Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 6, стр. 749-759

ВВЕДЕНИЕ

с-Jun-N-терминальные киназы (JNK) принадлежат к семейству митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK), которые активируются в ответ на действие разнообразных стрессорных и повреждающих факторов. JNK включают 10 изоформ, кодируемых тремя генами: JNK1 (4 изоформы), JNK2 (4 изоформы) и JNK3 (2 изоформы) [1, 2]. JNK1 и JNK2 представлены во всех клетках организма, в то время как JNK3 экспрессируется преимущественно в сердце и в головном мозге [3]. Фактор транскрипции c-Jun является субстратом для JNK и после фосфорилирования может запускать процессы апоптоза в нейрональных клетках [4]. JNK вовлечены в регуляцию воспаления, играют важную роль в сигнальных путях, ведущих к апоптозу и некрозу, регулируют некоторые транскрипционные, равно как и не связанные с транскрипцией клеточные процессы, от которых зависит повреждение нейронов головного мозга и кардиомиоцитов при ишемии и реперфузии [5, 6]. JNK вовлечены в патогенез диабета, атеросклероза, инсульта, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона [7, 2 ], опухолевого роста [3], воспалительных заболеваний, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и гипертрофии миокарда [5]. Ингибиторы JNK привлекают к себе широкое внимание как потенциальные терапевтические средства для профилактики и лечения ишемических повреждений [8, 9].

Нами был синтезирован новый ингибитор JNK – IQ-1 (11H-индено[1,2-b]-хиноксалин-11-он оксим), который обладает повышенным аффинитетом в отношении изоформы JNK3 [10], выраженным нейропротекторным эффектом и способностью проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [11]. С помощью филаментной модели локальной ишемии/реперфузии средней мозговой артерии нами показано, что размеры зоны некроза мозга у мышей достоверно уменьшались при введении IQ-1 по сравнению с контрольными значениями [11]. Выраженная нейропротекция с использованием IQ-1 была выявлена также при тотальной ишемии/реперфузии мозга крыс [12]. Одним из возможных механизмов нейропротекторного действия ингибитора может быть увеличение мозгового кровотока в связи с выделением оксида азота (NO) при биотрансформации молекулы IQ-1 [11]. Целью настоящей работы явилось изучение вазоактивного и нейропротекторного действия ингибитора IQ-1 у животных с хронической гипоперфузией головного мозга, вызванной невозвратной окклюзией 2 сонных артерий (модель 2VO [13]). Из клинической практики известно, что такое хроническое ограничение кровоснабжения мозга может развиваться в результате сердечной недостаточности, системной артериальной гипотензии, при патологии сосудов головного мозга (мальформация, атеросклероз) или действии других патогенетических факторов [13, 14]. Кроме того, при хронической гипоперфузии мозга отчетливо проявляется утрата когнитивных функций у животных [15, 16], что открывает возможность количественной оценки неврологического дефицита. В основе гипоперфузионного повреждения мозга лежит медленная, прогрессирующая гибель нервных клеток мозга, приводящая к таким клиническим проявлениям, как потеря памяти, деменция, нарушения движений, болезнь Альцгеймера и другим неврологическим заболеваниям [13].

Задачами исследований являлись: (а) – изучение действия ингибитора IQ-1 на мозговой кровоток и реактивность церебральных сосудов у животных на фоне хронической гипоперфузии мозга, вызванной невозвратной окклюзией общих сонных артерий, (б) – оценка влияния IQ-1 на неврологический статус крыс с хронической гипоперфузией головного мозга, (в) – сравнение вазомоторного действия IQ-1 с эффектом NO-донора S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выполнения работы использовались следующие химические препараты: соединение IQ-1 (11H-индено[1,2-b]хиноксалин-11-он оксим) было синтезировано в научно-образовательном центре Н.М. Кижнера Томского Политехнического Университета (Россия), золетил (Zoletil Virbac, Франция), ксиланит (ЗАО Нита-фарм, Россия), атропина сульфат (ОАО Дальхимфарм, Россия), изофлуран (Лабораторное Каризоо, СА, Барселона, Испания), SNAP (Sigma-Aldrich, США), Tween-80 (Sigma-Aldrich, США).

Исследования выполнены на крысах-самцах линии Wistar массой 287 ± 19 г, закупленных в питомнике животных “Рапполово” (Ленинградская область, Россия). Протокол опытов утвержден биоэтической комиссией ИЭФБ РАН по использованию животных в экспериментах в соответствии с международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований на животных (CIOMS, Geneva, 1985). При подготовке животных к опытам проводили две хирургические операции. На первом этапе животным имплантировали в мозг платиновые электроды для измерений мозгового кровотока. На втором этапе у животных с вживленными электродами проводилась перевязка 2 общих сонных артерий для создания модели хронической гипоперфузии головного мозга. Каждой крысе за неделю до опытов под наркозом в асептических условиях вводили платиновые игольчатые электроды диаметром 0.15 мм в мозговые структуры (теменная кора, гиппокамп, черная субстанция и стриатум) согласно атласу стереотаксических координат [17]. Вживление электродов в головной мозг крыс проводилось с использованием золетил-ксилазинового наркоза (из расчета на 100 г массы тела животного): золетил – 0.3 мг внутримышечно, ксиланит – 0.8 мг внутримышечно, атропина сульфат 0.1%-ный раствор – 0.01 мл подкожно. Хирургическую стадию наркоза верифицировали по исчезновению реакций на болевые раздражители (укол лапы) и угнетению роговичного рефлекса.

Каждый платиновый электрод изолировался стеклом за исключением кончика длиной 1.5 мм, который 3-кратно покрывался раствором нафиона (Nafion, Sigma-Aldrich) с последующим высушиванием. При таких размерах активной поверхности электрода объем участка мозга, в котором измеряется кровоток, составляет около 8 мм³. Для крепления электродов в височную кость черепа билатерально ввертывали два винта из нержавеющей стали. Электроды и винты фиксировались на кости зубопротезным цементом. Животных возвращали в виварий, в индивидуальные клетки и обеспечивали соответствующий постоперационный уход.

Через 5–7 дней у животных с вживленными в мозг электродами под наркозом осуществлялась перевязка 2 общих сонных артерий (модель 2VO [18]). Для этого крыс помещали в индукционную камеру, подключенную к испарителю для изофлурана (Dvapo Испаритель, Дельфин, КНР). Для индукции применяли 4 об. % изофлурана при самостоятельном дыхании в потоке кислорода (2 л/мин). После потери двигательной активности крысу перемещали на подогреваемый операционный столик и анестезия продолжалась изофлураном (1.5 об. % в потоке кислорода, 1 л/мин) через намордную маску. После выделения левой и правой общих сонных артерий их необратимо перевязывали нейлоновой нитью (Ethilon 2/0, Ethicon, США). Рану ушивали, операционное поле обрабатывали антисептиком (5%-ный раствор йода). Животных на 5–7 ч помещали в бокс под согревающую лампу.

Абсолютные величины локального мозгового кровотока измерялись с помощью метода водородного клиренса [19]. Метод основан на определении скорости вымывания (клиренса) из мозговой ткани водорода, предварительно введенного в нее путем дыхания водородсодержащей смеси (2.5% Н₂ в воздухе). Продолжительность ингаляции водородсодержащей смеси составляла 10–15 с. При непрерывном измерении напряжения водорода в мозговой ткани скорость его вымывания прямо зависит от интенсивности кровотока, что положено в основу расчета абсолютных величин церебральной гемодинамики. Напряжение водорода в мозге измерялось полярографически с помощью ранее имплантируемых внутримозговых платиновых электродов и референтного (хлорсеребряного) электрода в виде клипсы, закрепленной на основании хвоста. Кривые клиренса водорода регистрировались с помощью приборов (Физиоблок-Пульс, Санкт-Петербург) и использовались для вычисления абсолютных значений мозгового кровотока (мл/мин/100 г ткани мозга) с помощью программно-аппаратного комплекса WINDAQ (DC-200, DATA, OH, США). Метод водородного клиренса позволяет последовательно измерять мозговой кровоток с интервалом не менее 5 мин. Неврологический дефицит, возникающий при гипоперфузии мозга, оценивали при помощи шкалы McGraw в модификации Ганнушкиной [20, 21], определяющей степень неврологических нарушений легкого (1–3), среднего (3–6) и сильного (6–10) уровней тяжести.

В работе было использовано 47 крыс с вживленными платиновыми электродами, разделенных на 3 группы. В группе 1 (n = 12) у крыс с интактными сонными артериями оценивались реакции кровотока в стриатуме при разовом внутрибрюшинном введении IQ-1 в дозе 25, 50 и 100 мг/кг. Целью этих опытов являлось определение вазоактивной дозы препарата IQ-1 для ее использования в последующих опытах. У части крыс этой группы измерялся кровоток в стриатуме при внутрибрюшинном введении донора NO SNAP в дозе 2 мкг/кг. У оставшихся 35 животных с вживленными электродами проводилась билатеральная невозвратная окклюзия сонных артерий. В результате операции погибло 7 крыс. У выживших животных (группа 2, n = 14) измерения кровотока выполнялись одновременно в теменной коре, гиппокампе, стриатуме и черной субстанции. Кровоток измерялся в течение 2 нед. через каждые 2 сут. У части животных группы 2 (п = 7) тестировалась реактивность церебральных сосудов посредством оценки изменений локального мозгового кровотока в ответ на 30-секундную ингаляцию 5% СО₂ в воздухе (гиперкапническая проба). У всех животных группы 2 оценивался неврологический статус на фоне развития гипоперфузии мозга.

У животных группы 3 (n = 14) кровоток в 4 структурах мозга измерялся после внутрибрюшинного введения IQ-1 в дозе 50 мг/кг. Такая доза препарата была выбрана на основании результатов предварительных исследований на группе 1 животных. Препарат (порошок) тщательно размешивали в растворе (вода + Tween-80), после чего заданное количество препарата в объеме раствора 2 мл вводилось внутрибрюшинно после перевязки сонных артерий. В каждом опыте кровоток измерялся до и после введения препарата в течение 2 ч. Измерения мозгового кровотока по такой схеме с курсовым введением IQ-1 (т.е. повторяющимся введением препарата каждые 48 ч в течение 14 дней) проводились на каждом животном. У части крыс группы 3 (n = 6) измерялся мозговой кровоток после внутрибрюшинного введения NO-донора SNAP (2 мкг/кг). У всех животных в процессе 2-недельной гипоперфузии мозга оценивался неврологический статус на фоне курсового введения IQ-1. После завершения опытов проводили эвтаназию животных с использованием инъекции золетила (3 мг) в хвостовую вену.

Для статистического анализа использовались абсолютные величины локального мозгового кровотока. Данные анализировали с помощью пакета программ SigmaPlot 13.0 (Systat Software, Inc., San Jose, CA). Рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для сравнения величин кровотока, измеренных в разные временные интервалы мозговой гипоперфузии у контрольных животных и у крыс после введения IQ-1. Для выявления достоверности (p < 0.05) использовали парный t-критерий с точным тестом Фишера. Все данные представлены как М ± SEM.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Усредненное значение кровотока в стриатуме крыс (группа 1, n = 12) с интактными сонными артериями составляло 69.0 ± 5.8 мл/мин/100 г ткани. Внутрибрюшинное введение IQ-1 в дозах 25, 50 и 100 мг/кг вызывало повышение кровотока в стриатуме, величина и продолжительность которого зависела от дозы (рис. 1). Достоверное повышение кровотока выявилось через 30 мин после введения препарата и сохранялось на протяжении 2 ч измерений. Внутрибрюшинное введение донора NO – SNAP в дозе 2 мкг/кг увеличивало кровоток в стриатуме на такую же величину, как и при введении IQ-1 в дозе 50 мг/кг. Указанная доза IQ-1 была выбрана нами в последующих исследованиях вазоактивного и нейропротекторного действия этого препарата у крыс с хронической гипоперфузией головного мозга.

Рис. 1.

Дозозависимые изменения кровотока в стриатуме крыс с интактными сонными артериями при внутрибрюшинном введении IQ-1 в дозах 25, 50 и 100 мг/кг. * – p < 0.05 по сравнению с базовым значением для 25 мг/кг, ^# – p < 0.05 по сравнению с базовыми значениями для 50 и 100 мг/кг. Препарат вводился в момент времени “0”.

У крыс группы 2 (n = 14) кровоток измерялся в 4 областях мозга в течение 2 нед. после невозвратной перевязки сонных артерий. Полученные данные демонстрируют наличие гетерогенности в кровоснабжении головного мозга до перевязки сонных артерий с наибольшим уровнем кровотока в черной субстанции и теменной коре (табл. 1).

Через 30 мин после перевязки сонных артерий кровоток достоверно снижался во всех исследуемых структурах головного мозга и сохранялся на достоверно низком уровне в течение 2 нед. по отношению к его значениям до начала гипоперфузии. Незначительное повышение кровотока выявилось к концу наблюдений, однако величины этих изменений были статистически недостоверными по отношению к значениям церебральной гемодинамики первого дня гипоперфузии.

У крыс группы 3 (n = 14) после перевязки обеих сонных артерий уровень гипоперфузии оценивался путем измерений кровотока в 4 структурах мозга в течение 14 дней на фоне курсового введении препарата IQ-1 (50 мг/кг, внутрибрюшинно) через каждые 48 ч (табл. 2).

Анализ данных табл. 2 показал, что кровоснабжение 4 структур мозга через 30 мин после окклюзии сонных артерий достоверно понижалось: максимально в коре и минимально в черной субстанции. При введении IQ-1 каждые 2 сут проявилась общая для всех используемых мозговых структур тенденция постепенного повышения мозгового кровотока. Однако статистически достоверное увеличение локального кровоснабжения головного мозга выявилось только через 2 нед. после начала церебральной гипоперфузии. При сравнении значений локального кровотока у крыс групп 2 и 3 через 2 нед. гипоперфузии выявлен достоверно более высокий уровень кровотока животных с введением IQ-1 (рис. 2).

Рис. 2.

Изменения мозгового кровотока через 2 нед. гипоперфузии у крыс без фармакологической поддержки (2VO) и при курсовом введении IQ-1 (2VO + IQ-1). По оси ординат: изменения кровотока в % (отношение 14 дней/30 мин 2VO по данным табл. 1 и 2). * – p < 0.05 по сравнению с 2VO.

Для оценки вазоактивной потенции IQ-1 изменения кровотока в стриатуме крыс после введения препарата сравнивались с цереброваскулярными реакциями в ответ на введение донора NO (SNAP). Выявлены однонаправленные и равноценные вазомоторные эффекты, и эффекты SNAP в дозе 2 мкг/кг при разных уровнях перфузии мозга, однако IQ-1 в дозе 50 мг/кг вызывал более значимые цереброваскулярные реакции в условиях гипоперфузии мозга (рис. 3).

Рис. 3.

Изменения кровотока в стриатуме крыс в ответ на введение IQ-1 и донора NO (SNAP). Before 2VO: до перевязки сонных артерий; 2VO: через 14 дней гипоперфузии мозга без курсового введения IQ-1; 2VO + IQ-1: через 14 дней гипоперфузии с курсовым введением IQ-1; * – p < 0.05 по сравнению с Before 2VO. ^# – p < 0.05 IQ по сравнению со SNAP.

У животных после двухсторонней окклюзии сонных артерий, не получавших ингибитор IQ-1, степень выраженности неврологических нарушений на 8-е сут гипоперфузии составляла 6.93 ± 0.18 баллов по шкале McGraw, что проявлялось в вялости, замедленности и манежности движений, одно- и двусторонних птозах век, парезах конечностей и параличе задних конечностей у 2 из 12 наблюдаемых животных. Через 14 дней гипоперфузии мозга степень неврологического дефицита уменьшилась до 5.73 ± 0.11 баллов. На фоне курсового введения IQ-1 животным неврологический дефицит на 8-е сут ишемии составил 4.06 ± 0.08 баллов, а через 14 дней – 2.13 ± 0.18 баллов, что достоверно отличается от аналогичного показателя первой группы крыс, не получавших фармакологическую поддержку (p < 0.01).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Новыми результатами настоящей работы являются: (1) IQ-1 (ингибитор JNK) обладает вазоактивными свойствами и вызывает дозозависимое увеличение мозгового кровотока, (2) вазодилататорное действие IQ-1 усиливается в условиях хронической гипоперфузии мозга, (3) курсовое введение IQ-1 восстанавливает реактивность церебральных сосудов к гиперкапнии в условиях мозговой гипоперфузии, (4) IQ-1 улучшает неврологический статус у крыс в условиях хронической гипоперфузии мозга.

В проведенных исследованиях вазоактивное и нейропротекторное действие IQ-1 изучалось на модели билатеральной окклюзии сонных артерий, используемой для оценки эффективности коррекции гипоперфузионных нарушений в головном мозге фармакологическими препаратами [13]. Невозвратная 2-сторонняя окклюзия сонных артерий в наших опытах вызывала острое понижение кровотока в теменной коре, гиппокампе, черной субстанции и стриатуме, с более выраженным снижением в коре и с наименьшим падением в черной субстанции. Разница в степени снижения кровотока в изучаемых структурах объясняется тем, что при билатеральной окклюзии сонных артерий нарушение кровоснабжения более выражено в переднем мозге, меньше в продолговатом мозге и в базальных ганглиях, где кровообращение осуществляется двумя позвоночными артериями [22, 23]. Пониженный уровень кровотока, утрата реактивности мозговых сосудов на гиперкапнический стимул и неврологические нарушения оставались стабильными в течение 14 дней, что свидетельствует об отсутствии или низкой эффективности естественных процессов восстановления на протяжении указанного периода. Курсовое введение препарата IQ-1 в период 2-недельной гипоперфузии прогрессивно повышало кровоток во всех структурах мозга. Максимальное повышение кровотока по отношению к началу гипоперфузии выявилось в стриатуме, а минимальное – в черной субстанции. Использование препарата IQ-1 восстанавливало чувствительность мозговых сосудов к гиперкапнии и существенно улучшало неврологическое состояние животных. Эти данные свидетельствуют о выраженном вазомоторном эффекте IQ-1 при хронической ишемии мозга, проявляющимся в прогрессивном увеличении кровоснабжения мозговых структур.

Нейропротекторная активность IQ-1 подтверждена при оценке неврологического статуса животных в гипоперфузионном периоде. При курсовом введении IQ-1 у животных наблюдался менее выраженный неврологический дефицит уже через 5–7 дней гипоперфузии, и сроки его восстановления заметно сокращались. Наблюдалось достоверное снижение среднего балла неврологического дефицита по сравнению с группой животных, которым IQ-1 не вводился. Уже в первые 3–5 дней после операции было зафиксировано снижение числа животных с тяжелыми неврологическими нарушениями и соответственно увеличение числа животных с умеренной степенью неврологического дефицита. Показатели смертности были ниже у крыс, получавших IQ-1 с первого дня после перевязки сонных артерий.

Выявленные в данных исследованиях вазоактивные свойства IQ-1 ставят вопрос о механизме его дилататорного действия в отношении церебральных сосудов. Наши предыдущие исследования показали, что IQ-1 подвергается ферментативному метаболизму в микросомах печени с выделением NO [11]. Эти данные допускают возможность рассматривать IQ-1 в качестве потенциального донора NO для церебральных сосудов. Косвенным подтверждением этому является сравнительная оценка вазоактивных свойств IQ-1 и SNAP, выполненная в данном исследовании. Сосудорасширяющее действие SNAP, основанное на выделении NO, хорошо известно в отношении церебральных сосудов [24]. В настоящей работе введение SNAP увеличивало кровоток в разных структурах мозга на 17–27%. Равный по величине вазодилататорный эффект вызывал IQ-1 у животных с гипоперфузией мозга, тогда как у интактных животных вазомоторный эффект изучаемого препарата был менее выражен. Одной из возможных причин разного по величине вазомоторного эффекта IQ-1 может быть состояние ГЭБ у животных с интактными и легированными сонными артериями. Известно, что ишемия мозга вызывает нарушения ГЭБ [1], что может облегчить проницаемость IQ-1 через барьер и повысить его биодоступность для вазомоторного действия. Полученные результаты предполагают, что эффективность IQ-1 усиливается на фоне возможной повышенной активности JNK, что позволяет скорректировать цереброваскулярные нарушения и связанные с ними неврологические расстройства [12].

IQ-1 продемонстрировал выраженные вазоактивные и нейропротекторные свойства на модели хронической гипоперфузии головного мозга у крыс, вызванной невозвратным легированием сонных артерий. Мы предполагаем, что благотворное влияние IQ-1 на исход хронической гипоперфузии мозга может быть комбинированным результатом как ингибирования ферментативной активности JNK в ткани головного мозга, так и образования NO, способствующего повышению микроциркуляции в тканях головного мозга, снижению вязкости крови и улучшению эндотелиальной функции. Полученные результаты предполагают, что IQ-1 можно рассматривать как нейропротектор многоцелевого действия.