Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2021, T. 63, № 1, стр. 34-43

ВВЕДЕНИЕ

Модификация эпоксидных композиций представляется одним из основных способов улучшения их свойств [1–5]. Ранее было показано [6, 7], что перспективными рекционноспособными модификаторами эпоксиаминных систем являются соли олигогексаметиленгуанидина (ОГМГ) и органических кислот. Они более гидрофобны, чем промышленно выпускаемый гидрохлорид олигогексаметиленгуанидина, и, вследствие этого, лучше растворимы в эпоксидных олигомерах. В свою очередь, улучшение растворимости позволяет снизить температуру начала реакции между эпоксидными олигомерами и ОГМГ, а также проводить ее в более мягких условиях, получая гомогенные растворы. Путем отверждения таких растворов алифатическим амином были сформированы однородные покрытия, поверхность которых подавляет дыхательную активность как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов [7].

Настоящая работа является продолжением этих исследований и посвящена расширению ассортимента солей ОГМГ для модификации эпоксидных олигомеров с целью создания эпоксиаминных покрытий, обладающих выраженной биоцидной активностью.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Базовыми объектами исследования выступали диановый эпоксидный олигомер Epikote 828 (“Hexion”, США) и олигооксипропилендиамин Jeffamine D-230 (“Hunstman”, США), структурные формулы и основные свойства которых приведены в работе [7]. Перед выполнением экспериментов диановый эпоксидный олигомер выдерживали в течение 3 ч при 60°С для удаления кристаллитов. Соли ОГМГ и органических кислот, использованные в работе, синтезировали из промышленно выпускаемого гидрохлорида ОГМГ (“Фарма-Покров”, Россия) со среднечисловой молекулярной массой M_n = 951 и средним числом разветвлений на молекулу 0.47 экв/моль (определено по методике [8]). ОГМГ-гидрохлорид (ОГМГ-Гх) представляет собой слаборазветвленный продукт поликонденсации гуанидина и гексаметилендиамина:

где R ≡ $ - \mathop {\text{C}}\limits^{\,{\text{I}}} {\kern 1pt} {{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\kern 1pt} - {\kern 1pt} \mathop {\text{C}}\limits^{\,{\text{II}}'} {\kern 1pt} {{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\kern 1pt} - {\kern 1pt} \mathop {\text{C}}\limits^{\,{\text{III}}'} {\kern 1pt} {{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\kern 1pt} - {\kern 1pt} {\text{N}}{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}$ или ; HА ≡ HCl

(римские цифры над атомами соответствуют условным обозначениям в расшифровках ЯМР-спектров раздела Результаты и их обсуждение).

Синтез органических солей ОГМГ (гидросалицилата, гидросульфосалицилата или гидро-4-аминосалицилата) вели из водного раствора ОГМГ-гидрохлорида и водорастворимой соли соответствующей органической кислоты. Загрузки компонентов для синтеза представлены в табл. 1. В соответствии с ними делали водный раствор ОГМГ-гидрохлорида и водный раствор калиевой соли органической кислоты. Раствор калиевой соли кислоты готовили из соответствующей кислоты и воды при добавлении небольшими порциями гидроксида калия и охлаждении раствора. Полученный раствор калиевой соли органической кислоты прибавляли из капельной воронки к раствору ОГМГ-гидрохлорида при интенсивном перемешивании. При внесении около половины раствора соли органической кислоты образовывалась вязкая масса, затрудняющая перемешивание. Далее к полученной смеси при нагревании ~85–90°С добавляли порциями по 50–100 мл этанола до полного растворения гидросалицилата, гидросульфосалицилата или гидроаминосалицилата ОГМГ. Затем смесь охлаждали и оставляли на ночь для полного отделения продукта. Маточник сливали, а олигомер сушили под вакуумом и измельчали. Высушенные продукты представляли собой желтоватые стекловидные порошки, интенсивность окраски которых зависела от степени измельчения.

Синтез аддуктов солей ОГМГ с эпоксидным олигомером вели в среде диметилсульфоксида. Для этого соль ОГМГ растворяли в ДМСО квалификации х.ч. с получением 50 мас. % раствора. Затем данный раствор смешивали с эпоксидным олигомером и проводили исследования методами ИК-спектроскопии или дифференциальной сканирующей калориметрии. Для получения модифицированных эпоксиаминных пленок смесь эпоксидного олигомера с раствором ОГМГ выдерживали при 22 ± 2°С в лабораторном реакторе с магнитной мешалкой в течение заданного времени.

Смеси для получения модифицированных эпоксиаминных пленок готовили на основе эпоксидного олигомера и(или) его аддукта с ОГМГ со стехиометрическим количеством отвердителя в расчете на остаточное содержание эпоксидных групп. Отверждение выполняли при постоянной температуре 22 ± 2°С в течение суток.

Исследования осуществляли методами спектроскопии ЯМР ¹Н, ЯМР ¹³С, ИК-фурье-спектроскопии и ДСК, а также определяли биологическую активность пленок, содержащих соли ОГМГ, по отношению к микобактериям.

Спектры ЯМР ¹Н растворов органических солей ОГМГ в ДМСО-d₆ регистрировали на ЯМР-фурье-спектрометре “DPX-300” (“Bruker”, Германия) со сверхпроводящим магнитом, рабочая частота 300 МГц. Спектры ЯМР ¹³С растворов органических солей ОГМГ в метаноле-d₄ или дейтерированной трифторуксусной кислоте регистрировали на рабочей частоте 70 МГц тем же спектрометром. С целью количественного анализа состава образцов ОГМГ их спектры получали в режиме Inverse Gate, при котором происходит полное широкополосное подавление взаимодействия ядер ¹³С с протонами и отсутствует ядерный эффект Оверхаузера. Для предотвращения релаксационных эффектов задавали задержку между импульсами 1.8 с. Число сканирований составляло 3199. При анализе спектров химические сдвиги сигналов приводили относительно внутреннего стандарта – метанола-d₄, диметилсульфоксида-d₆ или СF₃COOD.

ИК-спектры измеряли в режиме пропускания на фурье-спектрометре “Nicolet 6700” (“Thermo Fisher”, США) с разрешением 2 см^–1 и усреднением 128 сканирований в диапазоне волновых чисел 400–4000 см^–1 при 22 ± 2°С в воздушной атмосфере. Для этого из образцов формировали пленки на окнах из KBr.

Исследования солей ОГМГ, их аддуктов с эпоксидным олигомером и отвержденных систем методом ДСК проводили на приборе “DSC Q-100” (“TA Instruments”, США) в динамическом режиме при w⁺ = 10 К/мин в закрытых алюминиевых тиглях в атмосфере аргона.

Пленки на биологическую активность изучали по отношению к Mycobacterium smegmatis (“АТСС 607”), представляющих собой непатогенные микроорганизмы, сходные по структуре клеточной оболочки с Mycobacterium tuberculosis [9, 10]. Штамм M. smegmatis (“АТСС 607”) предварительно выращивали в соответствии с инструкцией “American Type Culture Collection” [11]. Для приготовления инокулята тест-микроорганизмы выращивали в течение 48 ч на жидкой среде Сабуро (Кс8) при 27°С. Затем переносили выращенные бактерии в колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл питательной среды Кс9 и 50 г стеклянных шариков, и выдерживали при 25–27°С в течение 5 суток при постоянном перемешивании. Далее помещали в стерильную пробирку 1.0 мл суспензии тест-микроорганизмов и исследуемый образец (эпоксиаминные пленки, модифицированные ОГМГ) размером 10 × 10 мм при температуре 27°С. Биологическую активность определяли как степень дезактивации живых клеток тест-микроорганизма в суспензии с модифицированным образцом, по отношению к контрольному образцу. Контролем служили суспензии тест-микроорганизма, содержащие образцы эпоксиаминной пленки того же размера без ОГМГ. Приведенная методика основана на методе разбавлений в среде Сабуро [12], но отличается от нее тем, что образцом является пленка с антимикробным компонентом, а не его раствор.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтезированные из гидрохлорида ОГМГ гидросалицилат, гидро-4-аминосалицилат и гидро-5-сульфосалицилат были очищены и охарактеризованы методом ЯМР. Типичные спектры ЯМР ¹Н исходного гидрохлорида ОГМГ (ОГМГ-Гх) и гидросалицилата ОГМГ (ОГМГ-Гс) с расшифровками приведены в работе [7], а спектры ЯМР ¹Н гидро-5-сульфосалицилата ОГМГ (ОГМГ-Гсс) и гидро-4-аминосалицилата ОГМГ (ОГМГ-Гас) представлены на рис. 1 и 2. На спектре ЯМР ¹Н ОГМГ-Гсс (300 МГц, ДМСО-d₆) (рис. 1) зарегистрированы следующие пики (δ, м.д., J, Гц): 1.28 (4Н, уш.с, СН₂ – I); 1.44 (4Н, уш.с, СН₂ – II); 3.11 (4Н, уш.с, СН₂ – III); 6.68 (1Н, д, Аr 4, J³ = 8.4); 7.50 (1Н, д, Аr 3, J³ = 8.4 + 4Н, уш.с, NH); 7. 89 (>1Н, уш.с, ОН); 8.08 (1Н, с, Аr 6); 15.07 (1Н, уш.с, 2ОН). По соотношению интегральных интенсивностей разрешенных сигналов алифатических (1.28 и 1.44 м.д., 8Н) и ароматических (6.68 м.д., 1Н) протонов рассчитана степень замещения на 5-сульфосалицилат в ОГМГ-Гсс, которая составляет не менее 89.7%. При учете всех ароматических протонов, что уменьшает ошибку измерения, но требует вычета гуанидиновых NH (сигналы 15.07 м.д. + (от 8.08 до 6.66 м.д.) – 4Н гуанидиновых NH, которые определяются как половина алифатических (1.28 и 1.44 м.д., 8Н)), степень замещения на 5-сульфосалицилат в ОГМГ-Гсс составляет не менее 92.4%, и это представляется более точным.

На спектре ЯМР ¹Н ОГМГ-Гас (300 МГц, ДМСО-d₆) рис. 2 зарегистрированы следующие пики (δ, м.д., J, Гц): 1.30 (4Н, уш.с, СН₂ – I); 1.47 (4Н, уш.с, СН₂ – II); 3.09 (4Н, уш.с, СН₂ – III); 5.22 (2Н, с, АrNH); 5.84 (1Н, с, Аr 3); 5.90 (1Н, д, Аr 5, J³ = 8.4); 7.36 (1Н, д, Аr 6, J³ = 8.3); 7.87 (>2Н, уш.с, гуанидин NH); 8.72 (1Н, уш.с, СООН); 14.65 (1Н, с, АrОН). По соотношению интегральных интенсивностей разрешенных сигналов алифатических (1.30 и 1.47 м.д., 8Н) к ароматическим (5.22, 5.84 и 5.90 м.д., 4Н) протонам рассчитана степень замещения на аминосалицилат в ОГМГ-Гас, которая составляет не менее 98.1%.

Типичные спектры ЯМР ¹³С исходного ОГМГ-Гх и синтезированного из него ОГМГ-Гс приведены в работе [7], ОГМГ-Гсс и ОГМГ-Гас показаны на рис. 3 и 4 соответственно. На спектре ЯМР ¹³С ОГМГ-Гсс (70 МГц, CF₃COOD) зарегистрированы следующие пики (δ, м.д.): 25.74 (2С, СН₂ – I); 26.78 (СН₂ – II'); 28. 02 (2С, СН₂ – II); 40.96 (СН₂ – III'); 41.59 (2С, СН₂ – III); 111.31 (1С, Аr 4); 118.49 (1С, Аr 5); 129.57 (1С, Аr 3); 130.09 (1С, Аr 6); 134.12 (1С, Аr 1); 154.38, 155.58, 156.56 (1С, гуанидин, IV'', IV', IV); 163.83 (1С, Аr 2); 172.86 (1С, АrСООН). По соотношению интегральных интенсивностей сигналов алифатических (27.38–42.50 м.д., 6С) к ароматическим (111.31–172.41 м.д., 7С) атомам углерода рассчитана степень замещения на салицилат в ОГМГ-Гcс, которая составляет не менее 97.4%.

На спектре ЯМР ¹³С ОГМГ-Гас (70 МГц, метанол-d₄) зарегистрированы следующие пики (δ, м.д.): 27.36 (2С, СН₂ – I); 28.64 (СН₂ – II'); 29.84 (2С, СН₂ – II); 40.78 (СН₂ – III'); 42.57 (2С, СН₂ – III); 101.62 (1С, Аr 4); 107.22 (1С, Аr 5); 109.72 (1С, Аr 3); 132.87 (1С, Аr 6); 154.35 (1С, Аr 1); 155.66, 157.47, 158.79 (1С, гуанидин, IV'', IV', IV); 177.26 (1С, Аr 2); 180.60 (1С, АrСООН). По соотношению интегральных интенсивностей сигналов алифатических (27.36– 42.57 м.д., 6С) к ароматическим (101.62–180.60 м.д., 7С) атомам углерода рассчитана степень замещения на аминосалицилат в ОГМГ-Гас, которая составляет не менее 95.1%.

По методике [8], разработанной ранее с участием авторов этой статьи, для образцов синтезированных солей ОГМГ с органическими кислотами на основании данных спектров ЯМР ¹³С были определены среднечисловая молекулярная масса M_n, содержание концевых гуанидиновых ([гуанидин]_конц) и гексаметилендиаминовых ([ГМДА]_конц) остатков, а также среднее количество разветвлений на молекулу ОГМГ (z). Результаты расчетов представлены в табл. 2. Из таблицы видно, что молекулярная масса полученных солей несколько выше, чем молекулярная масса исходного ОГМГ-Гх. Однако, судя по тому, что концентрация концевых групп и среднее число разветвлений на молекулу остаются примерно постоянными, а также учитывая мягкие условия синтеза, можно считать, что возрастание M_n происходит за счет потери низкомолекулярных фракций при очистке синтезированного образца путем переосаждения его в водно-этанольной смеси.

Ранее [7] методом ДСК было установлено, что химическое взаимодействие между органическими солями ОГМГ и эпоксидными олигомерами начинается при более низких значениях температуры, чем химическое взаимодействие эпоксидных олигомеров с гидрохлоридом ОГМГ. Исходя из этого, модификацию эпоксидного олигомера целесообразно проводить путем его предварительного взаимодействия с органической солью ОГМГ, с последующим отверждением полученного аддукта амином. В рамках работы [7] показано, что синтезированный ОГМГ-Гс лучше растворим в эпоксидном олигомере, однако для введения достаточного количества фрагментов ОГМГ в общую эпоксиаминную сетку следует получать аддукты в среде растворителя – диметилсульфоксида.

Важной характеристикой, определяющей склонность системы к гелеобразованию при модификации, является средняя функциональность солей ОГМГ в реакциях с эпоксидным олигомером. Оценить этот показатель можно исходя из стехиометрического соотношения ОГМГ: эпоксидный олигомер, с учетом того факта, что для Epikote 828  f_Э = 1.99 [13]. В свою очередь, экспериментально установить это соотношение можно из данных ДСК по наибольшему тепловому эффекту, соответствующему стехиометрическому составу. Такой подход описан, например, в работе [14]. Зависимость теплового эффекта реакции между ОГМГ и эпоксидным олигомером от соотношения этих компонентов на примере ОГМГ-Гс представлена на рис. 5. Видно, что стехиометрическое соотношение Epikote 828 : ОГМГ-Гс = = 75 : 25 мас. % Учитывая эпоксиэквивалентную массу М_Э = M_n/f_ЭП, равную 188.9, это соотношение олигомеров соответствует средней эквивалентной массе ОГМГ в реакции с эпоксидным олигомером M_экв = 62.7 г/экв. Учитывая, что для ОГМГ-Гс M_n = 1298 (табл. 2), можно оценить его среднюю функциональность как  f_{ОГМГ-Гс} = M_n/M_экв = = 20.7.

Напротив, исходя из структурной формулы ОГМГ и его молекулярно-массовых характеристик (табл. 2), можно оценить среднюю функциональность этого олигомера по конкретным реакционноспособным группам (табл. 3).

Учитывая заведомо более высокую реакционную способность концевых групп –NH₂ по сравнению с остальными, можно считать, что реакция эпоксидных групп эпоксидного олигомера протекает, прежде всего, с их участием. Однако значение общей экспериментально определенной функциональности ОГМГ в реакции с эпоксидным олигомером (20.7) указывает на высокую вероятность реакции как по –NН– фрагментам цепи, так и, по-видимому, по –С=NН.

Контроль протекания химического взаимодействия между эпоксидным олигомером и ОГМГ был проведен методом ИК-спектроскопии. Типичные ИК-фурье-спектры реагирующих растворов эпоксидного олигомера с ОГМГ в ДМСО представлены на рис. 6. Анализ спектров также позволяет сделать вывод об участии в химическом процессе групп –N–Н (валентные колебания в области 3200–3400 см^–1) и –C=NH (полоса 1682 см^–1). К сожалению, ИК-спектроскопия в представленном варианте не позволяет разделить вклад групп –NH₂, –NН– и –C=NH в обозначенные полосы и, таким образом, раздельно оценивать изменение концентрации этих групп при протекании химического процесса. Вместе с тем, ценную информацию о скорости химического процесса может дать хорошо разрешенная полоса поглощения эпоксидного цикла (деформационные колебания) при 960 см^–1 (рис. 6, вставка). По изменению интенсивности этой полосы относительно базовой линии во времени можно рассчитать степень превращения эпоксидных групп:

где I₀ и I_i – интенсивность полосы поглощения эпоксидной группы в начальный момент (t → 0) и в момент времени i.

Рассчитанная по этому выражению степень превращения закономерно возрастает со временем синтеза (рис. 7), однако в координатах кинетического уравнения псевдопервого порядка (рис. 7, вставка) можно выделить, по крайней мере, три участка с постоянной скоростью реакции. Весьма вероятно, что такая трехстадийность обусловлена преимущественным протеканием на каждой стадии различных химических реакций, связанных с разными реагирующими функциональными группами ОГМГ.

Согласно экспериментальным результатам (рис. 7), при 22 ± 2°С химическое взаимодействие ОГМГ и эпоксидного олигомера завершается примерно за сутки, причем для соотношения ОГМГ : эпоксидный олигомер = 25 : 75 мас. % предельно достигаемая степень превращения эпоксидных групп составляет ~90%. Следовательно, во избежание гелеобразования в процессе синтеза аддукта содержание ОГМГ в реакционной смеси с эпоксидным олигомером должно составлять как можно меньше, однако быть достаточным для проявления биоцидной активности в дальнейшем.

Продуктами синтеза при низком содержании ОГМГ по отношению к эпоксидному олигомеру являются вязкие прозрачные, слегка желтоватые аддукты, которые хорошо совмещаются и с исходным эпоксидным олигомером, и с аминным отвердителем. Некоторые из них были отверждены стехиометрическим количеством аминного отвердителя Jeffamine D-230 [7] с получением свободных эпоксиаминных пленок, ковалентно модифицированных 5 мас. % гидросалицилата, гидро-5-сульфосалицилата или гидро-4-аминосалицилата ОГМГ. По данным ДСК, температура стеклования всех этих пленок ниже 25°С, что указывает на эластифицирующий эффект ОГМГ.

Для полученных пленок была оценена биологическая активность по отношению к Mycobacterium smegmatis. Эти микобактерии представляют собой непатогенные и быстрорастущие микроорганизмы, что позволяет использовать их в качестве модели других микобактерий, в том числе Mycobacterium tuberculosis, являющихся возбудителями туберкулеза. На основании данных табл. 4 можно сделать вывод, что для эпоксиаминной пленки, модифицированной ОГМГ-Гс и ОГМГ-Гсс, активность по отношению к микобактериям в течение 4 суток падает достаточно быстро. Такое действие может быть связано как с особенностью M. smegmatis, обладающих специфической клеточной стенкой, так и с распределением в эпоксиаминной пленке фрагментов полимерной цепи модификатора ОГМГ. Более основательные выводы по результатам и причинам действия модифицированной ОГМГ эпоксиаминной пленки можно будет сделать после детальной характеристики образцов и количественной оценки их влияния на микроорганизмы.

В отличие от эпоксиаминной пленки, ковалентно модифицированной ОГМГ-Гс и ОГМГ-Гсс, ковалентная модификация ОГМГ-Гас обеспечивает практически полную дезактивацию M. smegmatis. Невысокая концентрация модификатора и его малая подвижность в эпоксиаминной сетке, по сравнению с раствором, указывают на ингибирование роста клеток, а не на бактерицидное действие поверхности пленки. Проявление бактериостатической активности, очевидно, связано с наличием в образце остатка 4-аминосалициловой кислоты, которая известна в качестве противотуберкулезного препарата. В этой связи, для M. smegmatis, очень близкой по строению клеточной стенки к Mycobacterium tuberculosis, вполне можно ожидать аналогичного действия. Кроме того, следует отметить, что соли 4-аминосалициловой кислоты обычно применяют в отношении активно размножающихся микобактерий туберкулеза [15] в комбинации с другими противотуберкулезными средствами первого ряда (например, стрептомицин, изониазид [16, 17]). Такое сочетание значительно тормозит развитие резистентности к активным веществам, а следовательно, повышает эффективность действия комбинированных препаратов.

Таким образом, предварительные результаты испытаний образцов свидетельствуют, что эпоксиаминные пленки, ковалентно модифицированные ОГМГ, могут приобретать биоцидные свойства не только из-за присутствия ОГМГ, но и остатка кислоты, которая образует с ним соль. Целенаправленный синтез подобных материалов следует проводить с учетом природы кислотного остатка и его распределения в полимерной матрице.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для повышения стойкости эпоксиаминных материалов к действию патогенных микроорганизмов в их состав был введен реакционноспособный модификатор – олигогексаметиленгуанидин. Для улучшения его растворимости в эпоксиаминных системах впервые получены, выделены и охарактеризованы его соли с салициловой, 5-сульфосалициловой и 4-аминосалициловой кислотами. Показано, что реакцию эпоксидных олигомеров с этими солями можно проводить при более низких значениях температуры, чем с исходным гидрохлоридом олигогексаметиленгуанидина. Определение оптимальных условий этой реакции позволило получить вязкотекучие аддукты эпоксидного олигомера и олигогексаметиленгуанидина, а после их отверждения олигооксипропилендиамином – эластичные пленки. Установлено, что наиболее выраженную активность по отношению к модельным микроорганизмам Mycobacterium smegmatis имеют пленки, модифицированные гидро-4-аминосалицилатом олигогексаметиленгуанидина.

Авторы выражают благодарность Е.К. Уродковой (ИФХЭ РАН) за содействие в измерении ИК-фурье-спектров, а также за возможность использования при проведении экспериментов оборудования ЦКП ИФХЭ РАН.

Работа выполнена по заданию Министерства науки и высшего образования РФ. Кроме того, авторы благодарят за финансовую поддержку Российский фонд фундаментальных исследований (проект 18-08-0125А).