Успехи современной биологии, 2021, T. 141, № 1, стр. 32-39

ВВЕДЕНИЕ

Среди пульмонотоксикантов, обладающих ацилирующим действием, можно выделить фосген, перфторизобутилен (ПФИБ), метилизоцианат и др. Данные соединения могут образовываться при аварийных ситуациях на химически опасных объектах. Образование ПФИБ может происходить при термическом разложении фторсодержащих полимеров, например фторопластов (Tsai, 2009). Ингаляционное воздействие токсикантов этой группы, в том числе и ПФИБ, в концентрациях выше пороговых приводит к нарушению функции дыхательной системы, вплоть до развития острого легочного отека и летального исхода. На сегодня однозначно эффективных схем коррекции острого легочного отека, вызванного интоксикацией пульмонотоксикантами, обладающими ацилирующим действием, не разработано (Башарин и др., 2019).

В случае невозможности увеличения поступления кислорода через поврежденный аэрогематический барьер (АГБ) у пострадавших можно снизить потребление кислорода путем проведения седативной терапии. Данный подход рекомендован в действующем руководстве по терапии дыхательной недостаточности (Указания…, 2019). В качестве фармакологических средств, которые вызывают состояния седации, можно рассматривать препараты из группы фенциклидина (кетамин), центральные α₂-адреномиметики (дексомедетомидин), бензодиазепины (мидазолам) и др. При моделировании токсического отека легких (ТОЛ) на лабораторных животных целесообразно изучать эффекты фармакопейных ветеринарных препаратов, обладающих седативным действием – ксилазина и золетила (Смирнова и др., 2012; Корнюшенков, 2013; Старокожева, Климов, 2017).

Ксилазин – агонист α₂-адренорецепторов, обладающий седативным действием (Корнюшенков, 2013), зарегистрирован в РФ для проведения хирургической и анестезиологической практики у мелких лабораторных животных. Механизм седативного действия главным образом связан со стимуляцией постсинаптических α₂-адренорецепторов голубого пятна ствола головного мозга. Доза ксилазина, которую, согласно рекомендациям, используют для седации животных во время операции, составляет 10 ± 1.4 мг/кг, длительность седативного эффекта составляет до 1 ч (Корнюшенков, 2013; Старокожева, Климов, 2017).

Золетил (тилетамина гидрохлорид + золазепам) зарегистрирован в РФ как комплексный неингаляционный анестетик для ветеринарии (Смирнова и др., 2012). Тилетамина гидрохлорид – конкурентный антагонист, блокирующий сайт связывания NMDA-рецептора с глутаматом. Взаимодействие тилетамина гидрохлорида с рецептором приводит к закрытию ионного канала и ингибированию его активности. Данное состояние в медицине описано как диссоциативная анестезия (каталепсия, амнезия и аналгезия) (Смирнова и др., 2012). Тилетамина гидрохлорид, как и другие производные фенциклидина, может вызвать судороги, поэтому его комбинируют с бензодиазепинами (Flecknell, 2009). Золазепам – второй действующий компонент в препарате золетил. Данный препарат относят к группе бензодиазепинов – соединений, обладающих гипнотическим, седативным и антиконвульсантным действием. Эти эффекты обусловлены блокированием бензодиазепиновых рецепторов (сайт ГАМК-рецептора) (Смирнова и др., 2012). Антиконвульсантная активность золазепама позволяет применять препараты на основе тилетамина у животных (Flecknell, 2009). Седативный эффект при введении золетила наступает через 6–7 мин после однократного внутрибрюшинного введения препарата в дозе 15 мг/кг. Длительность седации составляет около 2–3 ч (Савенко и др., 2012).

Цель исследования – оценка влияния седативных ветеринарных препаратов ксилазина и золетила на проявления ТОЛ у крыс и кроликов при интоксикации ПФИБ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар, кроликах-самцах породы Советская шиншилла. Животные были разделены на группы: контроль (К), интоксикация (И), опыт 1 (получали в качестве лечения ксилазин – И+К) и опыт 2 (получали в качестве лечения золетил – И + З). При проведении экспериментов выполняли требования Правил надлежащей лабораторной практики (ГОСТ 33044-2014 “Межгосударственной стандарт”).

ПФИБ получали путем термодеструкции фторопласта-4 (ФП-4) в камере для пиролиза при температуре 620–680°С в течение 4 мин. Статическое ингаляционное воздействие продуктов пиролиза на животных трех групп: интоксикация, опыт 1 и опыт 2 – моделировали в герметичной камере объемом 0.1 м³, экспозиция – 15 мин. После окончания интоксикации животных извлекали из камеры, и они дышали атмосферным воздухом. Животных группы контроль помещали в ингаляционную камеру на 15 мин без воздействия продуктов пиролиза.

Качественное определение ПФИБ в газовоздушной смеси осуществляли методом газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (Agilent 7890B с масс-селективным детектором Agilent 240 ms, США). Содержание монооксида углерода и кислорода в ингаляционной камере определяли при помощи газоанализатора ДАХ-М (“Аналитприбор”, Россия).

В исследовании использовали фармакопейные ветеринарные препараты: ксилазин (Ксила, 2%, Interchemie Werken “de Adelaar” BV, Голландия) и золетил (Золетил 100, Virbac S.A., Франция).

Для индукции седации крысам и кроликам вводили ксилазин подкожно (в холку) в дозе 15 мг/кг, золетил – подкожно (в холку) в дозе 20 мг/кг. Первое введение препаратов осуществляли через 30 мин после воздействия. Для поддержания состояния седации ксилазин вводили повторно подкожно (в холку) в дозе 10 мг/кг трехкратно в течение 6 ч; золетил – повторно подкожно (в холку) в дозе 10 мг/кг трехкратно в течение 6 ч. Для обоих видов животных общая доза введенного ксилазина составила 45 мг/кг, золетила – 50 мг/кг. Животным групп К и И вводили подкожно (в холку) 0.9%-ный раствор NaCl в эквивалентном объеме с животными групп опыт 1 и опыт 2.

Определяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ) лабораторных животных групп: интоксикация, опыт 1 и опыт 2 – после воздействия продуктов пиролиза ФП-4. Для косвенной оценки содержания внесосудистой воды в легких определяли легочный коэффициент (ЛК) у крыс через 6 ч, у кроликов – через 3 ч после воздействия.

Артериальную кровь для исследования у крыс после вскрытия брюшной полости забирали в месте бифуркации брюшной аорты. У кроликов артериальную кровь забирали из центральной ушной артерии. Забор артериальной крови у крыс проводили через 6 ч после воздействия, у кроликов – через 3 ч после воздействия. Определяли индекс оксигенации (ИО = PaO₂/FiО₂) и показатели кислотно-основного состояния (pH, РаСО₂) артериальной крови при помощи прибора iSTAT (I-STAT Corporation, USA). Выбор сроков для исследования был обусловлен развитием наиболее выраженных нарушений функций дыхательной системы. Карбоксигемоглобин определяли спектрофотометрическим методом в венозной крови животных (полученной у крыс из хвостовой вены, у кроликов – из ушной вены) однократно непосредственно после окончания воздействия.

Легкие кроликов фиксировали 10%-ным раствором формалина, приготовленные гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином. При проведении световой микроскопии оценивали качественные изменения в тканях легких, осуществляли фоторегистрацию.

Статистический анализ результатов экспериментальных исследований проводили при помощи программы Statistica 10.0. К сравнению полученных данных, распределенных по закону, отличному от нормального, применяли непараметрические критерии Краскела–Уолиса и Ньюмана–Кейлса для множественных попарных сравнений. Данные в тексте представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей – Me [Q_н; Q_в]. Вывод о статистической значимости различий между группами принимали при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При проведении предварительных токсикологических исследований методом пробит-анализа Финни было установлено, что масса навески ФП-4, ингаляционное воздействие продуктов пиролиза которого вызывает гибель (в течение суток) 50% лабораторных животных (LD₅₀), составляет 2.6 ± 0.5 г. В дальнейшем крыс и кроликов подвергали интоксикации продуктами пиролиза ФП-4 в дозе LD₅₀ (масса навески ФП-4 – 2.6 г) и 1.5LD₅₀ (масса навески ФП-4 – 3.9 г).

При анализе газовоздушной смеси в ингаляционной камере методом газожидкостной хроматографии обнаруживали ПФИБ. Содержание монооксида углерода в камере составило 520 ± 70 ppm, кислорода – при одновременном нахождении в камере 6 крыс (или 3 кроликов) снижалось не более чем на 0.6–0.7 об. %.

Ингаляционное воздействие продуктов пиролиза не приводило к возникновению признаков раздражающего действия. Содержание карбоксигемоглобина в венозной крови у крыс составляло 21.3% [18.6; 24.1], у кроликов – 25.9% [23.3; 28.6]. Внешнее состояние животных группы И не отличалось от животных группы К. Тем не менее, за 30–40 мин до летального исхода у животных группы интоксикация выявляли снижение двигательной активности и изменение паттерна дыхания (увеличение частоты и снижение глубины дыхательных движений). За 3–5 мин до летального исхода возникали судороги и отделение пенистой жидкости из полости носа и рта. У животных групп опыт 1 и опыт 2 через 4–5 мин после введения исследуемых препаратов отмечали состояние седации (положение животного на животе, снижение частоты дыхательных движений), которое поддерживали после воздействия в течение 3–10 ч у кроликов и 8–11 ч – у крыс.

Введение животным ксилазина приводило к снижению СПЖ на 33% у крыс и на 29% у кроликов по сравнению с животными группы И (рис. 1). В то же время введение животным золетила способствовало увеличению СПЖ крыс в 2 раза (p < < 0.05) и кроликов в 2.5 раза, по сравнению с животными группы И после воздействии продуктов пиролиза ФП-4 в навеске, соответствующей 1.5LD₅₀ (рис. 1).

Рис. 1.

Средняя продолжительность жизни лабораторных животных после воздействия продуктов пиролиза ФП-4 в навеске, соответствующей 1.5LD₅₀ на фоне введения исследуемых препаратов. * – различия значимы по сравнению с группой И (p < 0.05). Группы: И – интоксикация, И + К – интоксикация + ксилазин (опыт 1), И + З – интоксикация + + золетил (опыт 2).

У крыс и кроликов при воздействии продуктов пиролиза ФП-4 в навесках, соответствующих LD₅₀ и 1.5LD₅₀, отмечали увеличение ЛК по сравнению с контрольными животными. Введение ксилазина крысам приводило к увеличению ЛК в 1.15 и 1.6 раза (p < 0.05) по сравнению с животными группы И при воздействии продуктов пиролиза в дозах LD₅₀ и 1.5LD₅₀ соответственно. У кроликов, подвергшихся воздействию продуктов пиролиза в дозе 1.5LD₅₀, введение ксилазина способствовало увеличению ЛК, по сравнению с животными группы И, в 1.8 раза (p > 0.05). Введение крысам золетила способствовало снижению ЛК в 1.2 раза (p > 0.05) и 1.5 раза (p < 0.05), по сравнению с животными группы И, при воздействии продуктов пиролиза в дозах LD₅₀ и 1.5LD₅₀ соответственно (рис. 2). У кроликов применение золетила также способствовало снижению ЛК в 1.5 раза (p > > 0.05), по сравнению с животными группы И, при этом значимых различий с животными группы К не прослежено (рис. 2).

Рис. 2.

Легочной коэффициент у крыс через 6 ч после воздействия и у кроликов через 3 ч после воздействия продуктов пиролиза ФП-4 на фоне введения исследуемых препаратов. * – различия значимы по сравнению с группой К (p < < 0.05); ^# – различия значимы по сравнению с группой И (p < 0.05).

С учетом того, что применение ксилазина у крыс и кроликов после интоксикации продуктами пиролиза ФП-4 приводило к снижению СПЖ и увеличению ЛК, в дальнейших исследованиях данный препарат не использовали.

В следующей серии экспериментов изучали влияние золетила на динамику показателей оксигенации и кислотно-основного состояния у крыс и кроликов на пике проявлений интоксикации продуктами пиролиза ФП-4 в дозе 1.5LD₅₀. Интоксикация крыс и кроликов продуктами пиролиза приводила к снижению ИО (p < 0.05), увеличению РаСО₂ (p < 0.05) и развитию декомпенсированного респираторного ацидоза (табл. 1). В то же время применение золетила у лабораторных животных способствовало нормализации оксигенации (значимое увеличение ИО) и компенсации респираторного ацидоза (снижение РаСО₂ и нормализация рН, по сравнению с группой И) в исследуемые сроки (табл. 1).

Для оценки изменений гистоархитектоники тканей легких кроликов, полученных через 3 ч после воздействия продуктов пиролиза ФП-4 в дозе 1.5LD₅₀, проводили гистологическое исследование.

На микропрепаратах легких кроликов группы К выявляли участки обычной воздушности паренхимы легких, чистые просветы бронхов, умеренное кровенаполнение легочных сосудов, отсутствие признаков альвеолярного и интерстициального отеков (рис. 3а). Интоксикация животных продуктами пиролиза ФП-4 приводила к выраженному нарушению гистоархитектоники паренхимы легких. Альвеолы и просветы бронхов были заполнены гомогенным транссудатом, содержащим нейтрофилы и эритроциты, межальвеолярные перегородки истончены (рис. 3б). Применение золетила снижало выраженность нарушений паренхимы легких. Отмечали утолщение межальвеолярных перегородок, повышение кровенаполнения легочных сосудов, просветы альвеол сохраняли нормальную воздушность с выходом единичных эритроцитов (рис. 3в).

Рис. 3.

Микропрепараты легких кроликов через 3 ч после интоксикации продуктами пиролиза ФП-4 в навеске, соответствующей 1.5LD₅₀, окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×200. (а) – контроль: участки обычной воздушности паренхимы легких, чистые просветы бронхов, умеренное кровенаполнение легочных сосудов, отсутствие признаков альвеолярного и интерстициального отеков; (б) – интоксикация: альвеолы, заполненные гомогенным транссудатом, содержащим нейтрофилы и эритроциты, истонченные межальвеолярные перегородки, просвет бронхов, заполненный транссудатом; (в) – опыт 2 (интоксикация + золетил): утолщение межальвеолярных перегородок, кровенаполнение легочных сосудов, просветы альвеолы нормальной воздушности с выходом единичных эритроцитов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ингаляционное воздействие продуктов пиролиза ФП-4, содержащих ПФИБ, на лабораторных животных разных видов (крысы и кролики) приводило к развитию ТОЛ, что подтверждалось увеличением ЛК (рис. 2) и появлением в тканях гистологических изменений, характерных для альвеолярной фазы отека легких (рис. 3). Механизм формирования ТОЛ, вызванного интоксикацией ПФИБ, связан с воздействием токсиканта на макромолекулы клеточных компонентов АГБ, что приводит к выбросу провоспалительных медиаторов и биологически активных веществ в системный кровоток (Zhang et al., 2017). Увеличение содержания подобных молекул в микроциркуляторном русле способствует спазму сосудов, увеличению периферического сосудистого сопротивления, нарастанию гидростатического давления в легочных капиллярах и, согласно закону Старлинга, выходу жидкости из системного кровотока в интерстициальное пространство легких. В случае недостаточности функционирования компенсаторных механизмов (дренажная функция лимфатической системы) происходит выход жидкости в альвеолярное пространство и манифестация отека легких (Гриппи, 2005).

В качестве подхода к коррекции ТОЛ у животных создавали состояние фармакологической седации. Эффективность седативной терапии сопряжена со снижением потребления кислорода организмом. В качестве седативных средств исследовали фармакопейные ветеринарные препараты: ксилазин и золетил.

Применение ксилазина приводит к незначительному снижению частоты сердечных сокращений и частоты дыхательных движений у лабораторных животных уже через 15–30 мин после введения, не вызывая при этом гипоксемии (Старокожева, Климов, 2017). Однако активация постсинаптических α₂-адренорецепторов гладкомышечных клеток кровеносных сосудов приводит к вазоконстрикции и возрастанию периферического сосудистого сопротивления в течение всего времени действия препарата (Корнюшенков, 2017; Vainio, Palmu, 1989). В случае развития ТОЛ дополнительное нарастание гидростатического давления в легочных сосудах приводит к большему выходу жидкости в интерстициальное пространство и к манифестации отека. По-видимому, с этим связано снижение СПЖ (рис. 1) и нарастание ЛК (рис. 2) у лабораторных животных на фоне проведения седативной терапии ксилазином.

Золетил в рекомендуемых дозировках не оказывает значимого влияния на показатели системной гемодинамики и функции дыхательной системы животных (Савенко и др., 2012; Корнюшенков, 2013). Применение золетила приводило к увеличению СПЖ крыс после интоксикации продуктами пиролиза ФП-4 (в навесках, соответствующих LD₅₀ и 1.5LD₅₀) (рис. 1), увеличению СПЖ кроликов после интоксикации продуктами пиролиза ФП-4 (в навеске, соответствующей 1.5LD₅₀) (рис. 1). У лабораторных животных, получавших золетил, отмечали значимое снижение ЛК (рис. 2) и менее выраженные гистологические изменения в тканях легких (рис. 3) в исследуемые сроки, по сравнению с животными группы И. Сохранение структуры АГБ способствовало поддержанию газообмена через альвеолярную–капиллярную мембрану, что подтверждалось у животных обоих видов на пике интоксикации увеличением ИО и снижением PaCO₂ в артериальной крови. Обнаруженный эффект золетила может быть связан с наличием в его составе тилетамина гидрохлорида, схожего по действию с кетамином (Корнюшенков, 2013).

Было выявлено (Busch et al., 2010), что применение кетамина в высоких дозировках (10 мг/кг) способствует снижению давления в легочной артерии после моделирования у животных гипоксии за счет снижения легочной гипоксической вазоконстрикции (Busch et al., 2010). Этот эффект может быть связан с действием высоких доз кетамина на кальциевые каналы L-типа, которые об-условливают вазодилатацию в сосудах легких (Kaye et al., 1998).

В данном исследовании крысам и кроликам вводили золетил в суммарной дозе 50 мг/кг. С учетом того, что содержание тилетамина гидрохлорида в препарате Золетил 100 составляет 25% (250 мг во флаконе), а тилетамина гидрохлорид химически близок к кетамину (Корнюшенков, 2013), животные получали аналог кетамина в дозе 12.5 мг/кг. Вероятно, протективный эффект золетила обусловлен купированием легочной вазоконстрикции у лабораторных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенного исследования было выявлено, что применение золетила приводило у двух видов лабораторных животных к коррекции токсического отека легких, вызванного интоксикацией перфторизобутиленом, полученным путем пиролиза фторопласта-4. Механизм протективного действия данного препарата, вероятно, связан со снижением давления в системе легочной микроциркуляции.

Дальнейший поиск фармакологических препаратов из группы фенциклидина может быть эффективным направлением фармакологической коррекции токсического отека легких, вызванного интоксикацией пульмонотоксикантами, обладающими ацилирующим действием.