Успехи современной биологии, 2020, T. 140, № 2, стр. 140-148

ВВЕДЕНИЕ

Ранее методами масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) было показано, что в состав полипептидного комплекса эпифиза входит биологически активный пептид AEDG, обладающий теми же биологическими эффектами, что и полипептидный комплекс эпифиза (Хавинсон и др., 2017).

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии была разработана технология выделения ряда полипептидных комплексов из различных органов и тканей молодых животных (сосудов, хрящей, слизистой оболочки бронхов, головного мозга, поджелудочной железы). Кроме того, на основе анализа аминокислотного состава экстрагированных полипептидных комплексов были сконструированы и синтезированы короткие пептиды: трипептиды KED, AED, EDG, EDR и тетрапептиды AEDL, KEDW.

Полипептидный комплекс сосудов и короткий пептид KED обладают выраженными вазопротекторными свойствами и являются эффективными средствами в терапии патологии сердечно-сосудистой системы у людей пожилого возраста. KED способствовал коррекции метаболического сосудистого синдрома и заболеваний, сопровождающихся нарушением проницаемости сосудистой стенки и ломкостью капилляров (Китачёв и др., 2013). Одним из возможных механизмов действия пептида KED является эпигенетическая регуляция экспрессии генов, кодирующих белки-маркеры функциональной активности эндотелия (Козлов и др., 2016). KED при пероральном применении способствовал увеличению дистанции безболевой ходьбы на 40% по сравнению с контрольной группой (Китачёв и др., 2013). Кроме того, у этих же пациентов трипептид был эффективен в терапии васкулогенной эректильной дисфункции. После применения KED скорость кровотока в магистральных артериях полового члена статистически значимо возрастала по сравнению с контрольной группой (Китачёв и др., 2014). Кроме того, в экспериментах было установлено, что пептид KED нормализует микроциркуляцию у крыс с индуцированным пародонтитом. Применение этого пептида оказывало нормализующее влияние на состояние стенок капилляров, повышая их резистентность и проницаемость, а такжe на состояние микроциркуляторного русла слизистой оболочки десны и пародонта (Хавинсон и др., 2006). В органотипических культурах клеток, полученных от молодых и старых животных, и в диссоциированных культурах эндотелиоцитов сосудов при их старении пептид KED стимулировал синтез пролиферотропного белка Ki67, экспрессия которого снижается при старении клеток. Методами молекулярного докинга выявлена возможность связывания пептида KED с промоторными участками гена MKI67 (гена белка Ki67) (Хавинсон и др., 2014г). Пептид KED снижает синтез Е-селектина – молекулы адгезии, участвующей в формировании атеросклеротических бляшек, при старении эндотелия сосудов in vitro (Хавинсон и др., 2014а). Получены данные о повышении резистентности капилляров кожи у пациентов с гиповитаминозом под влиянием пептида KED, выражающиеся в уменьшении количества кровоизлияний по сравнению с контрольной группой при проведении манжеточной пробы Румпеля–Лееде–Кончаловского. Аналогичное повышение резистентности капилляров и нормализация микроциркуляции крови наблюдалась у больных сенильной пурпурой – заболеванием, поражающим людей пожилого и старческого возраста вследствие повышения ломкости сосудов (Хавинсон и др., 2006).

Комплекс хрящей и трипептид AED изучены при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата, в частности дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника. Использование AED способствовало увеличению количества и усилению функции кальцитонин-продуцирующих клеток щитовидной железы, улучшало трофику клеток костной и хрящевой тканей и, таким образом, способствовало нормализации метаболизма клеток этих тканей (Хавинсон и др., 2007а). Применение трипептида AED статистически значимо улучшало минеральную плотность костной ткани скелета крыс (Поворознюк и др., 2007). Выявлено, что пептид AED обладает также выраженным нефропротекторным эффектом, способствуя снижению экскреции белка и концентрации электролитов в моче (Заморский и др., 2015). Установлено, что пептид AED активирует рост клеток почек, снижая экспрессию маркеров старения р16, р21, р53 и повышая экспрессию белка молодости SIRT-6 (Хавинсон и др., 2014в). Трипептид AED в 2 раза повышал пролиферативную способность и в 1.5 раза снижал уровень апоптоза в клетках почечного эпителия при их старении (Хавинсон и др., 2014б).

Комплекс слизистой оболочки бронхов, трипептид EDG и тетрапептид AEDL регулируют функции бронхолегочной системы. Установлено, что пептид АЕDL способствовал нормализации клеточного состава ткани слизистой оболочки бронхов при анализе течения острого воспаления легких в результате бактериального повреждения, при хроническом фиброзном воспалительном процессе и сублетальном гипероксическом повреждении легких у животных (Khavinson et al., 2009). AEDL может связываться с ДНК и регулировать экспрессию генов и синтез белков, вовлеченных в дифференцировку и поддержание функциональной активности клеток бронхиального эпителия (Khavinson et al., 2014). Пептид EDG представляет собой синтетический трипептид, обладающий стресспротекторным действием. Стресспротекторные свойства пептида EDG реализуются посредством регуляции уровня биогенных аминов в головном мозге и крови, влияния на экспрессию гена c-fos и снижения активности энкефалиназ в крови (Хавинсон и др., 2007б).

Полипептидный комплекс головного мозга и трипептид EDR обладают нейропротекторными свойствами. Пептид EDR снижает апоптоз и повышает синтез серотонина в нейронах коры головного мозга при их старении. Пероральное применение пептида EDR было эффективным у больных с черепно-мозговой травмой, церебрастенией, при снижении памяти и внимания у лиц пожилого возраста (Умнов и др., 2013). Кроме того, пептид EDR обладает выраженным антиоксидантным действием (Хавинсон и др., 2013). В первичной культуре нейронов гиппокампа мышей в условиях амилоидной синаптотоксичности (модель болезни Альцгеймера) пептид EDR повышал количество грибовидных шипиков нейронов до уровня нормы (Красковская и др., 2017). После применения EDR улучшалась когнитивная деятельность макак-резусов (Macaca mulatta) (Кузнецова и др., 2019). Было также отмечено более стойкое повышение физической работоспособности в группе крыс, получавших трипептид EDR, которое не прекращалось и после окончания приема препарата (Беляева и др., 2015). EDR снижал влияние пренатального стресса на структуру поведения и когнитивные функции крыс за счет изменения активации серотонин- и дофаминергической систем и понижения активности каспазы-3 в мозге. При окклюзии сонных артерий введение EDR способствовало возрастанию содержания адренергических медиаторов ДОФА и дофамина в коре больших полушарий, адреналина и норадреналина в стволовых структурах (Менджерицкий и др., 2012; Карантыш и др., 2013).

Комплекс поджелудочной железы и тетрапептид KEDW регулируют функции поджелудочной железы. У больных сахарным диабетом 2-го типа под влиянием KEDW статистически значимо снижался уровень глюкозы натощак и при стандартном глюкозотолерантном тесте. Также отмечено уменьшение концентрации в плазме инсулина и индекса инсулинорезистентности (Коркушко и др., 2011). Применение курса KEDW приводило к снижению уровня глюкозы в крови старых самок макак-резусов. Действие KEDW также сопровождалось нормализацией уровня инсулина и C-пептида в плазме крови, что свидетельствует о его восстанавливающем эффекте нарушенной толерантности к глюкозе у старых животных (Гончарова и др., 2015). Установлено, что KEDW проникает через мембрану в ядро и ядрышко клетки (Fedoreyeva et al., 2011). Вероятно, его геропротекторное действие в отношении поджелудочной железы связано с регуляцией транскрипции генов факторов дифференцировки. Тетрапептид KEDW стимулировал экспрессию факторов дифференцировки ацинарных (Pdx1, Ptfla) и островковых (Pdx1, Pax6, Pax4, Foxa2, NKx2.2) клеток поджелудочной железы в “молодых” и “старых” культурах. Индуцируемая KEDW дифференцировка клеток поджелудочной железы может являться одним из механизмов его антидиабетического и противовоспалительного действия (Хавинсон и др., 2012).

В связи с изложенным возникло предположение, что в описанных выше полипептидных комплексах могут содержаться короткие пептиды, имеющие сходную с ними биологическую активность. При этом ранее анализ пептидного состава полипептидных комплексов, экстрагированных из тканей животных, не проводился. Цель работы – идентификация коротких пептидов в полипептидных комплексах, выделенных из органов животных, методом ультраэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (УЭЖХ-МС).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В Институте токсикологии ФМБА России методом УЭЖХ-МС был проведен анализ шести лиофилизированных препаратов полипептидных комплексов на содержание в их составе семи целевых коротких пептидов. Анализ выполнен с применением хроматографа Acquity UPLC I-class с тандемным МС-детектором TDQ Xevo (Waters, США), свидетельство о поверке № 242/8506-2018 от 31 октября 2018 г. Хроматографическая колонка Acquity UPLC BEH C18 1.7um 2.1 × 100 mm. Подвижная фаза состояла из: компонента А — 0.05% раствор трифторуксусной кислоты в воде и компонента В — ацетонитрил.

Градиентное элюирование проводили согласно табл. 1.

Скорость потока элюента составляла 0.2 мл/мин. Температура термостата колонки – 40°С. Температура термостата отделения для проб – 7°С. Объем ввода пробы – 10 мкл.

Условия МС-детектирования представлены в табл. 2.

Испытуемые и стандартные образцы анализировали в виде 1 и 0.1% водных растворов соответственно.

Критериями идентификации пептидов служили хроматографические параметры удерживания и массовые числа.

Количественные измерения выполнены методом внешнего стандарта. Концентрацию целевого компонента в испытуемых препаратах в мг/г (Х) вычисляли по формуле:

где S и S₀ – площади пиков целевого компонента на хроматограммах растворов испытуемого и стандартного образцов соответственно; С₀ – концентрация определяемого пептида в растворе стандартного образца в мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что 0.02% состава комплекса сосудов представлено трипептидом KED (табл. 3, рис. 1). Содержание AED в комплексе хрящей аналогично – 0.02% (табл. 3, рис. 2). Трипептид EDG составляет 0.028% (табл. 3, рис. 3), а тетрапептид AEDL – 0.06% (табл. 3, рис. 4) в комплексе слизистой оболочки бронхов соответственно. Комплекс головного мозга содержит в своем составе 0.024% трипептида EDR (табл. 3, рис. 5), а комплекс поджелудочной железы – 0.035% тетрапептида KEDW (табл. 3, рис. 6).

Таким образом, короткие пептиды являются минорными компонентами исследованных препаратов полипептидных комплексов. Относительное содержание коротких пептидов составляет не более 0.6 мг/г.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В составе полипептидных комплексов, выделенных из сосудов, хрящей, слизистой оболочки бронхов, головного мозга, поджелудочной железы, с помощью высокотехнологичных физико-химических методов анализа (УЭЖХ-МС) были выявлены пептиды KED, AED, EDG, AEDL, EDR, KEDW, обладающие биологическими эффектами, сходными с полипептидными комплексами. Результаты проведенного исследования дают основание полагать, что изученные короткие пептиды, идентифицированные в полипептидных комплексах, являются их активными компонентами.