Успехи современной биологии, 2020, T. 140, № 3, стр. 289-293

ВВЕДЕНИЕ

Биопленка рассматривается как структурированное сообщество бактериальных клеток, заключенное в продуцируемый им самим полимерный матрикс и адгезированное к абиогенным либо биогенным поверхностям (Costerton, 1999). В естественных условиях существования биопленка представляет собой функциональный консорциум, обеспечивающий персистенцию бактериальной популяции (Costerton et al., 1999). Способностью к образованию биопленки (биофильмогенезу) обладают как грампозитивные, так и грамнегативные бактерии, причем у патогенных штаммов бактерий эта способность связана с повышенной вирулентностью (Aparna, Yadav, 2008), и патогенные штаммы B. cereus не являются исключением (Kuroki et al., 2009). При этом процессы биофильмогенеза и спорообразования у бацилл тесно связаны – более того, биопленка способствует спорообразованию (Liaqat et al., 2013).

Способность Bacillus subtilis к образованию плавающей биопленки при культивировании на жидкой питательной среде без встряхивания была продемонстрирована ранее (Liaqat et al., 2013). Аналогичные результаты были получены нами на модели Brevibacillus laterosporus (Азизбекян и др., 2014).

Способность В. cereus к образованию биопленки изучена сравнительно слабо.

Целью настоящего исследования явилось изучение ультраструктуры плавающей биопленки, образуемой эталонными штаммами B. cereus и штаммами B. cereus клинического происхождения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы: эталонный штамм B. cereus АТСС^® 10702 (NCTC 8035/DSM 487/NRRL B-4266) из коллекции культур НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и эталонный штамм B. cereus АТСС^® 10876 (NCTC 7464/DSM 9378/NRRL B-569), любезно предоставленный проф. Р.Р. Азизбекяном, НИЦ “Курчатовский институт” – ГосНИИгенетика, а также клинические изоляты В. cereus 1208/17 и В. cereus 19/16, свежевыделенные из просветных фекалий при синдроме раздраженной кишки, любезно предоставленные к.б.н. М.А. Сухиной, ГНЦК им. А.Н. Рыжих МЗ РФ.

Экспериментальные культуры выращивались на изготавливающейся ex tempore неконвенциальной питательной композиции NBY (Nutrient Broth – 8 г/л, Bactoagar – 18 г/л, Yeast Extract – 3 г/л, все – производства Becton Dickinson, США) при 28°С в течение 72 ч. Плавающую биопленку получали в процессе культивирования в пробирках на бульоне LB (Becton Dickinson, США) при 28°С в течение 96 ч без встряхивания. Для приготовления ультратонких срезов биопленки материал фиксировали по Ито–Карновски (Ito, Karnovsky, 1968) фиксатором, состоящим из формальдегида (2%), глутарового альдегида (2.5%) и пикриновой кислоты (0.02%). Далее материал подвергали постфиксации 1% OsO₄ на 0.2 М какодилатном буфере и 1% уранилацетата на 0.2 М малеатном буфере. Фиксированный материал обезвоживался последовательно 50, 70, 96, 100% этанолом. Затем материал пропитывался смесью смолы LR White (London Resin Company Ltd., Великобритания) с 100% этанолом, чистой смолой LR White и помещался в желатиновые капсулы со смолой, которые инкубировались 1 сутки при 56°C. Ультратонкие срезы для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) изготавливались с помощью ультратома LKB-8800 (LKB AB, Швеция) и контрастировались 1% уранилацетатом на 70% этаноле и цитратом свинца. Препараты просматривались на электронном микроскопе JEM-100B (JEOL Ltd., Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Препараты для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изготавливались согласно методике, описанной ранее (Смирнова и др., 2013). Исследуемый материал не подвергался дегидратации: фиксировался 10% нейтральным формалином, высушивался под восходящим ламинарным потоком стерильного воздуха и помещался на кремниевую подложку, после чего подвергался напылению электронопроводящим слоем золота (проба Au₉₉₉) толщиной 5 нм в напылительной установке SPI Module Sputter Coater (Sputter SPEI, США). Препараты исследовались с помощью двулучевого ионно-электронного сканирующего микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, США) в режиме высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Через 48 ч роста в стационарных условиях у всех четырех изученных штаммов В. cereus была обнаружена плавающая биопленка (рис. 1), наиболее выраженная у клинического изолята B. cereus 19/16. Дальнейшее культивирование сопровождалось оседанием биопленки: подобная стабильная биопленка наблюдалась у двухсуточных культур каждого изученного штамма.

Рис. 1.

Плавающая биопленка коллекционных штаммов и клинических изолятов B. cereus: АТСС^® 10876, АТСС^® 10702, 1208/17, 19/16 (слева направо).

Динамика биопленкообразования B. cerеus из-учалась посредством ТЭМ. К 48 ч инкубации в составе биопленки всех изученных штаммов присутствовали клетки в начале споруляции, о чем свидетельствовало наличие электронно-прозрачных гранул полигидроксибутирата (рис. 2). У обоих эталонных штаммов наблюдались делящиеся, хорошо сохранившиеся бактерии (рис. 2а), и лишь у клинического изолята B. cereus 1208/17 обнаруживались сформировавшиеся споры (рис. 2б).

Рис. 2.

ТЭМ, ультратонкие срезы штаммов B. cereus: (а) – эталонный штамм АТСС^® 10876; (б) – клинический изолят 1208/17; (в), (г) – клинический изолят 19/16.

У бактерий всех клинических изолятов форма клеток была изменена, по-видимому, вследствие нарушения ригидности их клеточной стенки: на рис. 2в представлены искривленные клетки; кроме того, отмечалось присутствие протопластов и лизированных клеток.

Межклеточный матрикс, формирующий консорциум бактериальных клеток и препятствующий оседанию их на дно пробирки, выглядел как межклеточное вещество средней электронной плотности (рис. 2г). Клетки в биопленке не входили в тесный контакт друг с другом и в отдельных случаях были соединены тяжами. В межклеточном пространстве присутствовали фрагменты лизированных клеток, возможно укрепляющие матрикс биопленки, слабо визуализирующийся без специальной окраски (Данилова и др., 2018).

С помощью СЭМ (рис. 3) удавалось наблюдать биопленку В. cereus, состоящую из матрикса и погруженных в него бацилл. При этом часть бактерий эталонных штаммов (рис. 3а,б) и клинического изолята B. cereus 1208/17 (рис. 3в), находящихся в составе биопленки, имела признаки нарушения деления, выражавшиеся в виде клеток непомерно удлиненной формы. Лишь незначительная часть клеток B. cereus, как свободно расположенных, так и входящих в состав биопленки, находилась в виде споры (рис. 3а,б,в). Биопленка клинического изолята B. cereus 19/16 состояла из бактериальных клеток палочковидной формы, окруженных выраженным слоем экзополисахаридного матрикса; признаков нарушения деления бактерий, а также спор в составе биопленки и вне ее обнаружено не было (рис. 3г).

Рис. 3.

СЭМ биопленок B. cereus: (а) – эталонный штамм АТСС^® 10876; (б) – эталонный штамм АТСС^® 10702; (в) – клинический изолят 1208/17; (г) – клинический изолят 19/16.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным данным, штаммы В. cereus не способны к эффективной споруляции в условиях плавающей биопленки, что свидетельствует о том, что в жидких средах, в том числе в жидких пищевых продуктах, размножение и биопленкообразование не затруднены. Коль скоро В. cereus является широко распространенным возбудителем пищевых отравлений, имитация условий заражения пищевых продуктов и, соответственно, способов защиты от попадания патогенов представляет значительный интерес. Таким образом, плавающая биопленка может рассматриваться как модель развития бацилл в жидких пищевых продуктах: при нарушении правил их хранения бациллы способны формировать плавающую биопленку, состоящую, в основном, из вегетативных токсинпродуцирующих клеток. Как модель для изучения образования биопленки бацилл в естественных условиях плавающая биопленка имеет очевидные преимущества по сравнению с методикой получения биопленок в пластиковых планшетах (Doyle, 1999). Следует также учесть, что В. cereus, вследствие своей способности к образованию биопленки чрезвычайно устойчивая к различным бактерицидным факторам, требует значительных усилий для своей элиминации.