 5.67] см/с у крыс в возрасте 4-х мес.) скорости кровотока (рис. 1). Показатели средней систолической скорости кровотока снижались (0.54 [0.38; 0.98] см/с у крыс в возрасте 4-х мес.; 0.42 [0.33; 0.61] см/с у крыс в возрасте 18-ти месяцев).

Рис. 1.

Показатели линейных скоростей кровотока в различных участках полушарий головного мозга: лобном (frontal), теменном (parietal) и затылочном (occipital). Темная заливка – крысы в возрасте 4-х мес., белая заливка – крысы в возрасте 18-ти месяцев, точечная штриховка – крысы в возрасте 23-х мес. Верхняя и нижняя граница каждого прямоугольника – первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили) соответственно, поперечная линия внутри – медиана (50-й процентиль), крестик внутри – среднее арифметическое, концы отрезков 10-й и 90-й процентили, точки – выбросы. Различия значимы по сравнению с соответствующими значениями у крыс в возрасте 4-х месяцев (*p < 0.05, ** p < 0.01, U-критерий Манна–Уитни).

В теменной области полушарий у животных в возрасте 18-ти месяцев по сравнению с более молодыми крысами увеличивались показатели пиковой систолической (до 60.88 [43.11; 67.94] см/с по сравнению с 35.59 [23.86; 55.97] см/с у 4-месячных крыс) и средней за сердечный цикл (в среднем на 27.46%, p = 0.01, U = 108, критерий Манна–Уитни) скоростей кровотока (рис. 1).

Показатели индекса RI к 18 мес. не изменялись (рис. 2). В то же время в лобной и теменной областях полушарий у 18-месячных крыс было отмечено снижение показателя индекса PI в среднем на 30% (рис. 3).

Рис. 2.

Показатели индекса резистентности в различных участках полушарий головного мозга: лобном (frontal), теменном (parietal) и затылочном (occipital). Темная заливка – крысы в возрасте 4-х мес., белая заливка – крысы в возрасте 18-ти мес., точечная штриховка – крысы в возрасте 23-х мес. Различия значимы по сравнению с соответствующими значениями у крыс в возрасте 4-х месяцев (*p < 0.05, критерий Манна–Уитни). Остальные обозначения как на рис. 1.

Рис. 3.

Показатели пульсационного индекса в различных участках полушарий головного мозга: лобном (frontal), теменном (parietal) и затылочном (occipital). Темная заливка – крысы в возрасте 4-х мес., белая заливка – крысы в возрасте 18-ти мес., точечная штриховка – крысы в возрасте 23-х мес. Различия значимы по сравнению с соответствующими значениями у крыс в возрасте 4-х мес. (*p < 0.05, **p < 0.01, U-критерий Манна–Уитни). Остальные обозначения как на рис. 1.

У 23-месячных крыс по сравнению с крысами в возрасте 4-х мес. отмечалось общее снижение пиковой систолической скорости кровотока (табл. 1). Изменение этого показателя было отмечено только в теменной и затылочной областях полушарий головного мозга. В теменной области Vps снижалась в среднем на 35% (p = 0.012, U = 110, критерий Манна–Уитни), а в затылочной – в среднем на 20.11% (p = 0.02, U = 192, критерий Манна–Уитни) (рис. 1). В затылочной области также изменялись показатели конечной диастолической скорости кровотока (увеличение до 4.01 [2.72; 8.27] см/с по сравнению с 2.78 [1.24; 3.86] см/с у крыс в возрасте 4-х месяцев, рис. 1).

В лобной области было выявлено снижение средней за сердечный цикл (до 11.55 [8.86; 17.63] см/с по сравнению с 14.67 [9.46; 24.96] см/с у крыс в возрасте 4-х мес.) и конечной диастолической скорости кровотока (в среднем в 2 раза, p = 0.04, U = 88, критерий Манна–Уитни) (рис. 1). Показатели индексов кровотока в этом участке полушарий головного мозга также увеличивались: RI увеличивался до 0.94 [0.89; 0.98] отн. ед. по сравнению с 0.91 [0.83; 0.95] отн. ед. у крыс в возрасте 4-х мес. (рис. 2); PI – в среднем на 21.32%, p = 0.04, U = 168, критерий Манна–Уитни (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследование показало, что скоростные параметры кровотока в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс при старении меняются. У 18-месячных крыс по сравнению с более молодыми животными увеличиваются пиковые и средняя за сердечный цикл скорости кровотока. Изменения церебрального кровотока при старении связывают с возрастными нарушениями метаболизма и атрофией головного мозга [13]. Областями мозга, в которых наблюдается наиболее высокий метаболизм глюкозы и кислорода являются лобная, височная и теменная. И именно эти области наиболее уязвимы к дегенеративным изменениям при старении [17–19]. В нашем исследовании у крыс в возрасте 18-ти мес. изменения наблюдались в лобной и теменной области, в то время как в затылочном регионе достоверных изменений кровотока обнаружено не было. Как в лобной, так и в теменной области полушарий у 18-месячных крыс по сравнению с более молодыми животными отмечалось увеличение пиковой систолической и средней за сердечный цикл скоростей кровотока. В лобной области также повышалась конечная диастолическая скорость. Такие изменения свидетельствуют о гиперперфузии этих участков полушарий головного мозга и развитии стенозирующих процессов, вероятно, связанных со снижением тонуса и сужением церебрального микроциркулярного русла [5, 8, 20].

Изменение показателей средних скоростей кровотока были отмечены только в лобной области. В этом участке у крыс в возрасте 18-ти мес. снижалась средняя систолическая скорость кровотока. В то же время и в лобной, и в теменной областях полушарий головного мозга у 18-месячных крыс было обнаружено снижение показателя индекса пульсации в среднем на 20% (рис. 3). Наряду с увеличением конечной диастолической скорости кровотока снижение индекса пульсации и средней систолической скорости могут косвенно свидетельствовать о снижении сосудистого сопротивления [21] и активации коллатеральных путей кровотока [22], вероятно, связанных с увеличением числа капилляров [17], диаметра и извитости дистальных участков мелких артерий на данном этапе старения [17, 23]. Активация коллатерального кровотока, возможно, является компенсаторным путем восстановления нормальной перфузии коры головного мозга в условиях развития стенозируюших процессов.

У крыс в возрасте 23-х мес. показатели пиковых скоростей кровотока по сравнению со значениями у 4-месячных животных были снижены. В лобной области отмечалось снижение конечной диастолической скорости кровотока, а в теменной и затылочной – пиковой систолической. В лобной области также снижалась средняя систолическая скорость кровотока. Такие изменения скоростных показателей могут свидетельствовать о развитии гипоперфузионных процессов во всех участках полушарий головного мозга. Снижение пиковых скоростей кровотока в лобной области полушарий у 23-месячных крыс в наших экспериментах сопровождалось увеличением показателей индекса резистентности и индекса пульсации (в среднем на 20%). Сочетание низкой скорости с высокими показателями индексов кровотока может указывать на снижение объема кровотока в этом участке мозга, связанное с диффузным стенозом артериол и мелких артерий [24, 25].

Следовательно, гиперперфузия лобных и теменных областей полушарий головного мозга, наблюдаемая у 18-месячных крыс, предшествует развитию последующих гипоперфузионных нарушений кровотока на более поздних этапах старения. К 23 мес. гипоперфузионные изменения охватывают уже все исследованные нами участки полушарий головного мозга крыс. Для сохранения нормальной функции мозга большое значение имеет поддержание адекватной церебральной перфузии через плотную микроваскулярную сеть [2, 3]. В настоящее время появляются доказательства того, что старение вызывает многогранные функциональные нарушения в микроциркуляции головного мозга. На ранних этапах старения для поддержания адекватной оксигенации мозга необходимо увеличение мозгового кровотока [26], что обеспечивается увеличением плотности капиллярного русла и извилистости коллатеральных путей мозгового кровотока [23]. Но длительная гиперпефузия и дальнейшее старение могут приводить к повреждению сосудов микроциркулярного русла [27, 28] и общему уменьшению числа капилляров в коре головного мозга [23]. При длительном старении развивается эндотелиальная дисфункция, способствующая снижению NO-опосредованного ингибирования пролиферации, окислительного стресса и воспаления, что, в свою очередь, также приводит к апоптозу, уменьшению длины, диаметра и количества коллатеральных сосудов [2, 23, 29]. Кроме того, старение сопровождается нарушениями в системе эндотелина, приводящими к повышению миогенного тонуса и сужению просвета сосудов в микроциркуляторном участке мозгового сосудистого русла [30]. Все эти изменения могут являться причиной развития гипоперфузии и значительно увеличивать величину сосудистого сопротивления [2, 23].

Таким образом, установлено, что старение сопровождается изменением параметров мозгового кровотока в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс. Изменения развиваются постепенно и отличаются на разных этапах старения. Первоначальное увеличение перфузии в лобной и теменной области полушарий головного мозга за счет повышения пиковых и средней за сердечный цикл скоростей кровотока и снижение уровня сопротивления мозговых сосудов, к 23 мес. сменяются гипоперфузинными процессами, наиболее выраженными в лобной области полушарий головного мозга.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все процедуры, выполненные на животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям Комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (протокол № 12/26 от 26.12.2022 г.).