1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Высокомолекулярные соединения (серия Б)
  4. T. 63, № 1, 2021

Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2021, T. 63, № 1, стр. 44-54

СОПОЛИМЕРЫ МЕТИЛАКРИЛАТА С ВИНИЛАЗОЛАМИ: СИНТЕЗ, ТЕРМОЛАБИЛЬНЫЕ СВОЙСТВА, ПРИВИВКА ПОЛИАМИННЫХ ЦЕПЕЙ

М. С. Стрелова a, *, Е. Н. Даниловцева a, В. В. Анненков a

a Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук
664033 Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3, Россия

* E-mail: mariya.strelova.96@mail.ru

Поступила в редакцию 22.04.2020
После доработки 13.07.2020
Принята к публикации 27.07.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Радикальной сополимеризацией получены новые сополимеры метилакрилата с 1-винилимидазолом, 1-винил-1,2,4-триазолом и 4-винил-1,2,3-триазолом. Определены константы сополимеризации для метилакрилата и 1-винилимидазола 0.83 ± 0.09 и 0.25 ± 0.02, для метилакрилата и 1-винил-1,2,4-триазола 1.0 ± 0.04 и 0.27 ± 0.01, для метилакрилата и (4-винил-1Н-1,2,3-триазолил)-метилпивалата 0.56 ± 0.03 и 2.90 ± 0.20 соответственно. Методами потенциометрического титрования и динамического рассеяния света изучено поведение сополимеров в водных средах и их термочувствительные свойства. Макромолекулы сополимеров в водных растворах находятся в виде крупных ассоциатов, доля которых увеличивается при нагревании, а в некоторых случаях наблюдается образование нерастворимой фазы. Показано, что сополимеры с привитыми олигопропиламинными фрагментами, содержащие звенья N-винилазолов, способны взаимодействовать с ДНК-олигонуклеотидом, стимулируя изучение их в качестве агентов доставки нуклеиновых кислот в живые клетки.

ВВЕДЕНИЕ

Стимул-чувствительные полимеры, способные значительно менять конформацию при небольших изменениях условий среды (pH, температура, свет, электромагнитное поле, присутствие солей и другое), привлекают внимание все бóльшее число исследователей из различных областей. Так, их можно использовать для создания мембран, нанореакторов, нанотрубок [1–4], а также в качестве компонентов систем доставки лекарственных препаратов [5–7], включая генную терапию. Органы, ткани и клетки организма имеют отличные значения pH и температуры, в том числе различен водородный показатель здоровых и раковых клеток [8]. Это позволяет применять pH- и термочувствительные полимеры для направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов.

Синтетические полиамины обладают pH-чувствительностью благодаря основным свойствам аминогрупп и выглядят привлекательными объектами в качестве агентов доставки нуклеиновых кислот, поскольку способны с последними образовывать комплексы посредством электростатических взаимодействий. Полиэтиленимин и его аналоги нашли применение как агенты трансфекции [9–11]. Вместе с тем, высокая основность аминогрупп (например, pK поливиниламина равна 9.6 [12]) придает весомый положительный заряд полимеру и может препятствовать высвобождению нуклеиновой кислоты в клетке. Кроме того, такие полимеры проявляют высокую цитотоксичность [13]. В связи с этим, вызывают интерес полимеры, содержащие группы с меньшей основностью, например азольные группы. Гомо- и сополимеры винилазолов являются гидрофильными, нетоксичными, способными к комплексообразованию и термически стабильными [14–17]. Меньшая чем у аминов основность азолов (pK поли-1-винилимидазола 5.6 [18]) позволяет регулировать заряд полимера в области физиологических значений pH. Полимеры, содержащие азольные группы (имидазол, триазолы), демонстрируют активность в захвате и высвобождении лекарственных препаратов [19–21]. Буферная емкость поли-1-винилимидазола превышает буферную емкость полиэтиленимина в кислой области, способствуя эндосомальному выходу в имидазолсодержащей системе [22].

Большинство исследований в области термолабильных полимеров выполнено с использованием замещенных акриламидов [23], хотя термочувствительность полимеру можно придать также введением гидрофобных звеньев, например метилакрилата (МА). При сополимеризации метил-акрилата с гидрофильными мономерами, такими как N-винилацетамид, N-винилпироллидон, метил-2-ацетамидакрилат и гидроксиэтилакрилат [24–28], образуются продукты, растворимость которых в воде увеличивается при уменьшении доли МА в сополимере. Нижняя критическая температура растворения сополимеров также повышается при уменьшении содержания МА, и для некоторых сополимеров находится в области физиологических значений температуры [26–28]. Преимуществом сополимеров МА является возможность модификации путем замещения в сложноэфирной группе.

В данной работе изучена сополимеризация метилакрилата с 1-винилимидазолом (ВИ), 1-винил-1,2,4-триазолом (N-ВТ) и 4-винил-1,2,3-триазолом (С-ВТ) в защищенной форме (4-винил-1H-1,2,3-триазол-1-ил)метилпивалата (С-ВТМП):

Такие мономеры, как ВИ и N-ВТ, можно назвать доступными, обычно используемыми для введения имидазольных и триазольных групп в полимеры. Звенья С-ВТ обладают свойствами очень слабой кислоты [29], ионизация которой происходит лишь в щелочной области.

В настоящей работе методами потенциометрического титрования и динамического светорассеяния исследовано поведение новых сополимеров в водных растворах. Показана способность сополимеров, модифицированных олигопропиламинными фрагментами, взаимодействовать с олигонуклеотидами.

ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали ВИ, МА и ДАК фирмы “Sigma-Aldrich”; N-ВТ и С-ВТМП получали по известным методикам [29, 30]. Мономеры очищали перегонкой при пониженном давлении, кроме С-ВТМП, который перекристаллизовывали из диоксана, ДАК – из этанола. Смесь олигопропиламинов (среднее число атомов N = 15.5) синтезировали по методике, описанной в работе [31]:

Растворители диоксан, ацетон, изопропанол, этанол и диэтиловый эфир очищали по стандартным методикам [32]. ДМФА встряхивали в течение 30 мин с безводным CuSO4, затем фильтровали и перегоняли в вакууме. N-метилпирролидон очищали вакуумной перегонкой. Применяли деионизованную воду (деионизатор “Водолей”, “Химэлектроника”). Уксусную кислоту, NaOH квалификации “х. ч.”, 0.1 и 1.0 моль/л растворы HCl готовили из стандарт-титров. NaOH предварительно очищали от примесей карбонатов фильтрованием 50%-ных водных растворов. Метилимидазольный буферный раствор с pH 7.4 готовили смешением раствора метилимидазола с 1.0 моль/л НСl. Раствор уксуснокислого натрия 50 мМ и 1.0 моль/л НСl смешивали для приготовления ацетатного буферного раствора с pH 5.5. В работе использовали флуоресцентный 21-мерный ДНК-олигонуклеотид GATCTCATCAGGGTACTCCTT-6-FAM (“Eurogen”, Россия) и препараты для электрофореза в агарозном геле (ООО “Диаэм”, Россия).

Сополимеры синтезировали радикальной сополимеризацией, инициированной ДАК (0.5% от массы мономеров), в ДМФА или этаноле при 60°С (табл. 1). Полученные сополимеры МА с N-ВТ выделяли осаждением в смесь ацетона и воды (в исходной смеси МА < 50%) или этанола и эфира (в исходной смеси МА > 50%), после чего сушили в вакууме. Сополимеры МА с ВИ высаживали в смесь гексана и ацетона, переосаждали из диоксана в эфир, сушили в вакууме. Сополимеры МА с С-ВТМП выделяли в дистиллированную воду, затем переосаждали из ацетона в эфир и сушили в вакууме. Снятие защитной группы проводили двукратным избытком NaOH в водно-этанольной среде при 40°C в течение 2 ч [29]. Полученные сополимеры поли(С-ВТ–со–МА) очищали диализом и сушили лиофильно.

Таблица 1.

Сополимеризация винилазолов с метилакрилатом

МА в мономерной смеси, мол. % Выход, % МА в сополимере, мол. % $\sigma _{{{\text{отн}}}}^{2}$ × 103 Mn × 10−3 Мw × 10−3
N-ВТ и МА
4.9 29.8 15.6 3.30 66 130
9.9 35.7 19.2 4.40 74 135
14.6 38.5 34.3 3.80 67 126
29.7 36.4 51.3 1.40 50 100
50.0 32.6 66.8 0.60 − −
69.9 32.1 79.0 0.50 − −
90.3 18.6 90.5 0.01 − −
С-ВТМП и МА
10.3 33.0 5.6 0.3 − −
28.8 26.6 14.0 20.0 − −
69.1 36.6 48.6 4.2 40 60
72.2 39.7 52.6 4.8 − −
76.5 43.4 63.5 4.8 75 100
81.4 44.2 67.0 3.6 60 80
90.2 64.4 83.8 2.7 70 90
ВИ и МА
10.0 54.9 18.7 − − −
10.0 35.6 30.9 4.4 110 170
29.7 38.6 39.5 1.3 120 210
42.8 27.8 53.6 0.2 − −
49.7 75.0 56.0 4.4 120 220
69.6 73.0 71.9 1.0 90 161
72.1 42.6 73.8 −* − −
87.8 49.5 87.3 −* − −
89.3 95.5 90.5 0.2 − −

* Расчет вблизи точки азеотропа оказался невозможен.

Для проведения модификации образцы сополимеров выдерживали со смесью синтетических олигопропиламинов в количестве 5 и 8% при 140°С в ампулах в атмосфере аргона в течение 10.5 ч в N-метилпирролидоне. Образцы выделяли осаждением в смесь эфира и этанола (для поли(N-ВТ–со–МА), поли(С-ВТ–со–МА)) или в эфир (поли(ВИ–со–МА)), промывали эфиром и сушили в вакууме до постоянной массы. Модифицированные сополимеры поли(С-ВТ–со–МА) и поли(ВИ–со–МА) дополнительно очищали диализом.

Состав сополимеров устанавливали методом спектроскопии ЯМР 1Н (ESM 1–3). Спектры ЯМР 1Н регистрировали на спектрометре DPX-400 фирмы “Bruker” (с рабочей частотой 400.13 МГц) в ацетоне-d6 (поли(С-ВТМП–со–МА)), ДМСО-d6 (поли(ВИ–со–МА) и поли(N-ВТ–со–МА)), D2O или CDCl3 (поли(N-ВТ–со–МА)). Соотношение звеньев винилазолов и МА в сополимерах определяли по отношению сигналов азольных циклов (7.0–8.5 м.д.) и метильной группы МА (3.4–3.7 м.д. [33]). При этом учитывали частичное перекрывание сигналов метильной группы с сигналами протонов СН основной цепи N-винилазолов в области 3–4 м.д. [29, 34, 35].

Степень прививки олигопропиламинных звеньев определяли по данным спектроскопии ЯМР 1Н (ESM 4) с добавлением к полимеру трифтор-уксусной кислоты для идентификации сигналов олигопропиламинной группы [36] (протоны при третичных атомах азота олигопропиламинной цепи 10.3–10.5 м.д.) (табл. 2).

Таблица 2.

Модификация сополимеров винилазолов с метилакрилатом

Винилазол Олигопропиламин, % Выход, % МА в сополимере, мол. % Олигопропиламин в сополимере, мол. %
ВИ 5 66.3 17.5 0.18
ВИ 8 47.6 20.7 0.48
С-ВТМП 8 66.3 5.6 1.53
N-ВТ 8 89.7 20.0 1.61
N-ВТ 8 86.5 19.2 0.58

ИК-спектры сополимеров записывали в таблетках с KBr на приборе “Infralum FT-801”.

Константы сополимеризации устанавливали при помощи интегрального метода [37, 38], модифицированного в работе [39]. Для каждой из систем расчет вели не менее чем по пяти точкам, используя данные при выходах сополимеров не более 60%. Композиционную неоднородность сополимеров характеризовали дисперсией σ$_{{{\text{отн}}}}^{2}$ состава сополимера, отнесенной к ее максимальной величине, полученной в предположении о сополимере как смеси двух гомополимеров [40].

Молекулярные массы сополимеров определяли методом ГПХ с применением жидкостного хроматографа “Милихром-А02” (колонка 2 × 75 мм, сорбент SRT-SEC 100). В качестве стандартов для сополимеров поли(ВИ–со–МА) использовали узкие фракции поливинилимидазола в кислой среде (10:90 = CH3OH:ТФУ в Н2О, рН 2.5), для пар сополимеров С-ВТ и МА, N-ВТ и МА – узкие фракции поливинилформамида в фосфатном буферном растворе (0.15 моль/л, рН 7.5).

Эксперименты по динамическому лазерному рассеянию света осуществляли на приборе “LAD-079”, сконструированном в Новосибирском Институте теплофизики (Россия). Растворы пропускали через фильтры с размером пор 0.45 мкм (Sartorius 16555-Q Minisart syringe filters). Измерения выполняли с использованием лазера с длиной волны 650 нм под углами 36°, 54°, 72°и 90°. (В работе также представлены данные, полученные при 54°, поскольку в этих условиях оказалось возможным получить качественную автокорреляционную функцию для растворов и дисперсий полимеров разной концентрации.)

Потенциометрическое титрование осуществляли на иономере “Мультитест ИПЛ-113”, концентрация полимеров составляла 1.5 мг/мл. Образцы поли(N-ВТ–со–МА) растворяли в 0.01 моль/л HCl, титровали 0.1 моль/л NaOH; поли(ВИ–со–МА) растворяли в воде с добавлением 0.1 моль/л HCl (1 : 1 по молям к звеньям винилимидазола), титровали 0.1 моль/л NaOH. Сополимеры поли(С-ВТ–со–МА) растворяли в воде с добавлением 0.1 моль/л NaOH (1.05 : 1.0 по молям к звеньям С-ВТ), титровали 0.1 моль/л HCl. При этом перед титрованием рН растворов образцов поли(С-ВТ–со–МА) доводили до 11.5, а растворов поли(N-ВТ–со–МА) и поли(ВИ–со–МА) до 2.5 добавлением 0.1 моль/л NaOH или HCl соответственно.

Взаимодействие между флуоресцентным 21-мерным ДНК-олигонуклеотидом GATCTCATCAGGGACTACTT-6-FAM и модифицированными сополимерами исследовали методом электрофореза в агарозном геле 1%, в трис-ацетатном ЭДТА-буфере с рН 7.4. Эксперименты выполняли с использованием электрофоретической ячейки “Mini-Sub” (7 × 10 см) “Cell GT System” (“Bio-Rad Laboratories, Inc.”), источник питания ELF-4 (“DNA-Technology LLC”), трансиллюминатор TCP-20LС (“Vilber Lourmat”), рабочая длина волны 254 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез сополимеров

При сополимеризации МА с ВИ образуются сополимеры светло-желтого цвета, растворимые в воде (при рН ниже 7) и ДМСО. Сополимеры N-ВТ и МА белого цвета, растворимы в диоксане, хлороформе, ДМСО и воде (в последнем случае при содержании МА в исходной смеси ≤29.7%). Сополимеры С-ВТМП и МА белого цвета, нерастворимы в воде и диэтиловом эфире. После снятия защитной группы сополимеры С-ВТ и МА растворяются в воде при pH выше 5.

В ИК-спектрах сополимеров присутствуют полосы колебаний CH и CH2 основной цепи (2950 см–1), область 2300–2900 см–1 соотносится с колебаниями связей NH [41, 42]. Наблюдаются характерные для МА полосы валентных колебаний связей С=О (1727 см–1), С–О (1165 см–1) (ESM 5). В спектрах сополимеров ВИ и МА к ним добавляются полосы, соответствующие валентным колебаниям имидазольного цикла (1500, 1415, 1228 см–1) [42]. Характеристические полосы азольного цикла в сополимерах N-ВТ и МА прослеживаются при 1500, 1194, 1000, 954, 870 см–1. В случае сополимеров С-ВТМП и МА регистрируются колебания азольного цикла (1533, 1450, 1440, 1116, 980, 830 см–1). После снятия защитной группы в спектрах этих сополимеров отсутствует полоса колебаний связи С–О (1225 см–1) и появляется полоса 1650 см–1, которую можно отнести к колебаниям молекул воды, ассоциированных с NH-триазольным циклом [29].

Выход сополимеров поли(С-ВТМП–со–МА) и поли(ВИ–со–МА) повышается при увеличении содержания МА в исходной смеси, в случае с сополимерами N-ВТ и МА содержание последнего в мономерной смеси 29.7% и выше приводит к снижению выхода сополимера. Большинство сополимеров МА с N-винилазолами (ВИ, N-ВТ) обогащены звеньями метилакрилата по сравнению с мономерной смесью, сополимеры МА и С-ВТМП, напротив, обеднены ими.

Рассчитанные на основании экспериментальных данных значения констант сополимеризации приведены в табл. 3. Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что в реакции с N-ВТ радикалы МА с одинаковой эффективностью реагируют как со своими радикалами, так и с радикалами N-ВТ, так как r1 = 1. Сополимеры МА с N-винилазолами обогащаются более активным мономером метилакрилата. В системе С-ВТМП и МА сополимеры обогащены звеньями С-ВТМП по сравнению с мономерной смесью, что характерно для случая r1 < 1, r2 > 1. Различия в реакционной способности N- и С-винилазолов связаны, вероятно, с особенностями взаимодействия винильной группы с соответствующими гетероциклами [43].

Таблица 3.

Константы сополимеризации винилазолов с метилакрилатом

М1–М2 r1 r2
МА–C-ВТМП 0.56 ± 0.03 2.90 ± 0.20
MA–N-ВТ 1.0 ± 0.04 0.27 ± 0.01
MA–ВИ 0.83 ± 0.09 0.25 ± 0.02

Эти соображения согласуются с параметрами микроструктуры сополимеров, рассчитанными на основании констант сополимеризации и исходных соотношений мономеров (рис. 1) [44]. При повышении содержания метилакрилата в мономерной смеси возрастает вероятность образования блоков МА–МА наряду с увеличением их средней длины, и, как следствие, доля звеньев МА в сополимерах с N-винилазолами тоже растет. Сополимеры МА с С-ВТ обогащены звеньями С-ВТ; в этом случае возрастает вероятность образования диад С-ВТ–С-ВТ.

Рис. 1.

Зависимости вероятности Р = 11 (1), 12 (2) и 22 (3) образования диад звеньев винилазола (М1) С-ВТМП (а), N-ВТ (б), ВИ (в) с МА (М2) от мольного содержания метилакрилата в исходной мономерной смеси. Расчет проведен для конверсии мономеров 20%.

Параметр σ$_{{{\text{отн}}}}^{2}$ (табл. 1), характеризующий композиционную неоднородность сополимеров [39], невысок, и только лишь в одном случае превышает 2% от максимально возможного.

Поведение сополимеров в водных растворах

Кислотно-основные свойства водорастворимых сополимеров изучены методом потенциометрического титрования в интервале рН 2.5–11.2. Титрование большинства сополимеров сопровождалось помутнением растворов и выпадением осадка (рис. 2).

Рис. 2.

Области помутнения растворов сополимеров поли(N-ВТ–со–МА) (а), поли(С-ВТМП–со–МА) (б) и поли(ВИ–со–МА) (в); Х – содержание МА в сополимере. Заштрихованные области соответствуют рН, при котором наблюдается выделение осадка.

Гомополимер С-ВТ нерастворим в воде до рН 9, что связано с образованием множественных водородных связей между триазольными звеньями [29]. Повышение рН приводит к частичной ионизации звеньев и растворимости полимера. При введении гидрофобных звеньев МА неожиданно увеличивается интервал растворимости полимера: сополимер растворяется при рН более 5.1 уже при наличии 5.6% звеньев метилакрилата. По-видимому, наличие звеньев МА препятствует образованию протяженных двутяжных участков, стабилизированных водородными связями. Исходя из расчетных данных (см. рис. 1), образец, содержащий 5.6% МА, имеет единичные звенья МА, что соответствует средней длине блоков С-ВТ, состоящих из восемнадцати звеньев. Вероятно, такая длина блока недостаточна для формирования прочной системы водородных связей, которая дополнительно ослабляется при приближении к нейтральной области рН за счет ионизации отдельных звеньев С-ВТ.

Сополимеры ВИ и МА, напротив, растворяются в кислой области pH, что может быть обусловлено свойствами ВИ как слабого основания. При повышении pH вследствие депротонирования звеньев ВИ уменьшается заряд макромолекул, что наряду с гидрофобным взаимодействием между звеньями МА приводит к осаждению полимера из раствора.

Сополимер N-ВТ и МА с содержанием последнего 51.3% растворим при pH < 2.7 и pH > 11.1. При низких значениях pH агрегация преодолевается положительным зарядом цепи. Растворение полимера при высоких значениях pH является следствием донорно-акцепторного взаимодействия π-системы азольного цикла с гидроксид-анионами, как описано в работе [18]. Сополимеры N-ВТ и МА с содержанием последнего менее 34.3% растворимы во всем исследованном интервале pH.

В растворах сополимеров возможны следующие кислотно-основные реакции:

Перегиб в щелочной области при титровании сополимеров, содержащих звенья С-ВТ, относят к полному исчерпанию натриевой формы триазольных звеньев [29]. В случае сополимеров ВИ точка перегиба соответствует полной нейтрализации сопряженной кислоты для звеньев ВИ. Таким образом, точка, соответствующая полной нейтрализации звеньев, была вычислена, исходя из состава сополимера. С использованием этих данных определена степень ионизации α [45], после чего значения рК были получены по уравнению Хассельбаха–Гендерсона [46]. Кривые потенциометрического титрования сополимеров N-ВТ мало отличались от кривых титрования воды из-за очень низкой основности триазольных звеньев (ESM 6).

Зависимость pK от α (рис. 3) для сополимеров ВИ и МА при содержании последнего 18.7 и 39.5% подобны поливинилазолу. При увеличении степени протонирования звеньев pK понижается, что обусловлено трудностью присоединения каждого последующего протона к положительно заряженной цепи. При увеличении доли МА в сополимерах N-винилазолов уменьшается наклон кривых, вследствие снижения электростатического эффекта между звеньями ВИ. При содержании МА до 56% кривые в области высоких значений α близки, что указывает на близкую основность имидазольных звеньев на начальной стадии протонирования. При низких степенях ионизации введение гидрофобных звеньев МА сначала понижает основность имидазольных звеньев, вероятно, за счет компактизации полимерных цепей и усиления электростатических эффектов. При содержании звеньев МА более 50% основность сополимеров при низких значениях α превышает величины для поливинилазола, что может быть связано с подавлением электростатических эффектов за счет разбавления звеньев ВИ неионогенными звеньями МА. В случае сополимеров С-ВТ и МА (рис. 4) вид кривых также свидетельствует о проявлении электростатических эффектов по мере ионизации полимера, причем повышение доли неионогенных звеньев МА также приводит к уменьшению наклона кривых за счет разбавления ионогенных звеньев С-ВТ. Введение 5.6% звеньев МА увеличивает кислотность триазольных звеньев при начале ионизации, возможно, из-за описанного выше нарушения системы водородных связей между звеньями С-ВТ.

Рис. 3.

Зависимость pK от α сополимеров поли(ВИ–со–МА); содержание МА в сополимере 0 (1), 18.7 (2), 39.5 (3), 56.0 (4), 71.9 (5) и 90.5 мол. % (6).

Рис. 4.

Зависимость рК от α сополимеров поли(С-ВТМП–со–МА); содержание МА в сополимере 0 (1), 5.6 (2), 48.6 (3), 67.1 (4) и 83.8 мол. % (5).

Термочувствительные свойства сополимеров

При введении гидрофобных звеньев МА в цепи поливинилазолов ожидается появление у водных растворов сополимеров термочувствительных свойств. Относительно быстрое (1–2 град/мин) нагревание водных растворов при концентрации сополимеров 2 и 4 мг/мл до 90°С не приводило к их помутнению даже в тех случаях, когда рН раствора отстояла от области помутнения (см. рис. 2) не более чем на 0.5 единицы. Размер частиц сополимеров в воде был изучен методом динамического рассеяния света при изменении температуры от 10 до 70°С и средней скорости нагревания 0.3 град/мин, что являлось достаточным для довольно медленной перестройки макромолекулярных цепей и ассоциатов в растворах исследуемых сополимеров (рис. 5). При этом в ряде случаев наблюдалось обратимое помутнение растворов.

Для большинства исследованных систем характерно бимодальное распределение частиц по размерам при комнатной температуре с наличием фракции размером 10–20 нм, которую можно отнести к индивидуальным макромолекулам. Также наблюдаются крупные частицы со средним гидродинамическим радиусом более 500 нм, представляющие собой ассоциаты макромолекул. При интерпретации результатов следует учитывать, что экспериментальные данные соответствуют интенсивности рассеяния, резко увеличивающейся с ростом радиуса частиц. Таким образом, в случае бимодального распределения частиц по размерам доля крупной фракции оказывается всегда завышенной.

Сополимер N-ВТ и МА, содержащий 51.3% последнего и растворимый только в кислой среде, проявляет термочувствительные свойства при рН 2, причем за 10–20°С до достижения температуры помутнения макромолекулы полностью переходят в состав крупных ассоциатов. Понижение концентрации полимера с 4.0 до 0.4 мг/мл повышает температуру помутнения с 43 до 60°С при аналогичном изменении размеров частиц. При рН 11, а также при меньшем содержании МА в сополимерах осаждение полимера из раствора при нагревании не происходит, но размер ассоциатов увеличивается.

Растворы сополимера С-ВТ и МА, содержащего 48.6% МА, не мутнеют при нагревании, но при 40–50°С четко определяются крупные ассоциаты со средним гидродинамическим радиусом выше 1000 нм и более мелкие ассоциаты размером 100–200 нм.

Сополимеры ВИ и МА были изучены при рН, близких к границе растворимости. При концентрации 4 мг/мл и 50°C прослеживалось образование осадка сополимеров с 30.9 и 39.5% МА; понижение концентрации до 0.4 мг/мл приводило к повышению температуры помутнения до 65°C для сополимера с 39.5% МА и отсутствию помутнения для сополимера с 30.9% МА. По данным светорассеяния происходит компактизация ассоциатов при нагревании. Сополимеры ВИ и МА в широком диапазоне составов были исследованы при рН 1, так как предполагалось возможное разрушение ассоциатов за счет протонирования звеньев ВИ. Ассоциаты радиусом ∼1000 нм прослеживались при всех значениях температуры, а при 50°C и выше их размер увеличивался.

Модификация сополимеров реакцией с олигопропиламинами

Модификация проведена путем реакции сложноэфирных звеньев с синтетической смесью олигопропиламинов. Представлена схема реакции модификации на примере сополимера ВИ и МА:

,

где yсред = 13.5.

Степень прививки, оцененная по спектрам ЯМР модифицированных сополимеров в присутствии трифторуксусной кислоты, составила от 0.18 до 1.61%. Кривая потенциометрического титрования модифицированного сополимера N-ВТ–МА (рис. 6) располагается существенно выше кривой исходного образца, не содержащего групп, протонируемых в нейтральной и слабокислой области. Помимо перегиба в кислой области, соответствующего нейтрализации всех аминогрупп цепей олигопропиламинов, наблюдается перегиб при нейтрализации 35% аминогрупп. Ранее было показано [47, 48], что электростатические эффекты при титровании полимерных электролитов целесообразно рассматривать в рамках пентад, когда на кислотно-основные свойства данного звена влияет состояние двух соседних звеньев с обеих сторон. Протонирование центральных звеньев пентад в цепях олигопропиламинов соответствует 33% аминогрупп, что совпадает с наблюдаемым перегибом, после которого происходит протонирование групп с более низкой основностью.

Рис. 5.

Зависимости среднего гидродинамического радиуса частиц сополимеров в водной среде от температуры: а, б – N-ВТ–51.3% МА, pH 2, 4.0 и 0.4 мг/мл соответственно; в – N-ВТ–51.3% МА, pH 11, 4 мг/мл; г – N-ВТ–34.3% МА, pH 7, 4 мг/мл; д – N-ВТ–34.3% МА, pH 11, 4 мг/мл; е – С-ВТ–48.6% МА, pH 7, 4 мг/мл; ж – С-ВТ–48.6% МА, pH 11, 4 мг/мл; з, и – ВИ–30.9% МА, pH 6.6, 4.0 и 0.4 мг/мл соответственно; к, л – ВИ–39.5% МА, pH 5.5, 4.0 и 0.4 мг/мл соответственно; м – ВИ–39.5% МА, pH 1.0. Площадь точек пропорциональна доле частиц (по интенсивности рассеяния).

Наличие в модифицированных сополимерах боковых полиаминных цепей, содержащих свыше десяти аминогрупп, позволяет ожидать их взаимодействия с полимерными анионами, например нуклеиновыми кислотами. Для проверки этого предположения было исследовано взаимодействие сополимеров с 21-мерным меченным ДНК-олигонуклеотидом GATCTCATCAGGGACTACTT-6-FAM методом электрофореза в агарозном геле (рис. 7). В качестве стандарта (дорожка 1) использован олигонуклеотид без добавления полимера. В процессе электрофореза он передвигается к положительно заряженному электроду. Полимеры на основе N-ВТ (дорожки 2, 3) и ВИ (дорожки 5, 6) демонстрируют хорошее связывание олигонуклеотида. Полимер на основе С-ВТ (дорожка 4) плохо связывается с олигонуклеотидом, вероятно, из-за слабой кислотности звеньев С-ВТ, которая блокирует аминогруппы в полимере и препятствует их взаимодействию с олигонуклеотидом.

Рис. 6.

Титрование раствора сополимера N-ВТ–19.2% МА (1) и продукта его модификации (2) реакцией с олигопропиламином. Масса сополимера 0.1 г, объем раствора 50 мл, содержание титранта 0.1 моль/л HCl.

Рис. 7.

Результаты гель-электрофореза комплексов модифицированных сополимеров с 21-мерным ДНК-олигонуклеотидом. Дорожки: 1 – стандарт (без сополимера); 2, 3 – N-ВТ–МА с содержанием МА 20.0 и 19.2% соответственно; 4 – С-ВТ–МА с содержанием МА 5.6%; 5, 6 – ВИ–МА с содержанием МА 17.5 и 20.7%. Концентрация ДНК 10 мкм, сополимеров 4 мг/мл; соотношение объема растворов ДНК : : сополимера = 1 : 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе изучена сополимеризация метилакрилата с винилазолами: 1-винилмидазолом, 1-винил-1,2,4-триазолом и 4-винил-1,2,3-триазолом в защищенной форме. Определены константы сополимеризации для каждой из трех систем. Показано, что увеличение содержания метилакрилата в сополимерах с N-винилазолами уменьшает интервал растворимости сополимеров в воде, а в сополимерах с С-винилтриазолом, напротив, увеличивает. Поведение сополимеров в водных растворах исследовано методами потенциометрического титрования и динамического рассеяния света. Модифицированные путем прививки олигопропиламинных фрагментов сополимеры демонстрируют способность к взаимодействию с ДНК-олигонуклеотидом. Все это вызывает огромный интерес для дальнейшего изучения возможностей применения данных сополимеров в области генной инженерии для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России и Российской академии наук (код проекта АААА-А19-119100490016-4).

Авторы выражают благодарность Центру коллективного пользования “Ультрамикроанализ” за предоставленное оборудование.

Список литературы

  1. Tan S., Saito K., Hearn M.T. // Curr. Opin. Biotechnol. 2018. V. 53. P. 209.

  2. Lu C., Urban M.W. // Prog. Polym. Sci. 2018. V. 78. P. 24.

  3. Xu J., Zhu P., Wang Y., Zhang K.-L. // Inorg. Chim. Acta 2019. V. 503. https://doi.org/10.1016/j.ica.2019.119376

  4. Xian Y., Shui Y., Li M., Pei C., Zhang Q., Yao Y. // J. Appl. Polym. Sci. 2020. V. 137. № 35. https://doi.org/10.1002/app.49032

  5. Fu X., Hosta-Rigau L., Chandrawati R., Cui J. // Chem: Cell Press. 2018. V. 4. № 9. P. 2084.

  6. Sponchioni M., Palmiero U.C., Moscatelli D. // Mater. Sci. Eng. C. 2019. V. 102. P. 589.

  7. Koochaki A., Moghbeli M.R., Nikkhah S.J., Ianiro A., Tuinier R. // RSC Adv. 2020. V. 10. № 6. P. 3233.

  8. Shirmanova M.V., Druzhkova I.N., Lukina M.M., Matlashov M.E., Belousov V.V., Snopova L.B., Prodanetz N., Dudenkova V.V., Lukyanov S.A., Zagaynova E.V. // Biochim. Biophys. Acta. 2015. V. 1850. № 9. P. 1905.

  9. Boussif O., Lezoualc F., Zanta M.A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix B., Behr J.-P. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. V. 92. P. 7297.

  10. Chen M., Tang Y., Wang T., Long Q., Zeng Z., Chen H., Feng X. // Mater. Sci. Eng. C. 2016. V. 69. P. 1367.

  11. Wang X., Niu D., Hu C., Li P. // Curr. Pharm. Des. 2015. V. 21. P. 6140.

  12. Katchalsky A., Mazur J., Spitnik P. // J. Polym. Sci. 1957. V. 23. № 104. P. 513.

  13. Fischer D., Li Y., Ahlemeyer B., Krieglstein J., Kissel T. // Biomaterials. 2003. V. 24. № 7. P. 1121.

  14. Ermakova T.G., Kuznetsova N.P., Maksimov K.A. // Russ. J. Appl. Chem. 2003. V. 76. № 12. P. 1971.

  15. Kizhnyaev V.N., Pokatilov F.A., Vereshchagin L.I. // Polymer Science C. 2008. V. 50. № 7. P. 1.

  16. Kurik M.V., Myachina G.F., Ermakova T.G. // Mol. Cryst. Liq. Cryst. 2007. V. 468. P. 669.

  17. Kizhnyaev V.N., Petrova T.L., Pokatilov F.A., Zhitov R.G., Edel’shtein O.A. // Polymer Science B. 2014. V. 56. № 5. P. 490.

  18. Mazyar N.L., Annenkov V.V., Kruglova V.A., Ananiev S.M., Danilotseva E.N., Rokhin A.V., Zinchenko S.V. // Russ. Chem. Bull. 2000. V. 49. № 12. P. 2013.

  19. Bayramgil N.P. // Colloids Surf. B. 2012. V. 97. P. 182.

  20. Kandasamy G., Danilovtseva E.N., Annenkov V.V., Krishnan U.M. // Beilstein J. Nanotechnol. 2020. V. 11. P. 354.

  21. Annenkov V.V., Krishnan U.M., Pal’shin V.A., Zelinskiy S.N., Kandasamy G., Danilovtseva E.N. // Chinese J. Polym. Sci. 2018. V. 36. № 10. P. 1114.

  22. Danilovtseva E.N., Krishnan U.M., Pal’shin V.A., Annenkov V.V. // Chinese J. Polym. Sci. 2019. V. 37. P. 637.

  23. Aseyev V., Tenhu H., Winnik F.M. // Adv. Polym. Sci. 2011. V. 242. P. 29.

  24. Mori T., Fukuda Y., Okamura H., Minagawa K., Masuda S., Tanaka M. // J. Polym. Sci. Polym. Chem. 2004. V. 42. P. 2651.

  25. Peng X., Zhang Y., Fehg W., Ai L.-M., Zhang F. // J. Mol. Struct. 2013. V. 1041. P. 139.

  26. Мун Г.А., Уркимбаева П.И., Примбетова М.Б., Бакытбеков Р.Б., Шайхутдинова А., Елигбаева Г.Ж. // Изв. науч.-технич. об-ва ”КАХАК”. 2012. № 2. С. 36.

  27. Okamura H., Masuda S., Minagawa K., Mori T., Tanaka M. // Eur. Polym. J. 2008. V. 38. P. 639.

  28. Мун Г.А. Пат. 19953 Казахстан. 2008.

  29. Danilovtseva E.N., Chafeev M.A., Annenkov V.V. // J. Polym. Sci. Polym. Chem. 2012. V. 50. P. 1539.

  30. Hopff H., Lippay M. // Macromol. Chem. 1963. V. 66. P. 157.

  31. Annenkov V.V., Zelinskiy S.N., Danilovtseva E.N., Perry C.C. // Arkivoc. 2009. V. 13. P. 116.

  32. Кейл Б. Лабораторная техника органической химии / Пер. с чешск. В.А. Вавера под ред. Л.Д. Бергельсона. М.: Мир, 1966.

  33. Kubotera A., Saito R. // Polym. J. 2016. V. 48. № 5. P. 611.

  34. Mori H., Ishikawa K., Abiko Y., Nakabayashi K., Onuma A., Morishima M. // Polymer. 2013. V. 54. № 8. P. 2001.

  35. Talu M., Demiroğlu E.U., Yurdakul Ş., Badoğlu S. // Spectrochim. Acta. A. 2015. V. 134. P. 267.

  36. Liu Q., Zhu M. // Polym. Test. 2016. V. 56. P. 174.

  37. Annenkov V.V., Lebedeva O.V., Danilovtseva E.N., Mikhaleva A.I. // Polymer Science B. 2001. V. 43. № 9–10. P. 247.

  38. Kuo J.-F., Chen C.-Y. // J. Appl. Polym. Sci. 1980. V. 26. P. 1117.

  39. Езриелев А.И., Брохина Э.Л., Роскин Е.С. // Высокомолек. соед. А. 1969. Т. 11. № 8. С. 1670.

  40. Лачинов М.Б., Черникова Е.В. Методические разработки к практическим работам по синтезу полимеров / Под ред. В.П. Шибаева. М.: МГУ, 2002.

  41. Круглова В.А., Кижняев В.Н., Иванова Н.А., Верещагин Л.И. // Высокомолек. соед. Б. 1987. Т. 29. № 6. С. 416.

  42. Lippert J.L., Robertson J.A., Havens J.R., Tan J.S. // Macromolecules. 1985. V. 18. P. 63.

  43. Круглова В.А., Анненков В.В., Ратовский Г.В., Шиверновская О.А. // Высокомолек. соед. Б. 1988. Т. 30. № 3. С. 233.

  44. Зильберман Е.Н. // Высокомолек. соед. Б. 1979. Т. 21. № 1. С. 33.

  45. Strauss U.P., Barbieri U.P., Wong G. // J. Phys. Chem. 1979. V. 83. P. 2840.

  46. Hasselbalch K.A. // Biochemische Z. 1917. V. 78. P. 112.

  47. Вайнштейн Э.Ф., Берлин А.А., Энтелис С.Г. // Высокомолек. соед. Б. 1975. Т. 17. № 11. С. 835.

  48. Annenkov V.V., Kruglova V.A., Mazyar N.L. // J. Polym Sci. Polym. Phys. 1998. V. 36. P. 931.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Высокомолекулярные соединения (серия Б)

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал