Успехи современной биологии, 2020, T. 140, № 6, стр. 584-600

Биосинтез

Общие черты химического строения циклопептидных токсинов опосредованы общими механизмами биосинтеза. Грибы продуцируют большинство циклических соединений с помощью нерибосомальных пептид-синтетаз (nonribosomal peptide-synthetase, NRPS) (Wang et al., 2017). В то же время, рассматриваемые токсины относят к группе синтезированных на рибосомах и посттрансляционно модифицированных пептидов (ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides, RiPPs). Следует отметить, что биосинтез базидиомами Amanita аманито- и фаллотоксинов – первый изученный рибосомальный путь образования циклопептидов в грибах (Walton et al., 2010; Matinkhoo et al., 2018).

Последовательность белков-предшественников индолсодержащих полипептидов кодируется семейством генов MSDIN и регулируется альтернативным сплайсингом. Протеолиз предшественника происходит посредством фермента пролил-олигопептидазы В (POP_B) (Walton et al., 2010; Pulman et al., 2016; Luo et al., 2018) до 34–37 аминокислот.

Кроме POP_B, известна пролилолигопептидаза типа A (POP_А), которая не участвует в биосинтезе токсинов и получила широкое распространение среди базидиомицетов, в то время как большинство аскомицетов не содержит ее. POP_B характерна только для токсинообразующих видов и не проявляет субстратной специфичности в отношении насыщенных пролином пептидов. Как и некоторые сериновые протеазы растений, POP_B обладает циклазной активностью в отношении пептидов, содержащих от 7 до, по меньшей мере, 16 аминокислот, с оптимумом в 8–9 остатков (Sgambelluri et al., 2017). Вследствие этого, после элиминации концевых аминокислотных последовательностей, она образует целый ряд моноциклически замкнутых соединений. Так, помимо ядовитых бициклопептидов, в составе некоторых видов секции Phalloideae рода Amanita выявляют еще антаманид, биологически-инертные циклоаманиды A–J₃, аманекситид, и 6 видов ядовитых виротоксинов (Luo et al., 2020). Из них антаманид – Val₁-Pro₂-Pro₃-Ala₄-Phe₅-Pro₆-Pro₇-Phe₈-Phe₉ – проявляет антидотные свойства в отношении аманитинов на культурах гепатоцитов, однако присутствует в плодовых телах в недостаточных для реализации защитного эффекта концентрациях (Montanaro et al., 1971). Тем не менее, к ограничивающим факторам клинического применения антаманида относят ингибирование эффлюкса аманитотоксина из гепатоцитов. В результате на организменном уровне его эффекты оценивают как неоднозначные (Wieland, 1983). Следует отметить, что биологическая инертность сопутствующих циклоаманидов не была обоснована, поскольку ее пристально не изучали (Wang et al., 2017). В то же время, неизвестна их роль в процессе взаимодействия с аманитотоксинами, в частности – влияние на клеточный транспорт последних.

Кроме рассматриваемых видов, протеазы с циклазной активностью участвуют в биосинтетических путях и других макромицетов. Так, известны 9 типов омфалотинов A–I Омфалота маслинового (Omphalotus olearius (DC.) Singer) и N-метилированные гимнопептиды A и B Гимнопилуса веретеноногого (Gymnopus fusipes (Bull.) Gray). Несмотря на показанную высокую антипролиферативную активность, гимнопептиды и омфалотины представляют ограниченное токсикологическое значение, поскольку описания отравлений G. fusipes отсутствуют, а в качестве основного токсина O. olearius позиционируют мускарин (Vanyolos et al., 2016; Ramm et al., 2017). Помимо этого, среди аскомицетов рода Xylaria Hill ex Schrank встречают циклические трипептиды группы ксилоалленолида с высокой цитотоксической, а также инсектицидной и противогрибковой активностями (Wang et al., 2017).

Причины наличия одинаковых токсинов у различных родов спорны. Считают, что токсинообразование бициклопептидов как результат конвергентной гомологии, возникшей в ходе однонаправленного действия естественного отбора, и теория общего предшественника маловероятны (Wang et al., 2017). Исходя из анализа последовательностей MSDIN и POP_B различных видов, показана высокая вероятность участия механизма горизонтальной передачи генов от Amanita к Galerina (Luo et al., 2018). В целом, данный механизм обмена наследственной информацией играет большую роль в изменчивости макромицетов, поскольку в “типичном” грибном геноме от 0.1 до 2.8% последовательностей ДНК могут быть результатом горизонтальной передачи генов (Wisecaver et al., 2015). В связи с тем, что кластеры, кодирующие POP_B токсинообразующих видов рода Lepiota, не похожи на последовательности геномов мухоморов, рассматривают возможное наличие дополнительных механизмов их наследования. Анализ молчащих замещений нуклеотидных последовательностей генов также указывает на единое происхождение пептидного пути в роде Amanita. При этом, их азиатские субпопуляции, потерявшие свойства токсичности, относят к более базальным, в сравнении с европейскими и американскими (Pulman et al., 2016; Luo et al., 2018).

Как и базидиомы Galerina, ни один из видов Lepiota не продуцирует фаллотоксины. Однако, геном L. subincarnata кодирует до пяти предсказанных типов нетоксичных циклопептидов. В целом, разнообразие семейства генов MSDIN в Lepiota попадает в промежуточное положение между родом Galerina, среди видов которого встречают только последовательность, ответственную за синтез α-аманитина, и родом Amanita, некоторые представители которого содержат более 30 различных видов белков-предшественников циклопептидов (Pulman et al., 2016).

Отражая предназначение и биологическую роль токсинов, показано, что ключевым фактором в активации генов, ответственных за синтез циклопептидов плодовыми телами Amanita, выступает наличие эктотрофной микоризы, а биосинтез токсина за счет экспрессии ферментов мицелием Galerina нарастает in vitro в условиях низкой концентрации глюкозы (Luo et al., 2012, 2020).

Химическое строение

Структурно группа ядовитых циклопептидов макромицетов занимает промежуточное положение между циклопептидными токсинами растений и микроорганизмов за счет своих особенностей. Так, аманитотоксины и фаллотоксины отличает от токсинов белковой и полипептидной структуры других организмов присутствие γ-гидро-ксилированных и D(+)-аминокислот, а также наличие индолил-тиоэфирной связи Trp₂-Cys₆, образующей триптатиониновый мостик второго цикла. Входящая в состав токсинов сульфоксид-сульфонная группа при триптофане Trp₂, наравне с пептидным остовом, представляет одно из главных условий их ядовитых свойств (Falcigno et al., 2001; Rodrigues et al., 2020). Следует отметить, что на данный момент триптатиониновый мостик не был найден ни в одном соединении естественного происхождения за рамками рассматриваемых. В то же время, для животных и растительных токсинов характерна циклизация за счет дисульфидных связей (Matinkhoo et al., 2018). Эти особенности позволяют циклопептидам макромицетов быть термостабильными в широком диапазоне и устойчивыми к действию большинства протеолитических ферментных систем млекопитающих.

Из деcяти известных грибных гидроксилированных бициклооктапептидов, с общей структурой Ile₁-Trp₂-Gly₃-Ile₄-Gly₅-Cys₆-Asn₇-Pro₈, к аманитотоксинам отнесены всего семь (рис. 1, 1–7 ). В состав молекулы менее токсичных полипептидов: амануллина (8), амануллиновой кислоты (9) и проамануллина (10) – вместо гидроксиизолейцина входит изолейцин (Ile₁), лишающий их токсических свойств. Все аманитотоксины, кроме θ-аманитина (5), продуцируемого лишь некоторыми штаммами G. marginata, были выделены из A. phalloides (Wieland, 1983; Walton, 2018).

Рис. 1.

Химическая структура и токсичность аманитотоксинов (адаптировано по: Wieland, 1983; Walton, 2018).

Рис. 2.

Химическая структура и токсичность фаллотоксинов (адаптировано по: Wieland, 1983; Walton, 2018).

Рис. 3.

Химическая структура и токсичность виротоксинов (адаптировано по: Loranger, 1985; Walton, 2018).

Рис. 4.

Химическая структура индол-трипептидного токсина ясплакинолида губки Jaspis johnstoni Schmidt, 1862.

Рис. 5.

Токсикокинетика аманитотоксинов. Распределение основных транспортных белков человека, среди которых пропускная способность в отношении аматоксинов показана только для органических анион-транспортных пептидов 1В3 и 1B1 (адаптировано по: Manautou et al., 2010).

Рис. 6.

Разнонаправленность реализации цитотоксического эффекта аманитином (а) и фаллоидином (б).

Последовательность аминокислотных остатков аманитотоксинов заложена в двух генах, отличных для α- и β-аманитина. Показано, что различия между этими двумя токсинами (Asn₇ или Asp₇), происходит не из-за посттрансляционной модификации (например, деамидирование Asn в Asp), тогда как лабораторно превращение β- в α-аманитин достигают амидированием в присутствии этоксикарбонилхлорида (CAS 541-41-3) (Wieland, 1983; Wisecaver et al., 2015). В работе (Pulman et al., 2016) отмечено, что уровни β-аманитина, представленные в некоторых исследованиях, могут быть ложно завышены, из-за артефактного деамидирования α-аманитина. Остальное разнообразие аманитотоксинов обусловлено вариабельностью посттрансляционного гидро-ксилирования и отражает отношения структура–активность.

В части, касающейся сульфоксида, его восстановление до сульфида или тиоэфира и окисление до сульфона не снижают токсичности для мышей. В то же время, левовращающие (S)-сульфоксидные формы аманитотоксинов в 20 раз менее токсичны в сравнении с (R)-энантиомерами (Ma-tinkhoo et al., 2018). Кроме сульфоксид-сульфонной группы, еще одним важным элементом токсичности бициклопептидов считают наличие β-поворота при Ile₄, посредством которого возникает изменение направления полипептидной цепи (Baumann et al., 2008). Кроме этого, α- и β-аманитин содержат 4,5-дигидрокси-L-Ile₁. В то же время, γ-аманитин представляет собой α-аманитин, только с наличием 4(γ)- и отсутствием 5(δ)‑гидроксильной группы при Ile₁, а δ-аманитин – наоборот, с наличием только 5(δ)-ОН. Аналогично, ε-аманитин представляет β-аманитин без 5(δ)-OH.

Триптаминовый центр аманитотоксинов гидро-ксилирован в С₅-положении (5-OH-Trp). 5-OH при Trp₂ не относят к необходимому условию токсичности. Так, аманинамид и аманин, представляя собой α- и β-аманитин без 5-OH при Trp₂, сравнимы с ними по уровню среднесмертельных доз. Однако, направленный на выявление 5-OH-Trp₂, тест Вилланда–Мейкснера, как наиболее простой метод предварительного анализа на присутствие индолсодержащих циклопептидов в составе макромицетов, не выявляет аманинамид и аманин (A. virosa, L. brunneoincarnata) и выдает ложноположительные результаты при наличии 5-МеО-псилоцибина (Walton, 2018).

Разница по Asn/Asp₇ обусловливает кислотно-основные различия среди токсинов (Montanaro et al., 1971). Однако, ввиду отсутствия данных о влиянии точек ионизации на токсикокинетику, кроме способности β-аманитина к раздражению слизистых оболочек, трудно сделать определенные выводы относительно особенностей токсикологического профиля отдельных соединений.

Среднесмертельные дозы наиболее ядовитых аманитотоксинов для мелких грызунов варьируют от 0.2 до 0.6 мг/кг, что может быть экстраполировано на людей, несмотря на видовые различия. При ретроспективной оценке токсичности для человека было показано, что 0.1 мг/кг α-аманитина представляет абсолютно эффективную дозу по критерию развития крайне тяжелой фульминантной печеночной недостаточности (Yilmaz et al., 2015).

Фаллотоксины включают в свой состав как минимум 7 индивидуальных соединений с общей аминокислотной последовательностью: Ala₁-Trp₂-Leu₃-Ala₄-Thr₅-Cys₆-Pro₇ (рис. 2). Суффикс -аци в наименованиях токсинов: фаллацин (13), фаллисацин (14) и фаллацидин (16), указывает на то, что они обладают кислыми свойствами вследствие замещения Asp₅ для Thr₅. Суффикс -дин – на присутствие дигидрокси-Leu в положении 3: фаллоидин (11), тогда как -зин указывает на наличие тригидрокси-Leu₃: фаллизин (15) (Wieland, 1983; Loranger, 1985; Walton, 2018). При парентеральном введении ЛД₅₀ этих циклопептидов составляет от 1.5 до 4.5 мг/кг, кроме менее токсичного профаллоина (17) – ЛД₅₀ > 20 мг/кг.

Из числа фаллотоксинов фалацидин и фаллоидин относят к первично зрелым токсинам, в то время как остальные – к продуктам посттрансляционной модификации. Вариабельность их аминокислотных последовательностей заключена в положениях 4: Ala или Val, и 5: Thr или Asp, что обусловлено дуализмом кодирующих генов (Pulman et al., 2016).

К важным заместителям, влияющими на отношения структура–активность фаллотоксинов, относят боковые радикалы при Ala₁, Trp₂, Cys₆ и Pro₇. В то же время, количество гидроксилов при Leu₃, как и модификация их различными заместителями, не влияет на уровень токсичности. Норфаллоин, который структурно отличает от фаллоина наличие норвалина вместо изолейцина Ile в положении 3, сохраняет токсичность, подтверждая, что, в отличие от аматоксинов, гидро-ксилы не играют значимой роли в связывании фаллотоксинов. Тем не менее, показано, что для сохранения ядовитых свойств при Leu₃ необходима разветвленная боковая цепь (Falcigno et al., 2001). Кроме этого, замена дигидрокси-L-Leu₃ на D-изомер в фаллисацине или фаллизине устраняет их токсичность, что отражает важность стерической конфигурации данного участка в целом. Изменение соседнего D-Ala в положении 4 на L-Ala также снижает ядовитые свойства токсинов (Matinkhoo et al., 2018).

Как и аматоксины, фаллотоксины содержат триптатиониновую связь, однако искусственно синтезированные бициклические гексапептиды и октапептиды на основе фаллоидина нетоксичны. Расщепление мостика Trp₂-Cys₆ устраняет токсичность фаллотоксинов (Falcigno et al., 2001). Отмечено, что они устойчивы в кислой среде в меньшей степени в сравнении с аманитотоксинами, поэтому могут частично разрушаться в желудке (Wieland, 1983). Отсутствие 5-ОН при Trp₂ не позволяет выявлять их посредством теста Вилланда–Мейкснера.

Замена Ala₁ лишает токсины ядовитых свойств. Пролин в положении 7 фаллотоксинов содержит 4-(S)-гидроксил, то есть Pro₇ – цис-изомер. В активных аманитотоксинах пролин располагает транс-конфигурацией, в то время как фаллотоксины с 4-(R)-ОН-Pro₇ лишены ядовитости. Сама гидроксильная группа также вносит вклад в сохранение токсичности фаллотоксинов, о чем свидетельствует разница между ЛД₅₀ фаллоина (12) и профаллоина (17), а также отсутствие токсичности у модифицированного до ацетил-Pro-фаллоидина (Zanotti et al., 1999).

Виротоксины, помимо A. virosa, выделены еще из плодовых тел A. subpallidorosea Hai J. Li и A. suballiacea (Murrill) Murrill (Wei et al., 2017). В наибольшем количестве среди виротоксинов эти виды содержат вироизин (20) и вироидин (21). Стереоизомер последнего – алавироидин (18), экстрагированный из A. suballiacea, содержит 2-(S), 4-(S)-дигидрокси-Leu₃ вместо изомера 2-(S), 4-(R) – у вироидина, хотя и не отличается от него по активности (рис. 3). Показано наличие дезоксовироидина (22) у собранного в Китае A. exitialis (Deng et al., 2011), однако, Вэй с соавт. (Wei et al., 2017) ставят эти данные под сомнение.

Структуры виротоксинов (18–23) представляют варианты аминокислотных последовательностей фаллоидина, в положении 4 которых произведена заменена Ala на Val. Отсутствие ковалентно-замкнутого триптатионинового цикла не лишает виротоксины ядовитых свойств, что может быть объяснено сохранением конфигурации молекулы за счет ионного взаимодействия. Методом ядерного магнитного резонанса показано, что виротоксины сохраняют стабильную трехмерную структуру, более сходную с бициклическими фаллотоксинами, чем с моноциклизованными по триптатиониновому мостику, которые присутствуют в плодовых телах как популяция нетоксичных конформеров (Bhaskaran, Yu, 1994). Вне царства грибов похожей конфигурацией домена взаимодействия, также лишенной 2 ковалентно-замкнутого цикла, обладает ясплакинолид (рис. 4). В свою очередь, этот трипептид морской губки Jaspis johnstoni Schmidt, 1862 реализует механизм токсичности подобно фаллотоксинам (Pospich et al., 2020).

Тем не менее, при сравнении с фаллотоксинами, наличие у виротоксинов метилсульфинил-Trp₂, дигидрокси-Pro₇ и D-Ser₆ придает им отличительные особенности в ходе реализации токсического эффекта (Zanotti et al., 1999; Walton, 2018). На основе синтетических производных вироизина Занотти с соавт. (Zanotti et al., 1999) пришли к выводу, что гидроксильная группа при D-Ser₆ важна, в сравнении с другими перечисленными остатками, в меньшей степени.

На основании ранних работ Виланда, а также совсем недавних, из области секвенирования генома видов, продуцирующих аманитины, известно, что токсинам с индольным центром сопутствуют многие, возможно сотни, циклических пептидов, биологическую активность которых еще предстоит оценить (цит по: Walton, 2018). Так, недавно при помощи геном-ориентированного подхода, из 4 смертельно ядовитых мухоморов секвенировано и выделено 12 новых циклических пептидов (циклоаманиды G₁–J₃), из которых больше половины не дают отдельных пиков в ходе высокоэффективной жидкостной хроматографии (Luo et al., 2020).

Токсикокинетика

К причинам, по которым фаллотоксины не ядовиты при пероральном приеме, относят отсутствие поглощения их клетками кишки, следовательно, и способности к пенетрации энтерогематического барьера. Тем не менее, гибель животных в ходе моделирования интоксикаций при парентеральном способе введения фаллоидина наблюдают в более ранние сроки, около 2–5 ч, в сравнении с аманитином – более 30 ч. Причисляя виротоксины к моноциклическим вариантами фаллотоксинов, считают, что с точки зрения реализации токсического эффекта они ведут себя также (Oda et al., 2005).

В условиях интоксикации аманитотоксинами, как цитотоксическими агентами, повреждению подвержены все органы и системы (Зарафьянц, 2016). В отличие от α-, β-аманитин оказывает выраженный раздражающий эффект, в том числе на органы дыхания и зрения, и абсорбирует через кожные покровы и слизистые оболочки (Kaya et al., 2014). При пероральном поступлении аманитотоксины обнаруживают в крови через 90–120 мин после начала интоксикации. Они не связывают белки плазмы крови, до 60% токсинов кумулируют в печени и, не подвергаясь метаболизму, элиминируют из организма в неизменном виде. Показано, что период их полуэлиминации варьирует от 26.7 до 49.6 мин, а общий клиренс – от 2.7 до 6.2 мл/кг мин (Fiume et al., 1977; Jaeger et al., 1993).

Вследствие гепатоэнтеральной рециркуляции (ГЭР) токсины в желчевыводящей системе формируют более значимый пул, чем внутрисосудистый (Sun et al., 2019). При этом, соотношение их концентраций в крови и желчи дозозависимо меняется. Показано, что при внутрипортальном введении α-аманитина свиньям в дозах 0.35 и 0.15 мг/кг, пиковая концентрация его в плазме крови составляет в среднем 220 и 80 нг/мл, в то время как в желчи – 153 и 100 нг/мл соответственно. Однако, между большим кругом кровообращения и портальной венозной сетью его содержание не отличается. Токсин выявляют в плазме крови в течение 30–36 ч, в то время как в желчи он присутствует в 1.5–2 раза дольше, а в моче – до 4 сут (Thiel et al., 2011).

Помимо экспериментальных исследований, клинически было показано, что в период с 8 ч и до 3–4 сут после начала интоксикации концентрация аманитина в моче может превышать сывороточные уровни в 100–150 раз, при этом до 80% токсина элиминирует через клубочки в отсутствии реабсорбции (Kieslichova et al., 2018). Частичное депонирование нефроцитами до 3% от всего циркулирующего токсина приводит к развитию тубулярного некроза, который клинически проявляется острым почечным повреждением с анурией, а также присоединением к нарушениям кислотно-основного состояния (КОС) канальцевого ацидоза (Мусселиус, Рык, 2002).

Аманитотоксины обладают ограниченной способностью проникать в некоторые компартменты распределения, ограниченные плотными барьерами, такими как гематоэнцефалический (ГЭБ) и гематоплацентарный. Несмотря на то, что аманитин не проникает через ГЭБ, течение печеночной энцефалопатии в своих конечных стадиях сопровождается измененным сознанием, метаболической комой, отеком головного мозга, а непосредственно перед смертью – скачком внутричерепного давления, которое может приводить к смерти по механизму гибели мозга. Тем не менее, при интравентрикулярном введении аманитотоксины также обладают высокой токсичностью. Так, для крыс внутрижелудочковая токсичность α-аманитина составляет ЛД₅₀ = 10 мкг/кг (Montanaro et al., 1971). При этом, его внутригиппокампальное введение вызывает нарушения долговременной памяти у крыс уже в дозе 25 пг/особь, что используют как инструмент в исследовании ее белковой природы (Igaz et al., 2002).

Несмотря на общепризнанное представление об отсутствии пенетрации фаллотоксинов из просвета кишки в кровоток, не исключена возможность их резорбции в условиях энтеральной недостаточности и нарушенной работы барьера. Кроме этого, известны экспериментальные данные, утверждающие обратное. Так, в исследовании (Sun et al., 2018) при энтеральном введении собакам от 1.0 до 4.0 ЛД₅₀ экстракта A. exitialis помимо аманитинов в желчи и сыворотке крови в течение 2 сут определяли фаллацидин, а скорость его элиминации из сосудистого русла в среднем составляла Т_1/2 = 0.62 ч. Не отрицая того, что пенетрация фаллацидина в кровоток у собак может быть опосредована межвидовыми различиями и не отражать реальное положение вещей у человека, подобная возможность должна быть подвергнута более детальной клинической проверке.

Поглощение клетками

В целом, уровень способности токсинов бициклопептидной структуры к проникновению в ткани связывают с специфическим транспортом (рис. 5). Для перорально поглощенных аманитинов печень представляет основной орган-мишень и первый орган, в который они попадают из желудочно-кишечного тракта посредством портальной венозной сети. Более высокая биодоступность аманитотоксинов для гепатоцитов, в сравнении с другими типами клеток, в первую очередь обусловлена наличием специфических для органа транспортеров парных желчных кислот: органического анион-транспортирующего полипептида 1B3 (OATP1B3) и Na⁺ –таурохолат-котранспортерного полипептида (NTCP), локализованных на синусоидальных мембранах гепатоцитов. Так, константа Михаэлиса OATP1B3 в отношении аманитина варьирует от 3.1 до 4.2 мкМ/л, а гибель половины клеток, экспрессирующих его на поверхности, наблюдают in vitro в течение 48 ч при культуральной концентрации токсина 0.1 мкМ/л (Letschert et al., 2006).

Роль OATP-опосредованного поглощения в процессе реализации токсического действия бициклопептидов была продемонстрирована у генетически нокаутированных грызунов. Так, OATP1B3-отрицательные крысы были полностью резистентными к действию аманитина, в то время как были чувствительны к фаллацидину. Между тем, при моделировании интоксикаций у крыс, в транспорте фаллотоксинов задействован преимущественно OATP1B2 (Lu et al., 2008). В случае человека, в качестве основного белка-переносчика фаллотоксинов позиционируют OATP1B1 – Кm = 6.0 мкМ/л (Kaplan et al., 2008).

Наличие избирательного транспорта дает повод для обоснования способности конкурирующих за переносчики соединений проявлять защитный эффект в отношении бициклопептидов. К числу применяемых в клинической практике средств, снижающих взаимодействие аманитина с OATP1B3, относят бензилпенициллин (IC₅₀ = 25 мкМ/л) и инъекционные формы силибинина (IC₅₀ = 0.4 мкМ/л). Кроме этого, сравнимую эффективность могут оказывать рифампицин (IC₅₀ = 0.8 мкМ/л) и циклоспорин А (IC₅₀ = 0.3 мкМ/л) (Letschert et al., 2006). В то же время, амфотерицин B делает клетки более проницаемыми и, следовательно, более чувствительными к аманитину. Относительно NTCP-переносчика существует мнение, что его роль в транспорте аманитотоксинов может быть преувеличена. Тем не менее, в клинической практике рекомендуют средства, направленные на ингибирование NTCP, к числу которых относят глюкокортикостероидные препараты (Garcia et al., 2019).

С момента открытия первого OATP-переносчика в 1994 г. охарактеризовано около 300 их представителей у более чем 40 видов млекопитающих, включая 11 – у человека. На основании 40% идентичности аминокислотных последовательностей OATP, среди них у человека выделяют шесть групп (Manautou et al., 2010). Семейство OATP1B3 описаны как pH-зависимые гепатобилиарные транспортеры, чья активность может сильно варьировать в условиях смещения локального кислотно-основного состояния (Thomson et al., 2016). Показано, что в условиях нарастания тканевого ацидоза происходит стимуляция OATP1B3-опосредованного транспорта парных желчных кислот и стероидных глюкуронидов, скорость которого, достигая при рН = 6.5 уровня 160%-ной исходной активности, в дальнейшем снижается. В то же время, в условиях щелочного сдвига, скорость транспорта убывает, принимая минимальные значения при рН > 8 (Li et al., 1998).

В настоящий момент механизмы работы органических анион-транспортирующих полипептидов не до конца ясны. В качестве противоиона в работе OATP-переносчиков был определен бикарбонат (Powell et al., 2014). В других исследованиях также было показано, что OATP-опосредованный транспорт связан с оттоком бикарбоната, однако в качестве противоиона был представлен восстановленный глутатион (Li et al., 1998). Тем не менее, подобные результаты в других работах были плохо воспроизводимы, поэтому вопросы дальнейшего поиска тонких механизмов работы переносчика, а также способов воздействия на него через градиент противоионов, остаются открытыми (Mahagita et al., 2007; Thomson et al., 2016).

Ген, определяющий OATP1B3-переносчик, известен популяционной изменчивостью. Уровень экспрессии анион-транспортного полипептида 1B3 повышен у лиц кавказской национальности (Burt et al., 2016). Кроме этого, экспрессия белка в высоких количествах характерна для некоторых клеточных элементов новообразований. Рассматривают несколько видов генетических полиморфизмов OATP1B3, при этом частоты аллелей, значимых для снижения транспорта ксенобиотиков, достигают 10–15% (Powell et al., 2014). Несмотря на отсутствие полноценных исследований, носители измененных типов белков-переносчиков среди людей могут быть менее чувствительны к токсическому действию бициклопептидов.

Ингибирование переносчика достижимо как в условиях прямого, так и опосредованного воздействия, которое может быть осуществлено за счет регуляции его гликозилирования, убиквинирования и фосфорилирования. Считают, что уровни гликозилированного пула переносчика варьируют с возрастом и могут играть роль в его пропускной способности (Thomson et al., 2016). Показано, что повышенное фосфорилирование OATP1B3 после активации протеинкиназы C форбол-12-миристат-13-ацетатом (CAS 17673-25-5) сопровождает быстрое подавление транспортной функции белка. Функциональные последствия посттрансляционной модификации посредством присоединения молекул убиквинона для функциональной активности OATP1B3 все еще остаются неясными (Powell et al., 2014).

Тем не менее, по данным многих исследований почти все типы тканей млекопитающих чувствительны к аманитотоксинам и фаллотоксинам, что указывает на участие альтернативного переносчика, или другого вида транспорта (Зарафьянц, 2016; Wieland, 1983; Loranger, 1985). Гибель 50% инкубируемых элементов клеточных культур нефроцитов, экспрессирующих на своей поверхности только OATP1B1, наблюдали при концентрации аманитина 10 мкМ/л. В свою очередь, это может быть объяснено высоким уровнем гомологии последовательностей 1B1 и 1B3 семейств транспортных комплексов, которая может составлять до 80% (Lu et al., 2008). Для индукции апоптоза не экспрессирующих на мембране и 1B1-, и 1B3-типы транспортных белков необходимы большие концентрации токсина. При повышении количества последнего в конечном счете также наблюдают дистрофические изменения и клеточную гибель (Letschert et al., 2006). Помимо этого, факт чувствительности некоторых растений к бициклопептидам указывает на возможное участие иных вспомогательных механизмов (Walton, 2018).

В условиях целостного организма ядовитые соединения могут быть подвергнуты реакции токсификации. Например, белковые конъюгаты бициклопептидов могут быть в 50–100 раз токсичнее, чем нативные соединения. Следует отметить, что в число реакционноспособных протеинов не входит альбумин (Fiume et al., 1977). Помимо этого, попытка создать моноклональные антитела в их отношении оказалась беспрецедентным примером того, как иммуноглобулины, или их фрагменты, могут усиливать активность токсина (Faulstich et al., 1988). Считают, что механизм поглощения некоторых конъюгатов токсин–белок может быть опосредован через эндоцитоз (Walton, 2018).

Ингибирование транскрипции аманитотоксинами

Попадая внутрь клетки, аманитотоксины инактивируют как ДНК-зависимую РНК-полимеразу II RNApII (α-аманитин), так и РНК-полимеразу III RNApIII (β-аманитин), связываясь с аминокислотными остатками С-концевого ретинол-связывающего участка RPB₁ (retinol binding protein) и триггерной петли запуска TL (trigger loop). Так, α-аманитин проявляет сродство к RNApII – Kd = 6.4 ×10^–9 М/л при 37°C в концентрации 10 мкг/л, ингибируя ее активность на 60–70% и снижая синтез гетерогенной ядерной – предшественника матричной (информационной) РНК. В то же время, RNApIII опосредует синтез рибосомной 5S, транспортной и других малых РНК (Montanaro et al., 1971; Nguyen, 1996). Критическое значение в ингибировании синтеза полимеров нуклеиновых кислот отведено задействованности His₁₀₈₅ участка TL. Так, показано, что замена гистидина в положении 1085 фермента на аланин или фенилаланин делает его высокоустойчивым к α-аманитину (Kaplan et al., 2008).

Известно несколько модельных соединений, которые снижают ДНК-зависимую РНК-активность (Garcia et al., 2019). Однако, в сравнении с ними аманитотоксины проявляют на порядок превосходящую токсичность за счет индукции повышенной скорости деградации RNApII, при этом напрямую не активируя систему протеолитических клеточных ферментов. Показано, что его медленное и необратимое связывание с участками RPB₁ и TL представляет сигнал для индукции биодеградации. Этот механизм позволяет аманитину, в отличие от актиномицина D и 5,6-дихлор-1-бета-D-рибофуранозилбензимидазола (CAS 53-85-0), проявляющим сходный уровень афинности к данному домену, снижать период полужизни фермента. Кроме этого, время полужизни RNApII при различных концентрациях α-аманитина составляет в среднем: 5 мкг/л – 8 ч, 20 мкг/л – 4 ч, 100 мкг/л – 2 ч (Nguyen, 1996). Ускорение биодеградации лимитированных пулов ДНК-зависимых РНК-полимераз и рибонуклеиновых полимеров выступает серьезным ограничением временных рамок в реализации широкой мощности средствами с потенциальной антидотной эффективностью (Garcia et al., 2019).

После воздействия аматоксина клетки страдают от дефицита функционально-активных белков, что приводит к недостатку транскрипционной информации и к их гибели. Наличие целой цепочки событий, а также медленно деградирующего пула резервной мРНК объясняет, почему некроз печени происходит с некоторой задержкой. К критическим факторам для выживания гепатоцитов отнесен период времени, в течение которого токсины присутствуют внутри клетки в концентрации, достаточной для ингибирования процесса транскрипции (≥1 мкг/л), что, в свою очередь, зависит от их содержания во внеклеточной среде и пропускной способности OATP1B3 (Lu et al., 2008).

Помимо антиферментного механизма действия, аманитотоксины, как и другие бициклопептиды грибов, за счет переходной сульфоксид-сульфонной группы при триптофане оказывают мощный прооксидантный мембранотоксический эффект. При прямом взаимодействии с мембранами митохондрий это вызывает нарушение окислительного фосфорилирования и приводит к активации лизосом, что также привносит свой вклад в цитотоксическое действие. Кроме этого, интоксикация аманитином уже в малых дозах, по сравнению со среднесмертельными, приводит к снижению концентрации внутриклеточного глутатиона и повышению продуктов перекисного окисления липидов (Zheleva et al., 2007).

Совокупность механизмов действия амато-ксинов индуцирует гибель клетки, которая происходит преимущественно через TNF- и p53-индуцированный апоптоз (рис. 6а). Активация протеина р53 при блоке RNApII происходит с помощью двух независимых механизмов. Она связана, во-первых, с уменьшением ядерного экспорта мРНК, и, во-вторых, – опосредована запуском фосфорилаз, опосредующих присоединение фосфорного остатка к триггеру ее запуска – Ser₁₅ (Derheimer et al., 2007).

На клеточном уровне наблюдают отсроченную фрагментацию и конденсацию хроматина, а на тканевом и органном – диссеминированные геморрагические изменения и жировое перерождение (Зарафьянц, 2016). При фаллоидиновом синдроме выделяют 2 пика гибели. Гибель в гастроинтестинальный период интоксикации связывают с нарушениями водно-электролитного баланса и кислотно-основного состояния, а также развитием гипогликемии и прямым повреждением миокарда аманитином. В печеночную стадию летальные исходы связаны с развитием труднокупируемых кровотечений на фоне коагулопатии и синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, а также неврологическими нарушениями, опосредованными отеком мозга (кома, судороги), реже – вследствие кардиомиопатии или инфекционных осложнений (Мусселиус, Рык, 2002; Krasnodębski et al., 2016).

Прорыв последнего десятилетия в исследованиях, связанных с изучением рецепторного участка взаимодействия аманитина, представляет многообещающее условие для успешного поиска специфических средств терапии. Обнадеживающими могут быть данные последних исследований полимиксина В, оказывающего “молчаливое” сродство к ДНК-зависимой РНК-полимеразе (Garcia et al., 2019), которое, впрочем, оспаривают (Rodrigues et al., 2020). В то же время, использование в качестве средства этиотропной терапии фаллоидинового синдрома уже одобренного для клинического применения препарата побуждает исследователей к более детальной оценке его эффективности.

Нарушение работы микрофиламентов фаллотоксинами и виротоксинами

Цитотоксичность фаллотоксинов и виротоксинов возникает в результате их взаимодействия с актином (Wieland, 1983; Falcigno et al., 2001). Как известно, актин – это белок, который образует микрофиламенты цитоскелета и сократительного аппарата мышечной ткани. Таким образом, он участвует во многих типах клеточного движения, включая цитокинез, везикулярный транспорт, движение органелл и поддержание общей формы клетки. Актин существует в динамическом равновесии между мономерными формами (G-актин) и полимером (F-актин).

Одним из ключевых моментов равновесия считают реакцию гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ). В ходе деполимеризации F-актин проходит по крайней мере через три различных состояния, в зависимости от кинетики дефосфорилирования АТФ, в реакции которых большую роль отводят конформационным изменениям остатков His₇₃ и Arg₁₇₇.

Фаллотоксины связывают все формы актина во всех типах эукариотических клеток и их компартментах, включая цитоплазму, органнеллы и ядро. В качестве участка связывания с актином выступает домен токсина, состоящий из остатков Pro₇, Ala₄ и сульфоксид-сульфонной группы, чье сродство к клеточным филаментам определено показателем Kd = 20 нМ/л (Walton, 2018). В присутствии токсина скорость реакции полимеризации актина может возрастать до 30 раз. Считают, что фаллоидин посредством отмены высвобождения фосфата из F-актина может как стабилизировать полимер, так и ингибировать его деполимеризацию (Oda et al., 2005). Наиболее вероятным путем ингибирования высвобождения фосфата фаллоидином полагают его взаимодействие с участком His₇₃ и Arg₁₇₇. Стехиометрия связывания фаллоидина подлежит дальнейшему уточнению, однако по последним данным, доменов стабилизации актина может быть несколько. Отмечено, что актин в составе мышечных волокон гораздо менее чувствителен к токсину, что связывают с гидрофобным характером окружающих этот сайт аминокислотных остатков (Pospich et al., 2020).

В результате блока деполимеризации актина в мономерные формы, возникают нарушения функции цитоскелета, что сопровождает падение скорости всех видов внутриклеточного транспорта, а также активация лизосом (Falcigno et al., 2001). Кроме этого, блок деполимеризации актина напрямую и опосредованно, через активность каспаз и кальпаинов, связан с деградацией ДНК. Коллапс актиновых филаментов также нарушает необходимое поверхностное механическое напряжение клеток. Вследствие этого возникает разрушение межклеточных контактов, которое осуществляет вторичную индукцию клеточной гибели (White et al., 2001). Структурным перестройкам филаментов сопутствуют нарушения внутриклеточного переноса ионов и повышение их концентрации в сосудистом русле при утечке из вакуолизированных клеток (рис. 6б). Возникающая в результате электролитных погрешностей электрическая нестабильность миокарда на ранних сроках интоксикации фаллотоксинами представляет непосредственную причину гибели животных (Loranger, 1985). Тем не менее, с учетом тканевой избирательности, опосредованной OAT1B1-переносчиком, токсин причисляют к гепатотоксичным ядам (Wieland, 1983).

Ультрафиолетовые спектры взаимодействия виротоксинов с актином отличны от таковых при инкубации клеток с фаллотоксинами, что отражает наличие различной кинетики в ходе реакции. Считают, что, кроме этого, виротоксины по неуточненному механизму могут оказывать прямое повреждающее действие на биологические мембраны. В ходе моделирования экспериментальной патологии это приводит к большим, по сравнению с аматоксинами и фаллотоксинами, дистрофическим, геморрагическим и некротическим изменениям (Loranger, 1985).

Эволюционное значение

На данный момент мало что известно о биологической роли и селективных преимуществах синтеза токсичных бициклопептидов макромицетами. В то же время, синтез вторичных метаболитов, не участвующих в основном обмене, представляет энергозатратный процесс, который биологически не выгоден. Плодовые тела высших грибов – относительно кратковременные структуры, которые как источник питательных веществ привлекают множество различных микофагов. Противоречием в реализации антифидантной защиты от микофагов выступает то, что бициклопептиды безвкусны (по крайней мере, для человека), а гибель носит отсроченный характер. С этой точки зрения, в сравнении с бициклопептидами, в реализации антифидантной стратегии большей эффективностью обладают вызывающие отвращение горькие быстродействующие токсины, либо метаболиты с эметическим (рвотным) эффектом. Одно из возможных объяснений такого противоречия могло бы состоять в том, что к бициклопептидам чувствительны некоторые мухи, нематоды и слизни. Кроме этого, чувствительность РНК-полимераз неядовитых грибов превышает таковую в 100–150 раз в сравнении с токсин-положительными видами (Walton, 2018). В связи с этим полагают, что токсины циклопептидной структуры нацелены на биологические виды с медленным передвижением, а млекопитающие могут быть побочной жертвой в давней борьбе между циклопептид-продуцирующими грибами и их экологически значимыми антагонистами (Wisecaver et al., 2015).